摘要
背景
关于免疫细胞亚群与亚临床冠状动脉疾病纵向变化关联的数据有限。
方法
在多族裔动脉粥样硬化研究(MESA)中，我们采用病例-队列方法，探索了基线(2000-2002年)测量的28种免疫细胞亚群与冠状动脉钙化(CAC)纵向变化的关联。对于基线CAC为0的参与者，我们使用多变量调整的Cox回归分析了从检查2(2002-2004年)到检查5(2010-2012年)的CAC新发情况。对于基线CAC>0的参与者，我们使用多变量调整的线性混合模型分析了到检查5的CAC变化。由于尚无研究调查免疫细胞与纵向CAC变化的关系，分析被视为探索性的，以P<0.05作为可能具有显著性的阈值。
结果
在基线具有免疫细胞亚群和CAC测量值的975名参与者中，378名基线CAC为0(平均年龄58.4岁；37.0%为男性)，597名基线CAC>0(平均年龄65.7岁；57.6%为男性)。自然杀伤细胞与CAC新发风险增加相关(风险比[HR]，自然杀伤细胞比例每增加1个标准差，HR为1.26；P=0.03)，而T辅助细胞与CAC新发风险降低相关(HR，0.81；P=0.04)。B细胞与CAC进展相关(β=53.1 Agatston单位，B细胞比例每增加1个标准差；P=0.04)，而CD14+CD16+单核细胞(β=-71.6；P=0.03)和调节性T细胞(β=-61.9；P=0.03)与CAC进展减缓相关。
结论
除其他发现外，自然杀伤细胞可能与CAC新发相关，而调节性T细胞可能与CAC进展减缓相关。这些发现值得进一步验证和实验研究。
非标准缩写和专有名词
CAC 冠状动脉钙化
MESA 多族裔动脉粥样硬化研究
Treg 调节性T细胞
研究视角
新发现是什么？
• 在一项大规模基于人群的队列研究中，我们系统评估了大量参与者的免疫细胞表型，首次观察到基线测量的某些免疫细胞亚群可能与冠状动脉钙化进展纵向相关。
• 自然杀伤细胞可能与冠状动脉钙化进展增加相关，而调节性T细胞可能与冠状动脉钙化进展减缓相关。
下一步应解决什么问题？
• 虽然这些数据为系统性免疫表型与钙化冠状动脉斑块之间潜在关系提供了重要的初始观察数据，但下一步重要工作包括因果实验验证，以及在大规模人类队列中确定这些血液免疫细胞印记如何与斑块免疫表型相关。
冠状动脉钙化(CAC)是亚临床动脉硬化的测量指标，与冠状动脉事件密切相关。然而，尽管数十年的数据将炎症与冠状动脉疾病(包括亚临床和临床)联系起来，但关于炎症的免疫细胞效应物与冠状动脉斑块之间关系的大规模人类数据很少。我们先前观察到，在MESA(多族裔动脉粥样硬化研究)中，非经典单核细胞与颈总动脉内膜中层厚度进展呈正相关(而经典单核细胞呈负相关)，中间单核细胞与MESA中的卒中发生相关。单核细胞亚群以及其他免疫细胞亚群是否与CAC发生和进展存在类似关联在很大程度上是未知的。因此，我们探索了在MESA检查1(2000-2002年)测量的免疫细胞亚群与11年内的CAC发生和进展的关联。缺乏具有平行多参数流式细胞术和序列CAC测量数据的其他队列，使我们无法在其他队列中复制这些探索性分析。
方法
支持本研究发现的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。我们的两个主要终点是：(1)基线CAC=0且具有免疫细胞亚群测量值的参与者(N=378)中进展至非0 CAC的发生率；(2)基线CAC非0且具有免疫细胞亚群测量值的个体(N=597)的CAC随时间进展。关于MESA的设计和目标、MESA中免疫细胞的测量(检查1，2000-2002年)以及MESA中CAC的测量的详细信息先前已有详细描述。我们的分析使用了MESA中关于免疫细胞和心血管风险的研究数据，其中流式细胞术方法已有详细描述。简而言之，使用在MESA检查1期间分离的冷冻保存外周血单个核细胞测量免疫细胞。冷冻血液样本于2016年在佛蒙特大学进行检测，以表型分析淋巴细胞和单核细胞亚群。髓系和淋巴系细胞是从MESA基线的冷冻保存(-135°C)样本中测量的，解冻后使用多色流式细胞术和细胞内细胞因子激活染色。流式细胞术门控策略和本研究的免疫表型数据源自2016年进行的相同分析，其中方法(包括抗体和门控策略)已有详细描述。细胞表型数据以比例而非绝对数量呈现，因为冷冻保存可能导致某些亚群的绝对水平与全血不同，尽管预期细胞比例在整体谱系内的相对水平保持一致。此外，在MESA中，基线冷冻保存细胞的分布(2016年解冻后测量)与2005-2007年(检查4)新鲜分析的全血样本平行。总体而言，共分析了28种不同的免疫细胞亚群。由于这些是探索性分析，我们使用α=0.05。
包括所有心肌梗死和心绞痛病例以及具有2个可用冷冻保存血样瓶的病例的病例-队列设计需要在我们的统计模型中使用抽样权重，通过加权确保代表整个MESA队列。CAC在检查1测量，并在检查2(2002-2004年)、检查3(2004-2005年)、检查4(2005-2007年)和检查5(2010-2012年)再次测量。所有参与者均提供知情同意，MESA的研究方案获得各站点机构审查委员会的批准。
鉴于缺乏关于免疫细胞亚群和CAC纵向变化的现有规范数据，以及我们有限的样本量，我们考虑所有分析均为探索性，P<0.05表示可能具有统计学意义。我们还应用了Bonferroni校正，P<0.0017(0.05/28)，此时P<0.0017的发现被视为具有更高置信度的显著性。最小调整模型(模型0)调整了年龄、性别、种族和民族以及地点。我们的主要模型(模型1)还额外调整了基线教育(≥12年级，二分变量)、吸烟(当前、从不、以前)、收缩压(连续)、体重指数(连续)、糖尿病诊断(二分)、总胆固醇(连续)、高密度脂蛋白(连续)、他汀类药物使用(二分)和高血压药物使用(二分)，均在检查1测量。我们使用具有稳健标准误差的加权Cox回归来模拟基线无CAC人群中CAC新发的风险。如上所述，权重的构建是为了确保样本代表整个MESA队列。在任何分析中，使用我们的主要模型(模型1)和0.05显著性水平，比例风险假设均未被违反。参与者被随访至检查2至5中首次非0 CAC的时间，随访丢失或随访结束于检查5时进行审查。在检查1 CAC非0的参与者中，我们使用具有随机截距的加权线性混合效应模型对CAC进行建模。为每个免疫细胞亚群创建单独的模型，因为我们旨在研究每个免疫细胞亚群与结果的关联，而不控制其他亚群，因为它们之间存在复杂关系，某些亚群本质上相互关联。例如，在某些情况下，细胞测量代表同一总体细胞组的子集的不同水平(例如，CD4+CD28-CD57+ T细胞作为CD4+ T细胞比例是CD4+CD57+ T细胞作为CD4+ T细胞比例的子集)。此外，3种单核细胞亚群是互斥的，因此百分比(作为单核细胞总数的比例)通常加起来为100%，因此1种亚群比例较低意味着其他亚群比例较高。鉴于先前关于单核细胞与颈动脉粥样硬化关联的性别交互作用的发现，我们还进行了免疫细胞群体与性别的交互作用分析，并在观察到显著交互作用时进行了额外的性别分层二次分析。
结果
基线具有和不具有基线CAC的MESA参与者的总体特征，以及具有免疫细胞基线数据因此被包括在本分析中的MESA参与者，包含在表1中。免疫细胞测量的描述和样本中免疫细胞比例的分布包含在表S1中。基线CAC=0且在检查1测量了免疫细胞亚群的MESA参与者(N=378)与检查1基线CAC=0的整个MESA队列(N=3116)的人口统计学和临床特征相似。同样，检查1 CAC>0且在检查1有免疫细胞亚群可用的MESA参与者(N=597)的人口统计学和临床特征与检查1 CAC>0的整个MESA人群(N=2952)相似。
对于基线CAC=0的参与者中的CAC新发分析，从检查1到检查5的最大随访时间为11.1年，CAC新发的中位时间(可能从检查2到检查5的任何时间)为4.8(四分位距，2.99-9.35)年。在CAC新发分析中(表2)，单核细胞亚群均未与CAC新发相关。自然杀伤(NK)细胞(CD3-CD16+CD56+)与CAC新发相关(多变量调整比值比[OR]，1.26[95% CI，1.03-1.56])，而T辅助型细胞(OR，0.80[95% CI，0.64-0.99])与CAC新发呈负相关；这些关联在探索性分析中具有边缘统计学意义(P<0.05)，但未达到Bonferroni校正的P<0.0017。存在显著的性别交互作用(表S2)，促使进行性别分层二次分析(表3，图1)。这表明NK细胞与男性CAC新发相关(OR，1.56[95% CI，1.14-2.13])，但与女性无关(OR，1.21[95% CI，0.86-1.70])。此外，CD4+CD25+ T细胞与男性CAC新发相关(OR，2.00[95% CI，1.25-3.19])，但与女性无关(OR，0.89[95% CI，0.69-1.15])。
在基线免疫细胞与纵向CAC进展分析中(表4，图2)，几个发现的探索性P<0.05具有边缘显著性，但未达到Bonferroni校正的P<0.0017显著性阈值。中间单核细胞与CAC进展呈负相关(β=-71.58 Agatston单位/中间单核细胞比例每增加1个标准差[95% CI，-134.9至-8.3]；P=0.027)。调节性T细胞(Tregs)也与CAC进展呈负相关(β=-61.9[95% CI，-119.1至-4.8]；P=0.034)。同时，B细胞与CAC进展呈正相关(β=53.1[95% CI，2.01-104.2]；P=0.042)。在CAC进展分析中未观察到显著的性别交互作用。
讨论
我们在一项大规模、多中心纵向队列研究中，首次调查了多种定义的免疫细胞亚群与10多年内5次重复检查中CAC纵向变化的关联。我们观察到NK细胞(CD3-CD16+CD56+)可能与CAC新发呈正相关，而T辅助型细胞可能与CAC新发呈负相关。存在显著的性别交互作用，NK细胞与男性CAC新发相关但与女性无关，CD4+CD25+ T细胞与男性CAC新发相关但与女性无关。NK细胞每标准差CAC新发的风险比为1.26，对应于NK细胞比例每增加1个标准差，CAC新发风险相对增加26%；这种每预测因子标准差的关联效应大小高于C反应蛋白与CAC的关系，与C反应蛋白与心血管事件和死亡的关系相当。在检查1 CAC非0个体的纵向CAC进展分析中，中间单核细胞与已有CAC个体的CAC进展随时间呈负相关，而非经典和经典单核细胞与CAC发生或进展无关。Tregs与CAC进展呈负相关，而B细胞与CAC进展呈正相关。重要的是，所有分析均被视为探索性，P<0.05表示可能具有显著性。这是由于缺乏关于外周免疫表型和CAC纵向变化的现有数据，无法为更多细胞亚群特异性预先指定的假设提供信息，以及我们的样本大小和个体间免疫表型的自然变异。这些因素可能导致置信区间相对较宽，结果不如大样本时稳定；然而，该队列的独特之处在于拥有通过高参数流式细胞术严格表型分析的冷冻保存细胞，以及同一人群超过十年的序列CAC数据。尽管我们的主要发现具有生物学合理性，但鉴于在探索性P<0.05而非Bonferroni校正的显著性阈值P<0.0017下具有显著性，应谨慎解释。
尽管分析具有探索性，但有两个主要发现因其与先前文献的一致性和可能的生物学合理性而值得注意。这些是NK细胞与CAC新发的关联以及Tregs与CAC进展的负相关。尽管将NK细胞激活和信号传导与促动脉粥样硬化联系起来的大部分数据来自实验(主要是小鼠)模型，但人类血液和斑块样本的小规模研究已证实，循环NK细胞与动脉粥样硬化严重程度相关，斑块内NK细胞-巨噬细胞相互作用可能促进斑块不稳定。我们观察到的NK细胞与CAC新发关联的性别差异很有趣，并且鉴于NK细胞数量和功能性别差异的最新实验发现，具有提出假设的意义。CD4+CD25+CD127- Tregs与CAC进展的负相关同样合理：Tregs已被认为参与动脉粥样硬化中的炎症调节和自我耐受，而最近的数据表明它们转化为炎症性ex-Tregs可能破坏自我耐受，从而增加炎症和斑块不稳定。我们的发现因此为Tregs在动脉粥样硬化保护中假设作用提供了大规模人类数据相关推论，提出了在明显临床疾病发生前循环Tregs可能在人类动脉粥样硬化保护中发挥作用的可能性。有趣的是，更广泛的CD4+CD25+亚群(代表活化和调节性CD4+ T细胞的组合)在与CAC新发的关联中表现出性别差异，这些细胞与男性CAC新发强烈相关，而在女性中未观察到正相关。这突显了与T细胞功能和动脉粥样硬化相关的潜在有趣性别特异性差异，值得进一步探索，特别是分析这一更广泛CD4+CD25+ T细胞亚群内更精确和功能上不同的簇。
同时，我们关于CAC存在和进展的单核细胞发现——特别是中间单核细胞与CAC进展的负相关——与MESA中关于颈动脉内膜中层厚度的先前发现不一致。具体而言，先前发现观察到中间单核细胞与卒中风险增加相关，最近一项使用单细胞转录组学和蛋白质表达分析61名接受冠状动脉造影的个体的横断面研究观察到中间单核细胞与冠状动脉疾病严重程度增加相关(通过Gensini评分测量)。这些区别值得进一步评估；它们可能由动脉粥样硬化床的差异(例如，与卒中相关的颈动脉粥样硬化与冠状动脉粥样硬化)或所测量动脉粥样硬化表型的区别(在本研究中，仅测量为CAC的钙化冠状动脉粥样硬化，而非造影测量的整体冠状动脉斑块)来解释。有必要对人类系统性和血管床特异性免疫反应进行进一步研究，因为这有可能阐明炎症斑块进展的微环境特异性病理生理学。
其他值得注意的探索性发现包括T辅助型细胞与CAC新发呈负相关，以及B细胞比例与CAC进展相关。B细胞比例总体与CAC进展相关的发现很有意思，因为关于B细胞在动脉粥样硬化中潜在致病性和动脉粥样硬化保护特征的数据表明，B细胞功能独特亚群的发现及其对血管疾病的多样化影响。在本研究中，B细胞通过整体谱系标记广泛定义；因此，我们缺乏粒度来定义不同B细胞亚群与CAC纵向变化的特定关联。
还有其他值得注意的局限性。这些包括依赖CAC，它仅代表整体冠状动脉斑块的一部分；这是不可避免的，因为序列非钙化斑块数据不可用。由于样本量和免疫细胞亚群个体间自然变异有限，我们的统计能力也有限，这使我们无法在主要分析中使用更严格的多重比较校正。这也使我们将本调查——据我们所知，首次调查高参数免疫细胞表型与CAC纵向变化关联的研究——作为探索性研究呈现，目的是为未来与机制和观察性调查相关的假设提供信息。因此，鉴于它们未达到更严格的Bonferroni校正P<0.0017，谨慎解释我们的发现非常重要。鉴于有限样本量导致的相对宽置信区间，我们选择报告达到探索性P<0.05的发现，而不是将其拒绝为阴性，因为我们认为这对于假设生成具有科学信息性，因为据我们所知，没有其他具有类似高参数流式细胞术和近1000名个体多年CAC纵向变化数据的队列。重要的是，鉴于本研究的探索性和关联性质，以及关于免疫细胞亚群和CAC随时间变化的先前数据稀少，我们无法严格纳入预测免疫细胞亚群、协变量和CAC相关结果之间复杂相互关系的因果框架。我们预计此处呈现的数据将有助于为未来更能够纳入因果推断或因果实验模型的研究提供信息。总体而言，这些局限性基于队列性质和可用数据是不可避免的。
总之，我们观察到NK细胞可能与CAC新发相关，而中间单核细胞和Tregs可能与CAC进展减缓相关。这些产生假设的发现，特别是NK细胞和Treg的发现，为实验方法提供了理由，并值得在纵向人类队列中进行复制，随着数据的可用。
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