摘要
外泌体亚群中货物蛋白的分析在诊断方面具有重要价值，但其临床应用受到耗时或复杂外泌体提取方案的限制。本文描述了一种可扩展、快速且低成本的外泌体提取方法，该方法利用交变(AC)磁场促进抗体包被磁珠(MBs)与血清样本在3D打印微流控芯片中的动态混合。两性离子聚合物包被的MBs经过磁力搅拌，可在30分钟内从少于50μL的原血清中实现超洁净的外泌体捕获效率，超过70%。本方法应用于抗L1CAM抗体对神经元外泌体的免疫捕获，随后通过标准双通道电化学夹心ELISA对阵列进行α-突触核蛋白(α-syn)含量分析，可实现亚皮克/毫升级别的检测，具有优异的变异系数和约75分钟的样本到结果时间。该方法的高性能和半自动化特点有望为低成本帕金森病诊断提供支持，并在外泌体生物标志物分析中具有普遍价值。
引言
外泌体是细胞分泌的30-150纳米大小的细胞外囊泡亚型，存在于所有生物流体中。由于它们是在细胞内生成的，因此被认为代表了细胞状态的快照，并作为潜在生物标志物引起了广泛关注。它们携带一系列可报告母细胞起源和状态的遗传物质、脂质和蛋白质。神经元细胞释放的外泌体（神经元外泌体）可在循环中检测到，可作为神经元病理生理状态的代理生物标志物。我们先前已证明，通过免疫捕获分离的L1CAM阳性外泌体中总α-突触核蛋白(α-syn)含量可以区分帕金森病(PD)患者或高风险个体（如快速眼动睡眠行为障碍患者）与对照组和非典型帕金森综合征患者。
帕金森病在病理学上以α-突触核蛋白(α-syn)(突触核蛋白病)在称为路易小体的神经元内包涵体中的积累和聚集为特征。虽然帕金森病的发病率在全球范围内不断增加，但其诊断通常在患者出现临床症状且已存在广泛病理变化时进行。像外泌体α-syn这样能够提供早期诊断的生物标志物，可以在神经退行性病变进展之前实现更早的治疗干预和应用疾病修饰剂来减缓疾病进展，从而提高患者生活质量。要实现高灵敏度的外泌体α-syn检测，需要一种稳健的外泌体分离方法，避免提取过程中因手动样本处理而产生的固有变异性，并且理想情况下具有高选择性且能处理非常小的样本量。
外泌体分离的常用方法基于差速离心、尺寸排阻和聚合物沉淀。这些方法特异性低（同时富集细胞和细胞碎片）、劳动强度大，且通常需要数百微升患者血液。基于特定表面标记表达（如L1CAM）的外泌体亚群免疫亲和分离在色谱或微流控分离中的固体支持物上应用有效，但这些方法可能存在捕获率低和/或需要生成高表面积纳米结构支持物（固体柱或孔隙）的问题。分散的抗体包被磁珠(MBs)在溶液相中的应用已成为外泌体分离越来越受欢迎和可访问的方法，但通常需要4-16小时的孵育，有时还需要额外的连续搅拌，以最大化免疫捕获。已有多种尝试改进MB混合动力学和相关捕获动力学（可能在约1小时内从约100μL样本中分离），例如通过使用微混合器或纳米结构微流控通道，但这些方法都需要复杂的工程（纳米级通道或纳米结构表面）和二次（离线）磁分离步骤。标准MB基外泌体提取通常利用在化学简单界面上建立的稳健抗体偶联，尽管这可以支持高（70-90%）捕获效率，但通常与广泛的动手动样本处理和洗涤相关。先前提出的半自动芯片外泌体分离方法作为手动MB提取的替代方案，减少了劳动、时间和交叉污染风险。然而，此类方法与相对较低的捕获率（<70%）相关，只能实际应用于外泌体高表达的真实样本分析。大多数此类方法还采用具有简单表面化学的MBs，无法防止非特异性吸附蛋白质、核酸或其他杂质，对下游分析可能产生显著影响。如果要从真实样本中实现清洁提取，则需要更复杂的MB涂层。
本文中，我们试图通过使用现成的电磁铁产生的交变(AC)磁场来控制磁免疫颗粒的集体运动，这些电磁铁跨越简单打印的微流控通道；我们观察到这促进了在几十分钟内达到的捕获效率，这通常（否则）需要数小时才能实现。磁场切换还促进受控的原位外泌体洗涤和裂解（方案1A），随后对可弃式32多电极阵列上的双标记α-syn和syntenin-1(synt-1)进行电化学定量（方案1B）。整个方法通过对72个患者样本的分析得到验证，神经元（L1CAM+）外泌体中的α-syn表达与PD状态之间存在明显的统计相关性。通过参考L1CAM+外泌体的手动分离和多羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pCMBA)包被免疫珠过夜孵育后获得的商业电化学发光测定(MSD)，进一步验证了解析的标记水平。
实验部分
磁性纳米粒子合成
将700纳米二氧化硅包被的超顺磁珠(Cytiva)在5 mL乙醇/水(1:1 v/v)中以10 mg/mL浓度，与100 μL (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和100 μL四乙氧基硅烷(TEOS)在冰浴中反应1小时，形成APTES修饰的MBs。将740 nm APTES-MBs从反应溶液中用磁铁提取，用水洗涤三次，用乙醇洗涤三次，然后在真空下干燥；将10 mg/mL APTES-MBs（在水中）与100 μL环氧氯丙烷（在冰浴中反应1小时）和100 μL四乙烯五胺功能化，洗涤后与链转移剂(CTA)（双(羧甲基)三硫代碳酸酯(BCTTC)）（38 mg溶于乙醇/水(1:1 v/v)）一起孵育。颗粒通过磁分离，用50% v/v乙醇/水洗涤，重新悬浮在乙醇/水(1:1 v/v)中，与BCTTC(3.7 mg)、4,4′-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)(10 mg)和羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)(38 mg)的混合物一起过夜孵育。孵育后，颗粒用水洗涤三次，用乙醇洗涤三次，在真空下干燥，并在4°C下储存。将颗粒重新悬浮在水中，浓度为2 mg/mL，使用EDC/NHSS激活游离羧基30分钟，洗涤后与抗体在室温下孵育3小时。聚合物薄膜厚度（约20 nm）和低电荷（≈-5 mV）符合预期。抗体覆盖率为≈4.77 μg/mg颗粒，代表81%的理论单层表面覆盖率。这些颗粒随后表现出极低的蛋白质非特异性吸附，由电化学定量吸附蛋白质的低背景表明。
外泌体分离
使用双注射泵独立控制样本和MB注入。首先以20 μL/min的速度将50 μL PBS中的MBs（浓度为2 mg/mL，相当于100 μg MBs）引入微流控芯片。通过向左侧磁铁施加12 V电位，激活永久模式磁场，将MBs保持在混合室中。然后以20 μL/min的速度将50 μL样本泵入混合室，在永久磁场下进行。一旦样本填满混合室（90秒），停止流动，将磁场切换到优化频率的交变模式，使用可编程Arduino芯片和可调能源供应。混合30分钟后，将磁场切换到永久模式，通过以50 μL/min（4分钟）流动PBS-T20 200 μL清洗MBs。清洗后，以50 μL/min的速度将50 μL裂解缓冲液泵入混合室，使其在交流模式下与MBs（携带捕获的外泌体）一起孵育，以允许外泌体裂解。然后将裂解物（50 μL）转移到收集管中，并用PBS稀释4倍进行电化学分析。对于不进行裂解的外泌体提取，遵循上述相同的提取程序，并在不裂解的情况下将捕获外泌体的MBs转移到收集管中。MSD分析的外泌体提取使用相同的MBs，在4°C下与250 μL血清样本在低结合管（Eppendorf）中过夜孵育，同时进行连续搅拌。MBs被收集，用PBS-T20通过永久磁铁洗涤3次，然后与裂解缓冲液孵育15分钟，再使用标准MSD协议对α-syn和synt-1进行定量（见SI中的"材料和方法"）。
电化学分析
电化学分析在多电极（32电极）阵列上开发，用于使用标准夹心ELISA协议同时分析多达10个样本中的两种蛋白质。抗α-syn（来自Human alpha-Synuclein DuoSet ELISA (Cat # DY1338-05), R&D Systems, USA）或抗synt-1（来自Abcam, Cat # EPR8102, Invitrogen, Cat # PA5-28813）的一抗（捕获Ab）在优化浓度下涂覆在电极上。阵列（32电极）被分配用于分析α-syn或synt-1，其中每个阵列用于分析10个样本（重复），同时运行六个标准浓度（用于电化学信号校正）。每个电极与50 μL样本孵育15分钟，用100 μL PBS-T20洗涤两次，与生物素化（抗α-syn来自Human alpha-Synuclein DuoSet ELISA (Cat# DY1338-05), R&D Systems, USA，以及抗synt-1来自Novus Biologicals, Cat # K10P3D5）二抗（检测Ab）孵育10分钟，用100 μL PBS-T20洗涤两次，然后与50 μL链霉亲和素-HRP孵育10分钟。最后，电极洗涤后与四甲基联苯胺(TMB)的沉淀形式孵育2分钟。用水洗涤后，使用方波伏安法(SWV)（0.0-0.5 V vs Ag/AgCl）记录电化学信号，电位步长2 mV，振幅20 mV，频率25 Hz。校准曲线通过将标准重组蛋白浓度与SWV峰值高度相关建立。对于患者样本，遵循相同程序，同时使用八个孔/板进行电化学信号校正（作为校准器）。然后使用标准重组蛋白获得的校准数据估计每个样本中的α-syn和synt-1浓度（根据每个阵列上测量的标准进行校正）。虽然使用32电极阵列实现了高通量分析，但它禁止电化学分析和微流控外泌体分离的单步集成。
结果与讨论
磁珠合成与表征
使用先前报道的方法合成了pCBMA包被的MBs，并进行了轻微修改。聚合物涂层专门形成在700 nm二氧化硅包被（磁芯/二氧化硅壳）的MBs上，这些MBs经过20（±11）nm组合APTES/TEOS层预修饰。由此生成的富含胺的外围促进BCTTC CTA的共价固定。然后将颗粒与CBMA单体、CTA和引发剂（ACVA）混合，形成15（±7）nm两性离子pCBMA涂层（见SI中的图S2；有关详细合成协议，请参见"材料和方法"）。天然阴离子颗粒的zeta电位（-17±3 mV）在硅烷修饰后增加到+22（±4 mV），最终在聚合后达到-4（±1 mV）（见SI中的图S2B）。随后的抗体负载估计为4.8 μg/mg MBs（≈7.0×10^4 Ab/颗粒），使用双辛可宁酸(BCA)总蛋白测定（见"材料和方法"），代表>80%的理论单层表面覆盖率。生成的颗粒在与过量（10 mg/mL）人血清白蛋白孵育1小时后，显示出可检测不到的蛋白质吸附（低于BCA测定的检测限（<0.2 μg/mL））（见"材料和方法"）。MBs的非污损特性还通过下游电化学分析（见图2E,F）和放大荧光显微镜测定（见SI中的图S2和S3；参见"材料和方法"；"免疫荧光测定"）进一步检验。裸pCBMA MBs的蛋白质印迹(WB)分析也显示，在裂解液中过夜孵育后，没有检测到外泌体特异性蛋白L1CAM和CD81（见SI中的图S2），证实外泌体招募是免疫特异性的。
微流控外泌体分离
我们设计并3D打印了一个Y形混合器微流控装置，配备双入口用于样本和免疫MB注入，导向圆柱形混合室，直径为1.5 mm，体积为50 μL（方案1A和SI中的图S1）。50 μL混合室在使用前用1%牛血清白蛋白(BSA)在PBS中包被，以减少打印表面对非特异性血清蛋白吸附的敏感性，然后放置在两个电激活双向磁铁之间，这些磁铁以可调速率（2至0.25 Hz之间）进行交替激活周期，使用特定电位（8-16 V）的电源。使用包被有抗CD9或抗L1CAM抗体的MBs提取CD9+外泌体（代表约75-85%的通用血清外泌体群体）或L1CAM+外泌体（占总外泌体群体的8-13%）。
激活电位和频率决定流体动力学和混合，并独立控制；这些在1 Hz和12 V激活下进行了优化，通过纳米粒子跟踪分析(NTA)评估（图1A,B）。混合时间变化也进行了评估，30分钟孵育支持约70-75%的提取效率（图1C）；较短的孵育时间导致捕获效率降低，而较长的孵育并未导致显著改善。为了将捕获的外泌体与其他血清成分分离，将磁场切换到永久模式，使MBs（及其货物）在流动洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲液-0.05% Tween 20 (PBS-T20)）下被捕获。然后用裂解缓冲液（PBS中含1% Triton X-100和Halt蛋白酶抑制剂混合物）替换（在流动下）洗涤缓冲液，这一过程进一步通过MB AC场激活促进，持续30分钟。
AC场促进的外泌体提取效率与在相同微流控配置中无AC磁场的条件下在相似流速和孵育时间下（30次孵育，流速为2 μL/min）实现的效率进行了比较。NTA分析（见SI中的"材料和方法"）表明，优化的AC磁场在30分钟内从稀释的人血清中一致支持>70%的L1CAM+或CD9+外泌体分离效率（在NanoSight NS300的工作动态范围内稀释以带入外泌体），而30分钟孵育时无场的捕获效率<20%（图1D）。
电化学分析
建立了用于α-syn和synt-1（从同一样本同时分析两种抗原）的双重测定，采用标准夹心电化学ELISA格式，并进行了优化。这些包括样本（15分钟）、生物素化检测抗体（Ab2）（10分钟）、链霉亲和素-辣根过氧化物酶（St-HRP）（10分钟）和沉淀TMB（2分钟）的顺序孵育。HRP催化在电极表面生成局部浓度依赖的氧化TMB沉淀，可通过SWV峰值电流量化。使用的丝网印刷32电极阵列集成在底部无32 ELISA孔板中（见SI中的图S4），α-syn和synt-1的阵列间标准差<20%，阵列内电极间标准差<12%（见SI中的图S5）。每个孔代表一个单独的电化学电池，包含参考、计数和工作电极，单独连接到多电位计进行电化学测量。每个板分为两部分：16孔用于α-syn，16孔用于synt-1，使两种抗原的分析能够跨越潜在的八个样本。在真实样本分析之前，使用标准重组α-syn和synt-1（在1% BSA中作为蛋白质丰富基质的替代物）对阵列进行校准。测定需要50 μL样本/孔，<40分钟支持200 fg/mL的α-syn检测限和3.2 ng/mL的synt-1检测限，动态范围跨越α-syn的0.25-5000 pg/mL和synt-1的16-1600 ng/mL（图2A,B）。当面临常见干扰蛋白（BSA；人血清白蛋白(HSA)；纤维蛋白原；肌红蛋白）的高（临床相关）浓度时，测定选择性极佳（图2C,D）。
测定验证
为了验证这些分析的性能，对15个对照样本进行了α-syn和synt-1分析，将AC微流控提取后的电化学阵列定量与传统提取协议（过夜孵育下连续搅拌）和MSD分析进行比较（见SI中的"材料和方法"）。观察到令人满意的良好分析相关性（考虑到提取和分析差异），截距接近原点，斜率接近单位值（α-syn和synt-1的斜率分别为0.86（R²=0.78）和0.91（R²=0.68），相关的截距分别为0.06（±0.02）和0.02（±0.03））。单个样本比较表明，75%的样本在分析α-syn时无显著差异（P<0.05），60%的样本在synt-1表达水平上无显著差异（P<0.05）（图3A,B）。当然，完全预期通过完全独立的分析方法（以及分析参数）对真实患者样本进行分析时会有一定程度的变异。
患者样本分析
然后将芯片AC辅助捕获和下游电化学分析应用于来自我们先前发现使用MSD在外泌体中显示α-syn水平增加的两个疾病组的另外72个样本：帕金森病患者（n=20）与其相应对照（n=20）或快速眼动睡眠行为障碍(RBD, n=23)个体（这些个体有发展为帕金森病的风险）与对照（n=9）。
对于两组，AC外泌体分离与下游多重电化学分析显示，与年龄匹配的对照相比，PD或RBD患者中解析的α-syn表达存在统计学显著差异，如回收浓度的箱线图分析所示（图4A,B）。对于任一组，synt-1的表达均无显著差异，这与我们先前的发现一致（图4A,B）。箱线图分析还支持排除异常值（1.5×四分位距(IQR)外的点）；具体而言，synt-1数据中有三个异常值，如图4A所示，HC组中有两个异常值，如图4B所示。与RBD组相比，PD组中观察到的synt-1分布较高，这可能是由于样本收集程序或两个队列之间的种族/民族差异造成的。
为了评估所提出的AC场提取/电化学分析在检测帕金森病方面的临床有效性，对从RBD和PD队列获得的结果进行了接收器操作特性(ROC)分析。从PD队列分析的α-syn的曲线下面积(AUC)值确定为0.78（图5A）。从RBD队列分析的α-syn的AUC值>0.85（图5B）。synt-1数据分析（图5A-D）显示低AUC，表明其预期的低临床价值，因为这是外泌体的通用标记。这些发现与我们先前报道的AUC=0.86相当，该结果使用过夜免疫捕获和下游标准MSD对α-syn在n=664个来自独立临床队列的血清样本进行分析。
结果表明，交变磁场的应用可以改善从血清样本中免疫磁性提取目标神经元外泌体，然后进行相关的货物标记物的超灵敏和临床有价值的电化学阵列分析。应用于α-syn，该配置能够支持从<50 μL样本中在不到75分钟的总时间内进行稳健的分离和定量。使用两性离子聚合物包被的MBs确保下游分析可以在没有游离血清蛋白干扰的情况下进行。重要的是，当暴露于临床相关浓度时，MBs对游离α-syn（图2E,F）或血清样本中的外泌体（图1D）均无非特异性吸附倾向，使得假阳性分析不太可能发生。
原位外泌体裂解释放货物蛋白，可以使用集成在标准底部无ELISA微孔板内的32丝网印刷电极上的高灵敏度多重电化学ELISA进行分析。应用于对来自两个不同患者队列的72个样本的盲法分析，结果与通过更标准的MSD（多日、大体积）分析从相同患者样本获得的结果非常吻合。它们还通过完全独立的方法验证了我们先前关于神经元外泌体α-syn作为帕金森病预测或诊断生物标志物的发现。从PD队列中回收的神经元α-syn的平均浓度约为从HC患者回收的α-syn浓度的200%，支持其在PD识别中的价值，这一发现进一步通过ROC分析中AUC>0.75得到证实。
结论
开发了一种使用抗L1CAM抗体包被的MBs从血清样本中芯片磁促进提取神经元外泌体，并与下游α-syn和synt-1电化学分析相结合的方法。该配置包括一个由可调AC磁场控制的非污损MBs双向运动促进的连续动态捕获粒子-血清混合。从低样本体积中在几分钟内促进高度选择性的外泌体从血清中提取，背景贡献可忽略不计。随后对磁捕获外泌体进行原位裂解，然后进行亚皮克/毫升检测限测定。所有患者分析均严格与标准提取和定量方法交叉参考。我们认为所概述的、通用的方法在加速可扩展外泌体诊断的效率和吞吐量方面具有价值。
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