摘要
在小脑中，攀爬纤维(CFs)为平行纤维到浦肯野细胞突触的监督学习提供指导性信号。迄今为止，尚未测试CF信号是否也可能影响其他脑区的可塑性。本文显示，在清醒小鼠中，光遗传学CF激活抑制了在重复胡须刺激后观察到的初级体感皮层(S1)中L2/3锥体细胞胡须反应的强化。利用双光子成像和化学遗传学，我们发现CF通过调节S1皮层中的SST和VIP阳性中间神经元来控制可塑性。跨突触标记确定未定带(ZI)到丘脑后内侧核的投射是小脑输出到达S1皮层的通路。化学遗传学抑制ZI中的PV阳性神经元可防止CF共激活效应，确定ZI为关键中继站。我们的研究结果表明，CF影响S1皮层中的感觉信号处理和可塑性，因此可能传递指导性信号。
引言
感觉体验和学习与多个脑区的可塑性相关。新皮层可塑性通常依赖于其直接输入结构的活动¹。例如，啮齿动物初级体感皮层(S1皮层)的胡须区域可塑性在重复胡须刺激后被诱发。胡须剪除²⁻⁴或节律性胡须刺激史⁵⁻⁷后，感受野图可能重组，这需要突触权重的适应性可塑性，例如通过锥体神经元突触输入上的长时程增强(LTP)和/或长时程抑制(LTD)⁸,⁹。S1感觉回路的高度可塑性使适应改变的输入成为可能¹⁰。尽管新皮层的经验依赖型可塑性对输入特征高度敏感，但其他脑区的调节影响可能发挥作用。
小脑的功能越来越多地被赋予先前归因于新皮层的功能¹¹,¹²。它通过丘脑向运动皮层和非运动区域投射，包括前额叶皮层¹³,¹⁴、感觉和联合区域¹⁵⁻¹⁷。因此，小脑输出影响皮层信号是一个合理的可能性。确实已经证明，小脑输出的调节会影响前额叶皮层的活动¹⁸、新皮层区域之间神经振荡的相干性¹⁹⁻²¹以及顶叶-运动皮层连接的可塑性²²。然而，这些相互作用的细胞机制尚未被描述。
本文我们提出一个具体问题：小脑攀爬纤维(CF)信号是否具有影响新皮层可塑性的机制能力。我们研究CF信号的动机源于其活动对正常小脑功能的重要性，在小脑中，CF控制的可塑性是大脑监督学习的经典例子¹。根据树突结构，浦肯野细胞(PCs)接收来自一个或多个攀爬纤维(CFs)的输入²³，这些纤维起源于对侧下橄榄核(IO)。正如Marr在其《小脑皮层理论》中最初预测的那样，CF信号监督平行纤维(PF)–PC突触上的可塑性，为学习提供"上下文"²⁴。后来的实验表明，PF和CF共刺激在PF突触上引发LTD²⁵⁻²⁸，并且CF–通过诱发钙瞬变–紧密控制这些突触上的可塑性²⁹⁻³⁴，并为小脑控制的学习提供指导性信号³⁵⁻³⁸。CFs提供指导性错误信号³⁹，跨模态传递感觉输入⁴⁰⁻⁴⁴，甚至可能传递预期感觉信号缺失的信号⁴⁵。CFs还可能携带奖励或奖励预测相关信号⁴⁶,⁴⁷。CF被招募的上下文继续被识别，这强调了确定它们是否可能影响新皮层活动和可塑性的重要性。
为确定CF信号是否具有影响S1神经元可塑性的能力，我们使用小鼠脑在细胞水平上提供实验通路。我们观察到CF信号调节S1皮层中L2/3锥体细胞的可塑性，表明橄榄-小脑系统的活动对S1皮层中的输入处理和可塑性具有不同的后果，并显著扩展了关于这些区域之间基本相互作用的已知知识。这种机制可用于向新皮层提供指导性信号，取决于CF被招募的上下文，类似于在小脑监督学习中起作用的信号。
经验依赖型S1皮层可塑性受光遗传学CF激活调控
为研究CF活动对S1可塑性的影响，我们在S1皮层中表达了GCaMP6f，并在清醒小鼠中使用双光子显微镜测量对L2/3 (L2/3)神经元胡须区域空气喷射刺激的反应(图1A, D)。为进行光遗传学CF激活，通道视紫红质-2 (ChR2)在下橄榄核(IO)神经元中表达，这些神经元在对侧小脑皮层终止(图1B, E；图S1A, B)。LED用于在以颅窗为中心的470nm光脉冲，该颅窗位于对同侧胡须区域刺激有反应的小脑皮层区域crus I/II⁴⁰。通过在crus I/II的PCs中表达GCaMP6f并测量LED光脉冲诱发的钙瞬变来测试光遗传学激活的效果，我们改变频率和持续时间以实现类似于自发CF瞬变的光遗传学诱发信号(图1C；图S1F)。持续50ms的单光脉冲诱发了CF瞬变，其振幅或峰值潜伏期与在同一PCs中记录的自发事件无显著差异(图S1H, I)⁴⁸。为诱导S1皮层中的可塑性，我们使用了多胡须刺激方案("节律性胡须刺激"；RWS)，类似于先前用于研究体内感觉驱动突触可塑性的方案⁷,⁹,⁴⁹,⁵⁰。这里，RWS由对对侧胡须区域应用100ms空气喷射(8psi)组成，持续5分钟，频率为8Hz，这是小鼠采样环境时的自然胡须频率⁵¹。RWS刺激导致胡须诱发钙反应增加(刺激起始后0-700ms范围内的ΔF/F)，我们在形态学鉴定的L2/3锥体神经元(PNs；图1F)中观察到这一现象，持续记录时间(60分钟RWS后；图1G-I)。用GCaMP6测量的胞体钙反应振幅与神经元放电率相关⁵²。L2/3锥体神经元对相应主胡须的刺激有反应，但也可能对周围胡须的刺激有反应⁵³。因此，这里观察到的对多胡须刺激的可塑性可能反映了传递已存在胡须输入的突触强化以及神经元感受野扩展到包括额外周围胡须。鉴于兴奋性神经元活动的增加可能与局部抑制性神经元活动的减少耦合在这种形式的可塑性中⁵⁴，我们还在同一只小鼠中评估了未鉴定为锥体细胞的神经元(即假定的中间神经元；INs)的反应。确实，INs整体对RWS刺激表现出诱发钙事件振幅的显著抑制(图1J-L；图S2F, G)。由于副蛋白钙素(PV)阳性中间神经元、生长抑素(SST)阳性中间神经元和血管活性肠肽(VIP)阳性中间神经元分别约占新皮层中间神经元群体的40%、30%和12%⁵⁵,⁵⁶，这种可塑性效应可能主要由SST和PV中间神经元组成。使用转基因小鼠将SST和PV中间神经元标记为tdTomato，我们证明RWS导致SST和PV中间神经元显著抑制(图S2H, I)——与我们在假定中间神经元中的观察一致。
为确定CF与胡须刺激共激活是否影响这种形式的经验依赖型可塑性，在5分钟重复胡须刺激(RWS+CF)期间，以1Hz的频率递送50ms光脉冲，这是自发CF放电的速率³⁹。每个光脉冲相对于胡须刺激起始延迟45ms递送，模拟CF对胡须刺激的自然潜伏期⁴⁰。RWS+CF阻断了S1皮层中L2/3锥体细胞反应的强化，并观察到抑制(图1G-I；图S2D, E)。在RWS后观察到的IN反应抑制在光遗传学CF共激活时消失(图1J-L，图S2F, G)，而在tdTomato标记的SST和PV中间神经元的小鼠中进行的记录进一步证明了抑制性中间神经元抑制的消失(图S2H, I)。重要的是，S1可塑性和光遗传学CF激活效应在包含小鼠主动运动的试验中(图1；图S2+3)或当分析仅限于小鼠在刺激起始前和整个反应期间都处于休息状态的试验时(图S3)都被观察到。注意休息期间胡须的运动不存在。
为测试这些效应的稳健性，我们使用另一种适合检测感受野(包括S1皮层中的胡须桶)的方法重现了这些发现。固有光学成像⁵⁷用于在麻醉小鼠中以低空间分辨率测量可塑性效应，以促进单胡须反应的测量。我们将玻璃移液管滑过单个未修剪的胡须，并以10Hz的频率来回移动5分钟。在对侧S1皮层的胡须桶区域中，我们确认了相应桶的激活，并在重复刺激前20分钟和之后30分钟记录了对这种被动感觉体验的反应。我们观察到响应区域增加超出了桶，这在没有重复刺激的情况下未被观察到(图S4)。当小脑crus I/II中表达ChR2的CFs在重复刺激期间以1Hz的频率光遗传学激活5分钟时，S1皮层中未观察到这种可塑性(图S4)。因此，固有光学成像证明胡须桶的感受野可塑性可由小脑信号调控。
综合起来，我们的研究结果表明，S1皮层中的胡须诱导反应强化源于L2/3锥体细胞可塑性。局部抑制性中间神经元在同一只动物中表现出相反方向的可塑性。观察到这种IN可塑性振幅较低且不完美地镜像锥体细胞可塑性，表明前者支持后者并可能帮助控制它，但锥体细胞LTP可能在没有IN神经元LTD的情况下发生。CF活动调控这种胡须图可塑性。注意这里的"LTP"和"LTD"反映了靶神经元的反应性——通过神经钙信号测量——并未特别显示为突触增益变化。
CF激活调节S1皮层中的抑制性中间神经元
局部抑制性中间神经元调控新皮层锥体神经元的活动和可塑性，这一现象在啮齿动物胡须桶皮层中被广泛研究⁵⁶。因此，为识别光遗传学CF激活对S1可塑性门控效应的潜在介质，我们接下来确定S1回路中特定神经元类型的基本胡须反应特性在CF共激活期间如何改变(图2A)。首先，我们证明在检查的L2/3锥体神经元群体中，这些基本反应在光遗传学CF激活后没有显著改变(图2B；0-700ms分析窗口)。然而，我们发现，在23只小鼠中的11只中，CF共激活导致整体反应降低，而在23只小鼠中的5只中观察到增加(使用10%阈值)。在选择晚期分析窗口时(650-850ms，选为峰值后反应的早期成分)，观察到的轻度反应降低的显著性出现。这些发现表明CF共激活导致L2/3锥体神经元群体中一系列反应变化，但整体抑制效应在晚期反应阶段变得明显。
在同一只小鼠中，CF共激活增加了INs对胡须刺激的基本反应(图2C)。与在IN群体中测量的可塑性效应类似(图1J-L)，这些基本反应增加可能主要由PV和SST中间神经元组成。使用tdTomato标记的中间神经元来鉴定SST和PV中间神经元(图2D-F)，我们证明CF共激活后SST和PV中间神经元确实增强了对胡须刺激的基本反应(图2G-I)。VIP中间神经元——主要抑制包括SSTs和PVs在内的其他中间神经元⁵⁶——在默认分析窗口(0-700ms；图2G)中CF共激活后对胡须刺激的基本反应没有一致变化。然而，与锥体神经元类似(图2B)，VIPs在650-850ms的晚期分析窗口中表现出显著抑制(图2G)。
SST和VIP中间神经元在CF介导的S1可塑性控制中的相反作用
由于SST中间神经元被CF共激活激活，我们测试它们是否在CF介导的S1可塑性调控中承担关键角色。为此，我们接下来使用化学遗传方法进行活动操作。我们专注于SST中间神经元，因为它们接触L2/3锥体细胞的树突(图3A, E)，其中抑制可以影响局部突触可塑性过程。我们首先在新皮层SST中间神经元中表达兴奋性hM3D(Gq) DREADD(图3B)。通过腹腔注射给予DREADD激动剂去氯氯氮平(DCZ)导致SST中间神经元反应增加(图3C)。在此条件下，RWS未使L2/3锥体细胞反应强化，反而导致钙信号抑制(图3D)，模拟光遗传学CF共激活的结果(图1G-I)。相反，在SST中间神经元中表达抑制性hM4D(Gi) DREADD(图3F)并急性给予DCZ导致SST中间神经元反应显著降低(图3G)。当RWS与CF共激活配对时，这挽救了L2/3锥体细胞反应的强化(图3H)。这些发现证实SST中间神经元能够控制L2/3锥体神经元的可塑性⁹，并表明该机制被CF共激活招募。
SST中间神经元接收来自皮层和向S1提供输入的皮层下区域的相对较弱输入，但被VIP中间神经元强烈抑制(图4A, E)⁵⁸,⁵⁹。在RWS期间，VIP中间神经元可能抑制SST活动，从而促进可塑性⁹,⁶⁰。我们上面已显示光遗传学CF激活降低了对胡须刺激有反应的VIP中间神经元子集(图2G)。为检查这种活动调控对RWS+CF诱导的L2/3锥体细胞可塑性抑制是否至关重要，我们使用化学遗传方法操作VIP中间神经元的活动。我们首先观察到在VIP中间神经元中表达抑制性hM4D (Gi) DREADDs(图4B)并急性给予DCZ显著降低了VIP中间神经元的活动(图4C)，并阻止了单独RWS刺激后的S1强化(图4D)。这种操作类似于RWS+CF(图1G-I)或RWS期间SST激活的效果(图3D)。相反，在VIP中间神经元中表达兴奋性hM3D(Gq) DREADDs(图4F)并急性给予DCZ增强了VIP中间神经元的反应(图4G)，并在配对RWS和光遗传学CF激活(RWS+CF；图4H)后挽救了S1可塑性，模拟RWS(图1G-I)或RWS+CF期间SST中间神经元活动抑制的效果(图3H)。
为控制DCZ的持续存在，对每种条件进行了相同的实验，但不给予RWS(图S5A, D)或RWS+CF(图S5G, J, M)。比较对照和可塑性实验时，SST激活和VIP失活实验都成功显示SST激活足以阻断RWS介导的PN强化(图S5C)，而VIP活动对RWS介导的PN强化是必需的(图S5F)。VIP激活实验也成功显示VIP激活在RWS+CF后挽救了PN强化(图S5O)，并且这种效果不是由于在这些条件下DCZ存在导致的锥体神经元反应性持续增加(图S5N)。我们还测试了PV中间神经元对CF介导的S1可塑性控制的潜在贡献。在PV中间神经元中表达抑制性hM4D (Gi) DREADDs确实在与对照比较时在RWS+CF后挽救了PN强化(图S5L)，鉴于PV中间神经元通常是具有强自发放电连接到锥体神经元的篮状细胞，这是一个强有力的效果⁵⁶。为支持我们的解释，即VIP中间神经元控制S1皮层中的去抑制网络，我们进一步分析了VIP化学遗传操作实验中的IN群体(由假定的SSTs和PVs组成)(图5)。RWS期间VIP失活阻断了PN强化(图4D)，确实导致IN活动相应增加(图5C)，以模拟RWS+CF的效果(图1G-L)，即使没有CF活动。RWS+CF期间VIP激活挽救了PN强化(图4H)，导致IN活动相应降低(图5F)，以模拟RWS的效果(图1G-L)，即使CFs活跃。这些发现证实VIP中间神经元协调S1皮层中的抑制网络，并表明该机制被光遗传学CF激活招募。综合起来，到目前为止呈现的研究结果表明，RWS驱动的可塑性的关键回路位于S1皮层本身，并确定VIP和SST中间神经元是足以介导CF激活后果的效应器。充分性的概念不排除在此上下文和其他未测试的上下文中可能调节效应器激活的其他可塑性过程的潜在效果。
小脑核到丘脑后内侧核(POm)的未定带作为从小脑核到S1皮层的多突触通路
小脑攀爬纤维必须通过深部小脑核(DCN)对其新皮层产生影响，除此之外可能有几条潜在通路到达初级体感皮层。小鼠的胡须皮层接收来自两个丘脑来源的胡须感觉信息，腹后内侧丘脑核(VPM)和丘脑后内侧核(POm)。虽然VPM密集投射到S1皮层的中间层，但POm输入主要终止于L5以及L1，在L1中除了锥体细胞外，它们还与VIP中间神经元突触⁵⁸,⁵⁹。先前已显示POm至VIP的输入可控制胡须皮层中PNs的RWS介导的可塑性⁵⁰。然而，由于DCN仅向POm(和VPM)发送弱直接投射，我们专注于小脑的其他可能影响感觉丘脑核活动的输出区域：丘脑网状核(TRN)和未定带(ZI)。鉴于ZI被小脑核强烈支配¹⁷,⁶¹,⁶²并投射到POm⁶³，ZI代表CF可能对S1产生影响的更合理通路。为排除通过丘脑网状核到S1的通路，其GABA能神经元主要抑制VPM⁶⁴，我们使用从体感丘脑(包括VPM和POm)的逆向荧光金标记和来自对侧DCN的顺行标记。我们在TRN中未发现重叠(图S6)。接下来，我们使用双注射方法确定接收小脑输入的ZI细胞的主要输出通路，该方法利用了AAV1⁶⁵的跨突触运输特性：将AAV1-Flp重组酶(pAAV-EF1a-Flpo)递送到深部小脑核，随后将Flp依赖性标记(Frt-ChR2-EYFP)递送到对侧ZI。在ZI中发现大量EYFP表达神经元(图6A, B；图S7)，其轴突末端在POm(图6A, B；图S7)和S1皮层(图6A, B)中可见。这些结果表明ZI-POm通路而非TRN-VPM通路构成了小脑信号到达S1皮层的关键丘脑通路(图S6C)。
为评估从小脑核到投射到POm的ZI神经元是否存在单突触连接，我们在小脑核中诱导ChR2表达，并对投射到POm的ZI神经元(即通过荧光红宝石注射到POm中逆行标记的细胞)进行体外全细胞膜片钳记录，并测试它们对ChR2诱发反应的反应(图6D，图S8)。以10Hz频率对ChR2+末端进行光遗传学激活诱发了EPSPs，即使在应用河豚毒素(TTX；1 μM)的情况下仍然存在(图6E, F)，尽管振幅显著降低。这种TTX不敏感成分代表小脑核神经元和ZI神经元之间突触上ChR2诱发的EPSP，并证明了该通路的单突触性质⁶⁶。
先前已证明ZI中大多数投射到POm的神经元是PV神经元⁶⁷。为测试这些神经元是否将小脑指导信号传递到S1皮层，我们在基本胡须和胡须加光遗传学CF激活条件下化学遗传学抑制ZI中的PV神经元，并测量S1皮层中L2/3锥体神经元的反应。在ZI驻留的PV神经元中表达抑制性hM4D (Gi) DREADDs(图6G)和DCZ应用阻止了CF共激活对锥体细胞反应的抑制作用(图6H, I)。这些数据表明丘脑投射的ZI中的PV神经元将CF信号传递到S1皮层。
讨论
CFs被赋予多种功能。与我们的记录一致，在缺乏行为奖励的实验范式中，光遗传学CF共激活抑制S1锥体神经元可塑性，这种行为中性信号像错误信号一样发挥作用。然而，CF招募和S1可塑性调控也可能发生在奖励/奖励缺失的上下文中。CF激活可能由感觉-关联训练中的奖励/奖励缺失驱动。这可能是为什么在这种训练上下文中的感觉刺激驱动皮层可塑性不如被动感觉刺激本身⁶⁸的原因。S1皮层中的可塑性源于对新的感觉体验(这里是8Hz的延长节律性胡须激活)的输入更新，这需要回路适应。当明显的破坏或违反感觉预测发生时，或当感觉输入未达到稳定性时，CF可能会被招募。"相同性"的缺失可能被下橄榄核神经元检测为感觉环境中的错误，随后CF阻止否则展开的强化。这种功能提供了橄榄-小脑的"感觉作用"⁶⁹,⁷⁰的一个例子，在这种情况下通过控制初级感觉皮层中的适应性可塑性，而不立即影响运动领域。
在啮齿动物中，直接三叉神经-橄榄连接将胡须相关信息传递给橄榄⁷¹。被动胡须激活在同侧crus I/II中诱发PCs的CF介导的复杂峰放电⁴⁰。这些诱发峰叠加在约1Hz的自发复杂峰放电率之上³⁹。是什么将抑制大脑皮层可塑性的CF活动与这些更常见的活动模式区分开来？首先，对啮齿动物敏感皮肤区域(如鼻子或手腕)的延长低频空气喷射诱发PC反应的强化，而非抑制⁷²,⁷³。这一发现与当前对CF信号的理解一致：新异性激活它³⁹；当反复呈现刺激(产生/抑制"相同性"状态)时，诱发的复杂峰放电减弱。因此，RWS刺激可能不会产生连续升高的CF激活。要在自然条件下发生这种情况，必须出现新的输入特征。其次，CF反应的同步可能至关重要。复杂峰同步在自发活动中不存在或较弱，可能随运动启动⁷⁴,⁷⁵或感觉刺激⁷⁶而增加。足够高水平的PCs同步需要在小脑核中诱发抑制和随后的目标神经元反弹兴奋⁷⁷,⁷⁸。平行纤维(PFs)可能无法产生足够PCs的同步活动，因为PF输入的空间排列⁷⁹。同步阈值水平将通过光遗传学CF激活达到，但也可能自然达到，具有特定质量的感觉输入信号，例如使其成为错误信号的信号。也有可能同步到阈值水平是由不源于胡须刺激但具有其他感觉或非感觉起源的错误信号驱动的。
啮齿动物中的胡须相关感觉信息由三叉神经节通过丘脑核VPM和POm传递到胡须皮层；来自特定胡须的信息通过VPM投射到皮层第4层⁸⁰。观察到小脑信号通过ZI和POm影响S1皮层符合更调节性通路的描述，该通路不干扰第4层中的丘脑输入，但干扰更浅层以及深层中的突触信号整合。双光子成像和化学遗传学都将S1皮层中的SST中间神经元确定为该调节通路激活的最终效应器(注意类似的机制可能导致临床上称为CBI或"小脑-大脑抑制"的现象，其中对人类受试者小脑的电或磁刺激导致运动皮层兴奋性的降低⁸¹,⁸²)。SST中间神经元反过来由接收POm激活的VIP中间神经元调控⁵⁹。我们还将ZI中的PV神经元确定为该通路中关键参与的神经元，可能减少S1皮层中VIP中间神经元的POm介导激活。我们的研究结果表明，小脑输出可能充分招募ZI中的PV神经元，最终导致VIP中间神经元对SST中间神经元的抑制移除，从而增强L2/3锥体神经元的树突抑制。这种激活序列可能需要小脑皮层输出对小脑核中兴奋性神经元的初始激活，这可能源于PC活动后的反弹兴奋⁷⁸。ZI中PV神经元被激活的另一个上下文——通过来自S1皮层的谷氨酸能输入——是在口面部区域的自我梳理⁸³。在这种预测感觉输入的条件下，胡须相关的L2/3锥体神经元可塑性也可能被抑制。虽然我们的研究结果确定小脑核到ZI到POm的投射对将CF信号传递到S1皮层至关重要，但可能存在更多未在此测试的投射，可提供从小脑到S1皮层的连接。这由小脑核的多通道输出⁸⁴所暗示。例如，我们不能排除小脑核直接投射到VPM或POm⁸⁵(然而，请注意图6A-C；图S7中显示的到达ZI并起源于小脑核的投射的显著性)。此外，小脑输出可能通过M1皮层到达S1皮层，因为这两个皮层显示强相互连接⁸⁶，而M1中投射到S1皮层的锥体神经元靶向S1皮层中的VIP中间神经元⁸⁷。
我们的数据显示，小脑CFs的活动影响S1皮层，通过招募局部SST中间神经元防止L2/3锥体神经元的可塑性。在我们的实验中，CFs被人工(光遗传学)刺激，关于CF参与及其在自然条件下后果的最终结论仍然开放。然而，我们的研究表明这种对皮层信号的影响能力以及实现这种影响的通路。这些是CF信号作为监督学习⁸⁸中指导信号的必要条件。这种效应的条件可能是PCs群组中CF反应的同步⁷⁷,⁷⁸，这种情况为与其他CF活动模式⁷⁴⁻⁷⁶的区分提供了资格。观察到的外部影响使监管控制成为可能，这可能保护大脑皮层免受适应不良，尽管以使其暴露于橄榄-小脑系统的病理性功能障碍为代价，例如在综合征性自闭症中描述的感觉过度反应⁴⁸。
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