CAR T细胞（嵌合抗原受体T细胞）是一种经过基因工程改造的T细胞，能够靶向特定抗原。在生物学中，嵌合抗原受体（CARs）——也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体——是经过工程改造的受体蛋白质，赋予T细胞靶向特定抗原的新能力。这些受体具有嵌合特性，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能结合在一个单一受体中。
CAR T细胞疗法利用经过CAR工程改造的T细胞来治疗癌症。T细胞被改造以识别并摧毁癌细胞。标准方法是从患者体内采集T细胞，进行基因改造，然后将改造后的CAR T细胞回输到患者体内，以攻击其肿瘤。
CAR T细胞可以来源于患者自身血液中的T细胞（自体）或供体的T细胞（异体）。一旦分离，这些T细胞通过源自工程化慢病毒（如HIV）的载体进行基因工程改造，以表达特定的CAR（参见基因治疗中的慢病毒载体）。CAR使T细胞靶向肿瘤细胞表面存在的抗原。出于安全考虑，CAR T细胞被设计为特异性靶向仅在肿瘤细胞上表达而不在健康细胞上表达的抗原。
改造后的T细胞回输到患者体内后，作为对抗癌细胞的"活体药物"发挥作用。当它们与细胞表面的靶向抗原接触时，T细胞与之结合并被激活，随后增殖并成为细胞毒性细胞。CAR T细胞通过多种机制摧毁细胞，包括广泛刺激的细胞增殖、增加对其他活细胞的毒性（细胞毒性），以及增加分泌影响其他细胞的因子，如细胞因子、白细胞介素和生长因子。
CAR T细胞表面可以携带两种类型的共受体中的一种，CD4和CD8。这两种细胞类型分别称为CD4+和CD8+，具有不同且相互作用的细胞毒性效应。采用1:1比例的细胞类型疗法显然提供了协同抗肿瘤效应。
历史
首个包含抗体部分和T细胞受体的嵌合受体由日本藤田保健卫生大学和协和发酵工业株式会社的桑中义久（Yoshihisa Kuwana）等人于1987年描述，并由以色列魏茨曼科学研究所的Gideon Gross和Zelig Eshhar于1989年独立描述。这些早期方法最初被称为"T-体"，将抗体特异性结合多样靶标的能力与TCR-α或TCR-β蛋白的恒定结构域结合起来。
1991年，加利福尼亚大学旧金山分校的Arthur Weiss展示了包含CD3ζ胞内信号域的嵌合受体可激活T细胞信号。这项工作促使CD3ζ胞内域被添加到具有抗体样胞外域的嵌合受体中，通常为单链可变片段（scFv）域，以及CD4等蛋白质，随后被称为第一代CAR。
包含CD4胞外域和CD3ζ胞内域的第一代CAR在1990年代中期由生物技术公司Cell Genesys用于首个嵌合抗原受体T细胞临床试验，使过继转移的T细胞能够靶向感染HIV的细胞，尽管未能显示出任何临床改善。1990年代使用靶向MUC1等实体瘤抗原的第一代CAR对实体瘤进行的类似早期临床试验未能显示转移T细胞的长期持续存在或导致显著缓解。
2000年代初期，共刺激域如CD28或4-1BB被添加到第一代CAR的CD3ζ胞内域中。被称为第二代CAR的这些构建体在临床前模型中显示出更大的持续性和改善的肿瘤清除能力。2010年代初期，美国国家癌症研究所、宾夕法尼亚大学和纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究人员使用靶向CD19（正常B细胞以及B细胞白血病和淋巴瘤表达的蛋白质）的第二代CAR进行的临床试验证明了CAR T细胞疗法的临床疗效，并在许多经过大量预处理的患者中实现了完全缓解。这些试验最终在美国导致FDA于2017年首次批准两种CAR T细胞疗法：诺华公司最初用于B细胞前体急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的tisagenlecleucel（Kymriah），以及吉利德/Kite Pharma最初用于弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）。目前已有六种FDA批准的CAR T疗法。
生产
CAR T细胞生产的第一个步骤是从人血液中分离T细胞。CAR T细胞可以从患者自身血液（称为自体治疗）或健康供体的血液（称为异体治疗）制造。在两种情况下，制造过程相同；仅初始血液供体的选择不同。
首先，使用血细胞分离器通过称为白细胞单采术的过程分离白细胞。然后分离并收集外周血单核细胞（PBMCs）。白细胞单采术的产品随后被转移到细胞处理中心。在细胞处理中心，特定T细胞被刺激以使其活跃增殖并扩大到大量数量。为了促进其扩增，T细胞通常用细胞因子白细胞介素2（IL-2）和抗CD3抗体处理。一些方案中也使用抗CD3/CD28抗体。
扩增的T细胞被纯化，然后通过逆转录病毒载体（通常是整合型γ-逆转录病毒（RV）或慢病毒（LV）载体）转导表达工程化CAR的基因。由于U3区域的部分缺失，现代这些载体非常安全。新型基因编辑工具CRISPR/Cas9最近被用于替代逆转录病毒载体，将CAR基因整合到基因组的特定位置。
在引入工程化CAR T细胞之前，患者接受淋巴细胞清除化疗。患者循环白细胞数量的减少上调产生的细胞因子数量并减少资源竞争，这有助于促进工程化CAR T细胞的扩增。
临床应用
截至2019年3月，全球约有364项正在进行的CAR T细胞临床试验。其中大多数试验针对血液癌症：CAR T疗法占血液系统恶性肿瘤所有试验的一半以上。CD19仍然是最受欢迎的抗原靶标，其次是多发性骨髓瘤中常见表达的BCMA。2016年，研究开始探索其他抗原（如CD20）的可行性。实体瘤试验较少由CAR T主导，约一半的细胞疗法试验涉及NK细胞等其他平台。
癌症
T细胞经过基因工程改造以表达特异性针对患者肿瘤细胞上抗原的嵌合抗原受体，然后回输到患者体内，攻击并杀死癌细胞。表达CAR的T细胞的过继转移是一种有前途的抗癌治疗方法，因为CAR修饰的T细胞可以被设计为靶向潜在的任何肿瘤相关抗原。
早期CAR T细胞研究集中在血液癌症上。首批批准的治疗方法使用靶向CD19抗原的CAR，该抗原存在于B细胞衍生的癌症中，如急性淋巴细胞白血病（ALL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。还正在进行努力设计靶向许多其他血液癌症抗原的CAR，包括难治性霍奇金淋巴瘤中的CD30；急性髓系白血病（AML）中的CD33、CD123和FLT3；以及多发性骨髓瘤中的BCMA。除CD19外，靶向多发性骨髓瘤抗原B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR已取得最显著的临床成功。Robert Carpenter和James Kochenderfer等人首次报告了靶向BCMA的CAR。抗BCMA CAR T细胞现已在许多临床试验中进行测试，抗BCMA CAR T细胞产品已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。
CAR T细胞也被发现对治疗胶质母细胞瘤有效。单次输注足以在数天内显示快速肿瘤消退。
实体瘤呈现了更具挑战性的靶标。良好抗原的识别一直具有挑战性：此类抗原必须在大多数癌细胞上高度表达，但在正常组织上基本不存在。CAR T细胞也不能有效迁移到实体瘤质量的中心，且具有敌意的肿瘤微环境抑制T细胞活性。
自身免疫疾病
虽然大多数CAR T细胞研究集中在创建能够根除特定细胞群的CAR T细胞上（例如，靶向淋巴瘤细胞的CAR T细胞），但这项技术还有其他潜在用途。T细胞也可以介导对抗原的耐受性。配备CAR的调节性T细胞可能具有赋予对特定抗原耐受性的潜力，这可用于器官移植或狼疮等风湿病。
已批准的疗法
获得监管批准的CAR T细胞疗法 CAR T细胞（品牌名） 公司 批准机构：日期 靶标 抗原识别域 胞内信号域 适应症（靶向疾病/治疗线） 机构产品编号，药品标签 tisagenlecleucel（Kymriah）
诺华 FDA：2017年8月30日
EMA：2018年8月22日
日本厚生劳动省（MHLW）：2019年5月15日
CD19 scFV 41BB - CD3ζ B细胞前体ALL（第三线）
弥漫性大B细胞淋巴瘤（第三线）
滤泡性淋巴瘤（第三线）
FDA：125646，标签
EMA：004090，标签
axicabtagene ciloleucel（Yescarta）
Kite Pharma / 吉利德 FDA：2017年10月18日
EMA：2018年8月27日
中国国家药品监督管理局（NMPA）：2021年6月23日
日本厚生劳动省（MHLW）：2022年12月22日
CD19 scFV CD28 - CD3ζ 弥漫性大B细胞淋巴瘤（第二线）
滤泡性淋巴瘤（第三线）
纵隔大B细胞淋巴瘤（第三线）
FDA：125643，标签
EMA：004480，标签
brexucabtagene autoleucel（Tecartus）
Kite Pharma / 吉利德 FDA：2020年7月24日
EMA：2020年12月14日
CD19 scFV CD28 - CD3ζ 套细胞淋巴瘤（第三线）
B细胞前体ALL（第三线）
FDA：125703，标签
EMA：005102，标签
lisocabtagene maraleucel（Breyanzi）
Juno Therapeutics / 百时美施贵宝 FDA：2021年2月5日
EMA：2022年4月4日
日本厚生劳动省（MHLW）：2022年12月20日
CD19 scFV 41BB - CD3ζ 弥漫性大B细胞淋巴瘤（第二线） FDA：25714，标签
EMA：004731，标签
idecabtagene vicleucel（Abecma）
Bluebird Bio / 百时美施贵宝 FDA：2021年3月26日
EMA：2021年8月18日
BCMA scFV 41BB - CD3ζ 多发性骨髓瘤（第四线），（第三线） FDA：125736，标签
EMA：004662，标签
ciltacabtagene autoleucel（Carvykti）
强生 / 杨森 FDA：2022年2月28日
EMA：2022年5月25日
BCMA VHH 41BB - CD3ζ 多发性骨髓瘤（第四线），（第二线） FDA：125746，标签
EMA：005095，标签
obecabtagene autoleucel（Aucatzyl）
Autolus FDA：2024年11月8日 CD19 scFV 41BB - CD3ζ B细胞前体ALL（第三线） FDA：125813，标签
安全性
CAR T细胞引入体内会导致严重的副作用，包括细胞因子释放综合征和神经毒性。由于这是一种相对较新的治疗方法，关于CAR T细胞疗法长期效应的数据很少。人们对长期患者生存率以及接受CAR T细胞治疗的女性患者的妊娠并发症仍存有担忧。由于CAR由外来单克隆抗体制成，因此可能会引起过敏反应，从而引发免疫反应。
靶向/脱靶识别发生在CAR T细胞识别正确抗原，但该抗原在健康、非致病组织上表达时。这导致CAR T细胞攻击非肿瘤组织，例如表达CD19的健康B细胞导致B细胞发育不全。这种不良反应的严重程度可能有所不同，但先前的免疫抑制、淋巴清除化疗和靶向效应导致的低丙种球蛋白血症和长期细胞减少症的组合使患者面临严重感染风险增加。建议在CAR T细胞治疗前进行全面的牙科评估和治疗，以降低中性粒细胞减少期口腔和全身感染的风险。
还有不太可能的情况是，工程化的CAR T细胞本身通过插入突变转化为癌细胞，因为病毒载体将CAR基因插入宿主T细胞基因组中的肿瘤抑制因子或致癌基因中。一些逆转录病毒（RV）载体的风险低于慢病毒（LV）载体。然而，两者都有致癌潜力。已建立CAR插入位点在T细胞中的基因组测序分析，以更好地了解CAR T细胞在体内的功能和持续性。
细胞因子释放综合征
治疗后最常见的问题是细胞因子释放综合征（CRS），这是一种免疫系统被激活并释放增加的炎性细胞因子数量的状况。该综合征的临床表现类似于脓毒症，表现为高热、疲劳、肌痛、恶心、毛细血管渗漏、心动过速和其他心脏功能障碍、肝功能衰竭和肾功能损害。几乎所有接受CAR T细胞治疗的患者都会发生CRS；事实上，CRS的存在是表明CAR T细胞按预期工作以杀死癌细胞的诊断标志。CRS的严重程度与治疗反应增加无关，而是与更高的疾病负担相关。严重的细胞因子释放综合征可以通过免疫抑制剂如皮质类固醇以及抗IL-6单克隆抗体tocilizumab进行管理。多项研究表明，早期使用tocilizumab干预可降低严重CRS的发生频率，而不会影响治疗的治疗效果。一种旨在改善CRS的新策略是基于CAR T细胞表面同时表达人工非信号IL-6受体。这种结构通过螯合中和巨噬细胞来源的IL-6，从而降低CRS的严重程度，而不干扰CAR T细胞本身的抗肿瘤能力。
免疫效应细胞相关神经毒性
神经毒性也经常与CAR T细胞治疗相关。其潜在机制了解甚少，可能与CRS相关也可能不相关。临床表现包括谵妄、表达性失语（仍能理解语言但部分丧失连贯说话能力）、警觉性降低（意识模糊）和癫痫发作。在一些临床试验中，发生了由神经毒性导致的死亡。神经毒性死亡的主要原因是脑水肿。Juno Therapeutics, Inc.进行的一项研究中，试验中登记的五名患者死于脑水肿。两名患者仅接受环磷酰胺治疗，其余三名患者接受环磷酰胺和氟达拉滨的联合治疗。在Fred Hutchinson癌症研究中心赞助的另一项临床试验中，有一例在CAR T细胞给药后122天发生不可逆转且致命的神经毒性的报告。
在多发性骨髓瘤的BCMA-嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗中，观察到运动迟缓运动障碍（帕金森症，或运动和神经认知治疗引起的不良事件）。
嵌合抗原受体结构
嵌合抗原受体将正常T细胞激活的多个方面结合到单一蛋白质中。它们将胞外抗原识别域与胞内信号域连接起来，当结合抗原时激活T细胞。CAR由四个区域组成：抗原识别域、胞外铰链区、跨膜域和胞内T细胞信号域。
抗原识别域
抗原识别域暴露于细胞外部，位于受体的胞外域部分。它与潜在靶分子相互作用，并负责将CAR T细胞靶向到表达匹配分子的任何细胞上。
抗原识别域通常源自连接在一起作为单链可变片段（scFv）的单克隆抗体的可变区域。scFv是由免疫球蛋白的轻链（VL）和重链（VH）组成的嵌合蛋白，通过短连接肽连接。这些VL和VH区域预先选择用于其对靶抗原（如CD19）的结合能力。两条链之间的连接子由亲水性残基组成，包含甘氨酸和丝氨酸的片段以增加灵活性，以及谷氨酸和赖氨酸的片段以增加溶解性。单域抗体（如VH、VHH、VNAR）已被设计并开发为CAR格式中的抗原识别域，因为它们在T细胞中具有高转导效率。
除抗体片段外，非抗体方法也已用于指导CAR特异性，通常利用通常相互结合的配体/受体对。细胞因子、先天免疫受体、TNF受体、生长因子和结构蛋白都已成功用作CAR抗原识别域。
铰链区
铰链，也称为间隔区，是位于抗原识别区域和细胞外膜之间的小结构域。理想的铰链增强了scFv受体头部的灵活性，减少了CAR与其靶抗原之间的空间限制。这促进了抗原结合和CAR T细胞与靶细胞之间的突触形成。铰链序列通常基于来自其他免疫分子（包括IgG、CD8和CD28）的膜近端区域。
跨膜域
跨膜域是一个结构组件，由跨越细胞膜的疏水性α螺旋组成。它将CAR锚定在质膜上，连接胞外铰链和抗原识别域与胞内信号区域。该域对受体整体的稳定性至关重要。通常，使用来自内域中最膜近端组分的跨膜域，但不同的跨膜域导致不同的受体稳定性。CD28跨膜域已知可产生高表达、稳定的受体。
不建议使用CD3-zeta跨膜域，因为它可能导致人工TCR整合到天然TCR中。
胞内T细胞信号域
胞内T细胞信号域位于受体的内域，位于细胞内部。当抗原与外部抗原识别域结合后，CAR受体聚集在一起并传递激活信号。然后受体的内部细胞质末端在T细胞内延续信号。
正常T细胞激活依赖于存在于CD3-zeta胞质域中的免疫受体酪氨酸基于激活基序（ITAMs）的磷酸化。为了模拟这一过程，CD3-zeta的胞质域通常用作CAR内域的主要组件。其他含ITAM的域也已尝试，但效果不佳。
T细胞还需要共刺激分子以及CD3信号才能在激活后持续存在。因此，CAR受体的内域通常还包括一个或多个共刺激蛋白的嵌合域。已成功测试了来自多种共刺激分子的信号域，包括CD28、CD27、CD134（OX40）和CD137（4-1BB）。
所使用的胞内信号域定义了CAR T细胞的代。第一代CAR仅包含CD3-zeta胞质域。第二代CAR添加了共刺激域，如CD28或4-1BB。这些胞内信号域的参与改善了T细胞增殖、细胞因子分泌、抗凋亡性和体内持续性。第三代CAR结合了多个共刺激域，如CD28-41BB或CD28-OX40，以增强T细胞活性。临床前数据显示，与第二代CAR相比，第三代CAR表现出改善的效应功能和更好的体内持续性。
研究方向
抗原识别
尽管CAR T细胞疗法在所有患者中的初始临床缓解率高达90%，但长期生存率要低得多。原因通常是出现不表达CD19的白血病细胞，从而逃避CD19–CAR T细胞的识别，这种现象称为抗原逃逸。开发具有双重靶向CD19加CD22或CD19加CD20的CAR T细胞的临床前研究显示出前景，研究双特异性靶向以规避CD19下调的试验正在进行中。
2018年，开发了一种称为SUPRA CAR（分裂、通用和可编程）的CAR版本。可以部署多种机制来精细调节SUPRA CAR的活性，限制过度激活。与传统CAR设计相比，SUPRA CAR允许靶向多种抗原，而无需进一步基因改造人的免疫细胞。
通过给予所需抗原特异性适配体的混合物，可以实现对抗原异质性肿瘤的治疗。
CAR T功能
第四代CAR（也称为TRUCKs或装甲CAR）进一步添加了增强T细胞扩增、持续性和抗肿瘤活性的因素。这可能包括细胞因子，如IL-2、IL-5、IL-12和共刺激配体。
控制机制
向工程化T细胞添加合成控制机制允许医生精确控制患者体内T细胞的持续性或活性，目的是减少毒性副作用。主要控制技术触发T细胞死亡或限制T细胞激活，通常通过可以按需引入或停止的单独药物来调节T细胞。
自杀基因：基因改造的T细胞被设计为包含一个或多个可在细胞外分子激活时诱导凋亡的基因。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和诱导型caspase 9（iCasp9）是已整合到CAR T细胞中的两种类型的自杀基因。在iCasp9系统中，自杀基因复合物有两个元素：对小分子rimiducid/AP1903具有高特异性的突变FK506结合蛋白，以及编码原结构域缺失的人caspase 9的基因。给予患者rimiducid激活自杀系统，导致基因改造T细胞快速凋亡。尽管HSV-TK和iCasp9系统在临床试验中都显示出作为安全开关的明显功能，但一些缺陷限制了它们的应用。HSV-TK来源于病毒，可能对人类具有免疫原性。目前尚不清楚自杀基因策略是否能在所有情况下快速发挥作用，以阻止危险的脱靶细胞毒性。
双抗原受体：CAR T细胞被设计为同时表达两种肿瘤相关抗原受体，降低T细胞攻击非肿瘤细胞的可能性。据报道，双抗原受体CAR T细胞副作用较轻。小鼠体内研究表明，双受体CAR T细胞有效根除了前列腺癌并实现了完全长期生存。
ON开关和OFF开关：在此系统中，只有在存在肿瘤抗原和良性外源分子的情况下，CAR T细胞才能发挥作用。为实现这一点，CAR T细胞的工程化嵌合抗原受体被分裂成两个必须结合在一起才能发挥作用的独立蛋白质。第一个受体蛋白通常包含胞外抗原结合域，而第二个蛋白包含下游信号元件和共刺激分子（如CD3ζ和4-1BB）。在外源分子（如雷帕霉素类似物）存在下，结合和信号蛋白二聚化，允许CAR T细胞攻击肿瘤。人EGFR截短形式（hEGFRt）已用作使用西妥昔单抗的CAR T细胞的OFF开关。
作为开关的双特异性分子：双特异性分子靶向肿瘤相关抗原和T细胞表面的CD3分子。这确保T细胞只有在与肿瘤细胞物理接近时才能被激活。抗CD20/CD3双特异性分子在小鼠中对恶性B细胞和癌细胞显示出高特异性。FITC是此策略中使用的另一种双功能分子。FITC可以重定向和调节FITC特异性CAR T细胞对具有叶酸受体的肿瘤细胞的活性。
CAR T细胞制造的进展
由于CAR T细胞疗法的高成本，正在研究多种替代方法以改进CAR T细胞制造并降低成本。正在测试体内CAR T细胞制造策略。此外，已开发用于CAR T细胞生成的生物指导材料。通过缩短或消除激活和扩增步骤，也可以快速生成CAR T细胞。
原位修饰
另一种方法是使用病毒载体在体内修改T细胞和/或B细胞。
替代激活域
CAR T细胞疗法的最新进展集中在替代激活域上，以增强实体瘤的疗效并克服耐药性。例如，可以将Toll样受体4（TLR4）信号组件整合到CAR构建体中，以调节细胞因子产生并增强T细胞激活和增殖，从而增强CAR T细胞扩增和持续性。同样，FYN激酶（参与T细胞受体信号传导的Src家族激酶成员）可以整合以改善CAR T细胞内的信号级联，从而更好地靶向和消除癌细胞。此外，基于KIR的CARs（KIR-CAR），使用激活受体KIR2DS2的跨膜和胞内域与DAP-12信号适配器结合，显示出改善的T细胞增殖和抗肿瘤活性。包括使用非常规共刺激分子（如MyD88/CD40）在内的这些策略，突显了为优化CAR T细胞疗法以实现更有效的癌症治疗所采取的创新方法。
经济学
CAR T细胞疗法的成本受到批评，tisagenlecleucel（Kymriah）和axicabtagene ciloleucel（Yescarta）的初始成本分别为37.5万美元和47.5万美元。CAR T疗法的高成本是由于在专业良好生产规范（GMP）设施中进行的复杂细胞制造以及由于细胞因子释放综合征等风险而在CAR T细胞给药后所需的高水平医院护理。在美国，CAR T细胞疗法由医疗保险（Medicare）和许多但并非所有私人保险公司承保。由于CAR T疗法的高成本，CAR T细胞制造商已开发替代支付计划，例如仅在CAR T疗法在治疗后特定时间点诱导完全缓解时才要求付款。
此外，CAR T细胞疗法尚未在全球范围内提供。CAR T细胞疗法已在中国、澳大利亚、新加坡、英国和一些欧洲国家获得批准。2022年2月，巴西批准了tisagenlecleucel（Kymriah）治疗。
作为降低CAR T细胞疗法复杂性和成本的有前景策略，在体内CAR T细胞疗法最近出现。这种方法涉及将CAR编码的遗传物质直接递送到患者T细胞中，通常通过功能化病毒载体或靶向纳米载体，消除了体外细胞收获、分离、修饰、扩增和再输注的必要性。目前有多种递送平台正在研究中，包括脂质纳米颗粒、外泌体和聚合物纳米载体，以及由哥伦比亚细胞工程与治疗计划或Interius BioTherapeutics、Umoja Biopharma或EsoBiotec等生物技术公司开发的病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒（AAV）。相关潜在风险包括精确T细胞靶向的挑战、脱肿瘤靶向（OTOT）毒性或持续CAR表达的问题。然而，在体内CAR T疗法可能会减轻经典体外CAR T疗法的某些系统毒性风险，如细胞因子释放综合征（CRS）或免疫效应细胞相关神经毒性（ICANS）。除了估计比经典体外CAR疗法"降低一个数量级"的成本外，在体内CAR T细胞转染的最大潜在优势是时间线的减少，因为在美国20%的患者在CAR T细胞疗法生产完成前死亡。
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