目前尚无针对透明细胞卵巢癌（CCC）的有效治疗方法。本研究旨在通过使用卵巢癌类器官的高通量药物筛选（HTDS）识别有效的CCC药物，并基于CCC的生物学特性结合组学分析确定新的治疗靶点。建立了卵巢癌类器官生物库，并基于361种和4,560种化合物库对CCC类器官进行了HTDS。通过患者来源的类器官异种移植小鼠模型验证了所识别药物在体外和体内的疗效。进行转录组分析以识别与CCC中目标药物相关通路的基因，并评估其作为治疗靶点的潜力。通过HTDS提取出蛋白酶体抑制剂和Dinaciclib，并显示其在体外和体内均能抑制肿瘤发生。CCC像多发性骨髓瘤一样表现出激活的内质网（ER）应激和未折叠蛋白反应（UPR），并且用蛋白酶体抑制剂处理进一步增强了ER应激和UPR，最终导致细胞死亡。转录组分析确定前梯度-2（AGR2）是CCC中参与UPR的关键基因。CRISPR敲除AGR2抑制了细胞增殖，增加了对蛋白酶体抑制剂的敏感性，并逆转了CCC的铂类耐药性。AGR2敲除还上调了Schlafen 11，促成了铂类敏感性。ER应激和UPR在CCC中被激活，而蛋白酶体抑制剂破坏这种平衡，最终导致细胞死亡。AGR2可能成为CCC的潜在治疗靶点。
蛋白酶体抑制剂和Dinaciclib被确定为有效的CCC药物。CCC具有较高的基础UPR，而蛋白酶体抑制可能会破坏这种平衡。AGR2参与CCC的UPR，抑制AGR2进一步增强UPR并赋予铂类敏感性，使其成为潜在的治疗靶点。
建立CCC类器官生物库
截至2022年6月，成功建立了57个卵巢癌类器官（包括交界性肿瘤）和16个良性组织类器官（14个正常输卵管类器官、一个正常卵巢表面上皮类器官和一个子宫内膜异位囊肿）。其中，15个来源于CCC，11个CCC类器官专门用于本研究。9个CCC类器官和7个高级别浆液性癌（HGSC）类器官的转录组分析表明，CCC类器官具有独特的CCC特征，与HGSC类器官或正常卵巢相比显著不同。对11个CCC类器官的外显子组测序显示，四个类器官同时具有PIK3CA和ARID1A突变，三个具有ARID1A突变但没有PIK3CA突变，两个既没有PIK3CA也没有ARID1A突变，反映了CCC已知的突变特征。由此，我们建立的CCC类器官生物库被认为能反映现实世界中CCC的特征，包括主要基因突变的存在与否。值得注意的是，19-042病例（预后较差）衍生的类器官未表现出PIK3CA或ARID1A突变。
使用CCC类器官进行HTDS
使用384孔板的类器官HTDS平台如图2A所示。对361种药物的存活率分析进行了两次，在两个CCC类器官18-015和19-044中显示出一致的结果，验证了HTDS的可靠性。在测试的361种化合物中，YM155、星形孢菌素、哇巴因、硼替佐米（Velcade, PS-341）、葫芦素I、Cdk2/9抑制剂、布雷非德菌素A和阿霉素被确定为候选药物，在六个CCC类器官中使对照组存活率降低至不到30%。随后，对八种候选化合物（YM155、星形孢菌素、哇巴因、硼替佐米、葫芦素I、Cdk2/9抑制剂、布雷非德菌素A和阿霉素）在九个CCC类器官上进行了药物敏感性测试。所有化合物在IC50水平低于1 μmol/L时对CCC类器官均表现出细胞毒性效果。值得注意的是，硼替佐米在所有九个CCC类器官中均表现出强效的细胞毒性（IC50 < 0.02 μmol/L）。
为进一步研究针对CCC的有效药物，进行了使用4,560种化合物的L1700 Bioactive Compound Library的HTDS。对两个CCC类器官（18-015和19-042）进行的HTDS识别出在这两种类器官中均有效的103种药物，导致存活率相较于对照组降低至不到30%。候选药物包括11种微管相关药物（如卡巴他赛、秋水仙碱、长春瑞滨和长春碱）、9种拓扑异构酶抑制剂（如喜树碱、阿霉素、表柔比星和SN-38）、8种蛋白酶体抑制剂（PI）、6种HSP抑制剂、4种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（达西诺司他、帕诺比司他、奎辛诺司他和CUDC-907）。在测试的PI中，硼替佐米、卡非佐米、地拉佐米、环氧霉素、伊沙佐米、伊沙佐米柠檬酸盐、MG-132和奥普罗佐米相较于对照组显示出强烈的细胞毒性。
蛋白酶体抑制剂和Dinaciclib在体外和体内均对CCC表现出疗效
蛋白酶体抑制剂在筛查测试中表现出强烈活性，包括361种药物筛选和4,560种药物筛选。随后，我们对FDA批准的多种骨髓瘤药物（包括硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米）进行了药物敏感性测试。Dinaciclib在4,560种药物筛选中被识别为候选药物，也进行了研究，因为Cdk（Cdk1、2、5、9和12）抑制剂Dinaciclib在多发性骨髓瘤中被报道为有希望的单一药物，且Cdk2/9抑制剂在CCC类器官中表现出疗效。硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米在九个CCC类器官中均表现出强大活性。Dinaciclib也对CCC类器官表现出疗效，IC50值小于20 nmol/L。紫杉醇在大多数CCC类器官中表现出疗效，但19-076除外，而顺铂在所有CCC类器官中均无效。此外，所有测试的六个CCC类器官均对卡铂耐药。使用19-042建立的PDOX小鼠模型表现出与其原始肿瘤一致的病理特征，并显示肝细胞核因子1β阳性。在PDOX模型中，硼替佐米治疗显著减少了肿瘤生长，且未引起小鼠体重减轻（肿瘤体积P = 0.004，肿瘤重量P = 0.013）。同样，Dinaciclib在体内也表现出抗肿瘤效果，且未影响小鼠体重（肿瘤体积P = 0.093，肿瘤重量P = 0.030）。蛋白酶体抑制剂和Dinaciclib对CCC类器官的效果在体外和体内均得到了验证。
硼替佐米诱导未折叠蛋白反应
蛋白酶体抑制剂目前用于治疗多发性骨髓瘤。PIs的作用机制之一是错误折叠和未折叠蛋白的积累，导致过量的ER应激并通过未折叠蛋白反应（UPR）引发细胞凋亡。PIs在多发性骨髓瘤治疗中的有效性归因于免疫球蛋白生产引起的ER应激反应中升高的UPR水平。CCC胞质不仅含有糖原，还包含许多细胞器，包括内质网，并在血栓形成可能性高等方面与多发性骨髓瘤相似，这被称为Trousseau综合征。为了研究多发性骨髓瘤和CCC之间的生物学相似性，我们检查了由三个单次跨膜蛋白启动的UPR通路，这些蛋白具有检测错误折叠蛋白的ER腔域：IRE1α、PERK和ATF6。
使用CCC、多发性骨髓瘤和正常卵巢数据库进行ssGSEA分析，结果显示CCC和多发性骨髓瘤中IRE1α通路和PERK通路相较于正常卵巢上调（IRE1α通路，多发性骨髓瘤：P < 2.22 × e−16，CCC：P = 0.062；PERK通路，多发性骨髓瘤：P < 2.22 × e−16，CCC：P < 2.9 × e−8）。特别是，CCC中PERK通路的激活程度高于多发性骨髓瘤。在CCC而非多发性骨髓瘤中，ATF6通路相较于正常卵巢显著上调（P < 2.22 × e−16）。此外，使用三种UPR通路的ssGSEA富集分数，我们在多个数据集中进行了PCA分析，包括CCC和多发性骨髓瘤。结果表明，CCC与多发性骨髓瘤的相似性高于HGSC或胰腺癌，这两种癌症也与Trousseau综合征相关。
用硼替佐米处理19-042 CCC类器官导致在明场显微镜下观察到暗色外观，并诱导了IRE1α、XBP1s和PERK表达，这是通过ER应激触发细胞死亡的关键效应因子。相比之下，Dinaciclib处理未导致暗色外观，它诱导了PERK和ATF6，但未诱导IRE1α和XBP1s。透射电子显微镜（TEM）显示，硼替佐米处理后ER腔显著扩张，证实了ER应激的诱导（10 nmol/L处理P = 0.55，50 nmol/L处理P < 0.001）。相反，Dinaciclib处理未观察到ER腔扩张（100 nmol/L处理P < 0.001，500 nmol/L处理P = 0.16）。此外，硼替佐米处理诱导了异常溶酶体。这些发现表明，硼替佐米上调ER应激和UPR，可能有助于CCC对PIs的反应机制。
AGR2作为CCC的治疗靶点
我们进一步研究了CCC类器官对PIs敏感性的潜在机制。包括PIs在内的候选药物及其与CCC类器官的IC50相关性如图5A所示。类器官18-015被认为相对抗PIs。由于IRE1α、PERK和ATF6通路在CCC中上调，我们研究了这些通路中的共享基因。在这些通路相关的基因集中，包括GOBP_IRE1介导的未折叠蛋白反应、GOBP_PERK介导的未折叠蛋白反应调节和GOBP_ATF6介导的未折叠蛋白反应，发现HSPA5、TMEM33、AGR2、PTPN11、XBP1和WFS1至少在两条通路中共享。值得注意的是，AGR2表达在硼替佐米敏感和抗性CCC类器官之间差异显著（P = 0.0049）。对UPR相关基因的转录组分析显示，与其他八个CCC类器官相比，18-015中AGR2表达显著上调。AGR2是ER驻留蛋白二硫键异构酶家族的一员，受ER应激诱导并在维持ER稳态中发挥作用。发现18-015类器官中AGR2蛋白水平较低。有趣的是，IRE1α、PERK和ATF6通路中其他蛋白的表达水平与硼替佐米敏感性无关。
接下来，我们研究了AGR2在CCC类器官中的作用。AGR2 CRISPR敲除显著抑制了生长。AGR2-KO类器官显示G2-M期群体显著增加（P = 0.028）。然而，在AGR2低表达的CCC类器官（18-015）中，AGR2敲除并未影响细胞生长。这表明AGR2依赖性在AGR2高表达的CCC中存在，但在AGR2低表达的CCC中不存在。
接下来，研究了AGR2敲除对PI敏感性的影响。AGR2-KO CCC类器官对硼替佐米表现出更高的敏感性（不同克隆的P = 0.007和0.013）。在0.01 μmol/L硼替佐米浓度下，AGR2-KO类器官（克隆B和克隆C）的中位细胞存活率分别为0.1%和0.9%，而对照组类器官为36.4%。如图3C和补充图S1所示，CCC类器官均对顺铂或卡铂耐药。然而，AGR2-KO CCC类器官表现出对卡铂的敏感性（不同克隆的P = 0.010和0.010）。在10 μmol/L卡铂浓度下，AGR2-KO类器官（克隆B和克隆C）的中位细胞存活率分别为64.2%和42.8%，而对照组类器官则保持了显著更高的活力（96.3%）。这些发现表明，AGR2在CCC中上调，可以作为潜在的治疗靶点。
为进一步研究AGR2-KO类器官对硼替佐米和卡铂敏感性增加的机制，进行了转录组分析。AGR2-KO CCC类器官表现出SLFN11表达升高。SLFN11是一种推定的DNA/RNA解旋酶，可增强癌细胞对DNA损伤剂（如拓扑异构酶I/II抑制剂、烷化剂如卡铂和顺铂以及DNA合成抑制剂如吉西他滨）的敏感性。事实上，在癌症细胞系百科全书数据集中，AGR2表达与SLFN11表达呈负相关。AGR2-KO类器官中SLFN11蛋白水平的上调得到了确认。此外，AGR2-KO类器官表现出IRE1α、XBP1s、PERK、磷酸化eIF2α和ATF4表达增加，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。GSEA显示，与对照组相比，AGR2-KO类器官中UPR显著上调，特别是ATF6和IRE1α通路（UPR，P = 0.0022；ATF6，P = 0.00012；IRE1α，P = 0.00073），证实了AGR2-KO细胞中ER应激和UPR的增强。Ingenuity通路分析进一步证实了AGR2-KO CCC类器官中UPR通路的激活。此外，与对照组相比，AGR2-KO类器官表现出ER扩张（不同克隆的P < 0.001），表明AGR2-KO诱导了ER应激。这表明AGR2-KO诱导的ER应激增强可能有助于提高对硼替佐米的敏感性。AGR2敲除还抑制了Wnt-β-catenin信号传导、p53通路、上皮-间充质转化、Notch信号传导、凝血和缺氧，这些通路在CCC中相较于HGSC上调，表明AGR2抑制是CCC的一种有前景的治疗策略。
在AGR2表达低且对硼替佐米具有适度抗性的18-015类器官中，AGR2敲除导致AGR2丢失，但不影响细胞增殖、硼替佐米敏感性或SLFN11水平。IHC分析显示，CCC中AGR2表达显著高于HGSC（P < 0.001）。此外，AGR2对CCC的无进展生存期没有显著影响（P = 0.74）。由此推测，尽管AGR2表达通常在CCC中较高，但具有低AGR2表达的CCC亚群表现出与AGR2高表达CCC不同的生物学特征。
讨论
晚期或复发性CCC是一种毁灭性疾病，通常对传统的铂类化疗反应不佳。虽然CCC在西方国家卵巢癌中的比例较低，但在日本相对较高。造成这种差异的原因尚未完全理解，但可能归因于种族差异或环境因素。在CCC病例中，ARID1A突变存在于41.5%，而ARID1A表达缺失见于75.6%，表明ARID1A在CCC发病机制中起关键作用。研究探索了针对ARID1A缺失或突变的药物，包括影响谷胱甘肽代谢、EZH2、组蛋白去乙酰化酶、谷氨酰胺酶和甲羟戊酸途径的药物，这些药物显示出有希望的结果。此外，PIK3CA突变常见，发生在30%的CCC病例中，针对磷脂酰肌醇-3-激酶通路的疗法已被研究。我们的发现表明，无论ARID1A或PIK3CA突变如何，PIs在CCC类器官中均表现出有效性。
二肽硼酸类似物硼替佐米是一种强效、高度选择性和可逆的26S蛋白酶体复合物抑制剂。内质网负责分泌和跨膜蛋白的生物合成，蛋白质在此过程中进行折叠、糖基化和脂化。高分泌蛋白负荷、错误折叠蛋白的存在和糖基化受损等情况统称为“ER应激”，导致ER中错误折叠或未折叠蛋白的积累。作为对ER应激的响应，细胞触发一系列信号通路，称为UPR，最初旨在恢复细胞稳态，但如果应激持续，则会触发细胞凋亡。UPR的初始阶段涉及通过称为ER相关降解的过程促进未折叠蛋白从ER中移除。PIs抑制ER相关降解，导致未折叠蛋白积累并加剧ER应激。硼替佐米治疗激活多发性骨髓瘤细胞中的PERK和eIF2α磷酸化，随后诱导ATF4和CHOP。在CCC类器官中，硼替佐米还激活IRE1α、XBP1s、PERK和ATF4，最终触发凋亡通路。
PIs被用作多发性骨髓瘤的治疗药物，这是一种源自生发中心后B淋巴细胞的恶性肿瘤。多发性骨髓瘤的特点是过度产生和分泌免疫球蛋白，导致ER应激和ER中的蛋白质稳态破坏。多发性骨髓瘤细胞依赖UPR生存，因为它在多发性骨髓瘤细胞中高度活跃，并随着疾病进展变得更加明显。尽管UPR促进了多发性骨髓瘤细胞的存活和疾病进展，但暴露于外源性ER应激可以将促生存和促凋亡信号之间的平衡转向细胞死亡。我们的分析表明，UPR在CCC和多发性骨髓瘤中高度激活，甚至相较于HGSC或胰腺腺癌也是如此。此外，血栓栓塞在CCC患者中很常见，部分归因于组织因子水平升高和CCC细胞产生的富含组织因子的细胞外囊泡。CCC丰富的细胞质中含有许多细胞内细胞器，可能反映了它们丰富的蛋白质生产能力。CCC与多发性骨髓瘤之间的共同特征表明，PIs在CCC治疗中可能具有潜在的治疗益处。
据报道，硼替佐米激活cGAS/STING通路并诱导多发性骨髓瘤中的I型干扰素产生。免疫检查点抑制剂在某些CCC病例中表现出有效性，表明PIs与免疫检查点抑制剂的组合可能是CCC的一种有前景的治疗策略。
我们的HTDS揭示，PIs和Dinaciclib在体外和体内对CCC均有效。泛Cdk抑制剂Dinaciclib对铂敏感和耐药的卵巢癌细胞均表现出有效性，并且在卵巢癌中与顺铂具有协同作用。最近的一项研究表明，Dinaciclib在骨肉瘤患者来源的异种移植细胞系正位模型中显著减少转移负担。Cdk1/2/5/9表达，尤其是Cdk1，在Dinaciclib敏感的CCC类器官中更高（19-055、19-076和19-079：抗性vs其他六种敏感CCC类器官）。尽管统计学上不显著，但Cdk2/5/9也显示出低于0的log倍数变化值，表明在敏感类器官中有更高的表达趋势，进一步支持高表达这些Cdk的CCC可能受益于Dinaciclib治疗的观点。
我们确定AGR2是CCC中与UPR相关的基因。AGR2是一种在分泌粘液的细胞和内分泌组织中高度表达的ER驻留蛋白。AGR2已被证明促进癌细胞增殖、侵袭和对化疗的耐药性，并可能在调节ER适应生理应激能力中起关键作用。在食管Barrett上皮中，AGR2通过抑制p53在Ser15和Ser392位点的磷酸化充当p53抑制剂。在胰腺癌发生中，慢性ER应激导致一种炎症状态，与KRAS突变一起诱导AGR2表达并促进胰腺癌发展。我们的研究显示，CCC中AGR2表达显著高于HGSC，并且AGR2在AGR2高表达的CCC中起关键作用，而在AGR2低表达的CCC中作用较小。在AGR2高表达的CCC中，AGR2敲除诱导ER应激，突出AGR2在UPR稳态中的重要作用。最初，我们预测AGR2敲除会导致硼替佐米敏感性下降，因为高AGR2表达的CCC类器官对硼替佐米表现出高敏感性。然而，与我们的预期相反，AGR2敲除进一步增强了对硼替佐米的敏感性。这一观察结果表明，原本具有高AGR2表达以应对严重ER应激的类器官因AGR2敲除而暴露于更大的ER应激中，使其更容易受到硼替佐米诱导的ER应激介导的细胞死亡。这一假设得到了AGR2有助于维持ER稳态的发现以及我们结果的支持，显示AGR2-KO类器官中ER应激增强。
有趣的是，AGR2缺乏的CCC类器官对铂类药物表现出更高的脆弱性，这可能是由于SLFN11上调和Bcl-2下调所致。先前的研究表明，SLFN11阳性的CCC对铂类药物表现出更高的敏感性。AGR2调控SLFN11的机制尚不清楚，但SLFN11已被报道保护细胞免受由错误折叠蛋白引起的UPR诱导的细胞泛素化。因此，AGR2敲除后SLFN11的上调可能是UPR激活的结果。这些发现表明，AGR2可以作为高AGR2表达癌症的潜在治疗靶点。
本研究有几个局限性。在使用的11个卵巢CCC类器官中，只有三例为晚期（III期或更高），这可能不足以评估铂类敏感性。此外，尽管药物筛选中也识别出了Dinaciclib，但它未如图4C和D所示诱导ER应激。Dinaciclib对CCC细胞有效发挥细胞毒作用的机制需要进一步研究。
总之，UPR在CCC中升高，使其对PIs和Dinaciclib敏感，正如使用CCC类器官生物库进行的HTDS所证明的那样。AGR2在CCC中高度激活，抑制AGR2导致UPR增加，将平衡转向细胞凋亡并获得铂类敏感性，可能是由于SLFN11上调所致。
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