摘要
吡非尼酮是一种口服活性小分子，最近已在特发性肺纤维化（IPF）的大规模临床试验中进行了评估。IPF是一种致命性疾病，其特征是细胞外基质不受控制地沉积，导致肺功能进行性丧失。本综述描述了吡非尼酮在几种已明确特征的肺、肝、心脏和肾脏纤维化动物模型中的活性。在这些研究中，与治疗相关的纤维化减少与细胞因子和生长因子的调节相关，最常报道的效果是降低转化生长因子-β（TGF-β）。吡非尼酮在多种动物模型中表现出一致的抗纤维化活性，为吡非尼酮在肺纤维化以及可能具有显著纤维化成分的其他疾病中的临床特征提供了强有力的临床前依据。
纤维化是指细胞外基质（ECM）的异常沉积，伴随正常组织的进行性破坏，是多种器官慢性疾病的主要或促成因素。肺纤维化与多种弥漫性肺实质疾病相关，其中最常见的是特发性肺纤维化（IPF）和结节病[1]。心脏纤维化与慢性心力衰竭、心房颤动以及急性心肌梗死后的心脏重塑相关[2, 3]。肾纤维化与多种形式的慢性肾脏疾病相关，并与肾功能损害相关[4, 5]。肝纤维化与慢性乙型和丙型病毒感染以及非酒精性脂肪性肝炎相关[6]。每种情况都代表着重大的未满足医疗需求，需要对纤维化疾病的治疗进行大量研究和临床研究。
吡非尼酮（Esbriet®, Pirespa®）是一种口服活性小分子，包含修饰的苯基吡啶酮结构。吡非尼酮最广泛的临床研究是用于治疗IPF，这是一种慢性间质性肺疾病，其特征是细胞外基质不受调控的沉积，导致正常肺组织的不可逆破坏。诊断为IPF的患者通常经历进行性肺功能不全，大多数死于呼吸衰竭。诊断后的估计中位生存期约为3年[1]。美国IPF的估计患病率（90,000人）与发病率（30,000人）之比反映了这种不良预后[10]。
IPF是特发性间质性肺炎（IIPs）中最常见和最致命的一种，IIPs是一组异质性弥漫性肺实质疾病，根据临床、放射学和组织学特征进行诊断[1]。根据定义，IPF与其他IIPs的区别在于肺组织病理学中存在普通型间质性肺炎模式。
尽管IPF的发病机制尚未明确界定，但已提出并继续发展了几种假设，以响应对疾病更详细的表征[11-15]。在IPF发病机制的最普遍理论中，反复暴露于尚未定义的刺激导致肺泡上皮细胞损伤[12-14, 16]。活化的上皮细胞产生一系列细胞因子和生长因子（包括转化生长因子（TGF）-β、血小板衍生生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和肿瘤坏死因子（TNF）-α），启动成纤维细胞的迁移和增殖。在没有成功上皮修复的情况下，伤口愈合过程不能正常解决，建立了持续的纤维增生状态。这种状态的特征是肌成纤维细胞（IPF的标志性细胞）的存在和增殖、细胞外基质过度沉积以及基底膜完整性的丧失。持续的上皮细胞损伤和在肺部各处的启动导致IPF中观察到的弥漫性纤维化和时间异质性模式。检查IPF与对照患者之间分子差异的研究支持将IPF表征为一种活性细胞外基质沉积和重塑、上皮细胞活化、细胞因子、趋化因子和生长因子表达失调以及肌成纤维细胞增殖的疾病[17-21]。
本综述强调了临床前数据，证明吡非尼酮在肺、肝、心脏和肾脏纤维化动物模型中具有抗纤维化活性，以及对相关纤维化介质的影响。来自部分动物疗效研究的药代动力学数据显示，吡非尼酮的抗纤维化作用在临床达到的暴露水平下观察到，表明在动物模型中观察到的效果可能与吡非尼酮的临床药效学相关。在多种动物模型中观察到的强大的抗纤维化效应强烈支持吡非尼酮在IPF中的临床特征。
IPF临床试验概述
吡非尼酮在IPF中的最早临床研究是一项针对54名晚期疾病患者的开放标签同情使用试验，结果显示吡非尼酮耐受性良好，并可能稳定肺功能，这一结果值得进一步研究[22]。随后进行的一项针对107名日本IPF患者的随机、双盲、安慰剂对照试验在24周计划中期分析后提前终止，该分析发现安慰剂组中急性IPF加重的发生率增加[23]。第36周结果的最终分析显示，吡非尼酮对用力肺活量的平均变化和急性IPF加重的发生率有良好影响。这项研究之后进行了一项针对275名日本IPF患者的随机、双盲、安慰剂对照III期试验，其中吡非尼酮（1,800 mg·天⁻¹）显著降低了第52周用力肺活量的下降（p = 0.04）并改善了无进展生存期（p = 0.028）[24]。与II期试验的发现相反，两组在急性加重率方面没有观察到差异，这一终点未用于后续CAPACITY试验（见下文）的临床疗效评估。
吡非尼酮还在两项几乎相同的随机、双盲、安慰剂对照III期试验（研究004和研究006）中进行了评估，分别在澳大利亚、欧洲和北美招募了435名和344名患者（P. Noble及其同事，美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学；正在提交的手稿）[25]。在研究004中，吡非尼酮治疗（2,403 mg·天⁻¹）在第72周使预测用力肺活量百分比的平均下降相对减少了35%（吡非尼酮组和安慰剂组分别为-8.0%和-12.4%；p = 0.001）并改善了无进展生存期时间（风险比（HR）0.64，95% CI 0.44-0.95；p = 0.023）。在研究006中，第72周预测用力肺活量百分比的平均变化这一主要终点未达到（吡非尼酮组和安慰剂组分别为-9.0%和-9.6%；p = 0.501）；然而，在第24周（p<0.001）、第36周（p = 0.011）和第48周（p = 0.005）以及所有研究时间点的重复测量分析中观察到显著的吡非尼酮治疗效果（p = 0.007）。在汇总分析中，观察到预测用力肺活量百分比的平均变化有显著的吡非尼酮治疗效果（相对减少23%；-8.5%对比-11.0%；p = 0.005）、预测用力肺活量百分比的分类变化（p = 0.003）、6分钟步行测试距离的平均变化（相对差异31%；-52.8 m对比-76.8 m；p<0.001）和无进展生存期时间（HR 0.74，95% CI 0.57-0.96；p = 0.025）。最后，对IPF患者吡非尼酮所有三项III期临床试验中无进展生存期时间的独立荟萃分析，包括日本研究和多国CAPACITY研究（n = 1,046），报告了显著的总体治疗益处（HR 0.70，95% CI 0.56-0.88；p = 0.002）[26]。
较小的探索性临床研究还评估了吡非尼酮在Hermansky-Pudlak综合征[27]、局灶性节段性肾小球硬化[4, 28]、糖尿病肾病[29]和晚期肝病[30]中的效果。这些小型试验中的结果与系统性抗纤维化作用一致，可能值得进一步研究。
人体和非临床物种中的药代动力学
口服吡非尼酮迅速吸收，表现出高口服生物利用度和广泛分布。在禁食的老年成人中，口服给药后30分钟观察到血浆中的最大浓度（Cmax）[31]。与食物同服会延迟吸收并降低Cmax，但对总体暴露的影响相对适中[31]。禁食状态下Cmax的降低具有潜在的临床意义，因为急性吡非尼酮相关副作用与人体和非临床物种中的Cmax相关[31]。在非临床物种中也观察到类似的快速吸收[32, 33]，小鼠的放射测量研究显示在灌注良好的组织（包括肝、肾、心脏和肺）中广泛分布[34]。
吡非尼酮在健康成人中的终末半衰期约为2.5小时[31]。在人体和非临床物种中，吡非尼酮被广泛代谢。代谢的主要位点是吡啶酮环的5-甲基位置，导致5-羟甲基吡非尼酮和5-羧酸代谢物的逐步形成[31, 34]。5-羧酸代谢物占健康老年成人中回收剂量的95%[31]。来自人肝细胞组分和重组细胞色素P450（CYP）酶的体外实验结果表明，吡非尼酮主要由CYP1A2代谢，尽管多种其他CYP同工酶也参与代谢（InterMune, Inc., Brisbane, CA, USA; data on file）[35]。在人体和非临床物种中，主要排泄途径是通过尿液。在人体中，口服给药剂量的80%在尿液中回收[31]。吡非尼酮的快速代谢和消除与临床试验中每日三次口服给药的使用一致。
非临床物种中的功效研究通常将吡非尼酮作为饲料中的混合物连续给药（最常见的是0.5%）。将吡非尼酮作为饲料的0.4%组分口服给药给大鼠会导致相对恒定的血浆浓度。观察到的浓度与上述临床研究004中观察到的最小血浆浓度（Cmin）相似（InterMune, Inc.; data on file）[33]。
肺纤维化模型中的效果
博来霉素诱导的肺纤维化
博来霉素模型是肺纤维化的标准但不完美的模型。博来霉素给药导致氧化应激和急性炎症，随后发生肺纤维化[36, 37]。博来霉素模型的几种组织学特征与IPF相似，包括上皮细胞损伤伴反应性增生、基底膜损伤、类似纤维母细胞灶的纺锤形间质细胞簇以及间质性和肺泡内纤维化[37]。尽管这些纤维化病变类似于IPF，但博来霉素模型中的纤维化与人类疾病有几个关键区别，包括部分可逆性和对明确定义的损伤的快速发作和进展。此外，临床前物种中博来霉素模型的几种变体具有显著影响。博来霉素模型变体之间的两个重要区别包括：1）单次与多次博来霉素挑战的使用，多次给药导致更持久的纤维化；2）博来霉素的气管内给药，导致支气管中心性纤维化，与系统性（静脉内或腹腔内）给药相比，后者导致更类似于IPF中观察到的胸膜下纤维化[37]。总体而言，博来霉素模型继续是肺纤维化最常见的模型，尽管在评估潜在抗纤维化活性时应考虑实验系统和来自其他模型的支持数据。
几项研究证明了吡非尼酮在博来霉素肺纤维化模型中的效果（表1）[38-47]。Oku等人[38]研究了口服吡非尼酮在由重复静脉注射博来霉素引发的42天模型过程中的效果（表1和图2a）。通过口服灌胃给予吡非尼酮（30或100 mg·kg⁻¹·天⁻¹，分三次给药）最小化了早期肺水肿和肺病理，并在治疗与肺损伤同时开始时降低了羟脯氨酸积累。这些治疗效果与肺部促炎和促纤维化蛋白的正常化相关。在同一研究中，高剂量泼尼松龙（3或15 mg·kg⁻¹，每日一次）也降低了肺水肿和促炎蛋白，但与吡非尼酮不同，未降低纤维化或促纤维化蛋白。泼尼松龙在该模型中无法调节纤维化与先前发现一致，即泼尼松龙有效降低了与气管内博来霉素挑战相关的短暂支气管中心性纤维化，但未降低与系统性博来霉素给药相关的更持久的周围纤维化[56-58]。
为了评估吡非尼酮对已建立的纤维化过程的影响，作者进行了第二项研究，其中吡非尼酮给药在第15天开始（表1和图2b；H. Oku, Shionogi and Co. Ltd, Osaka, Japan; personal communication）。该模型中的动力学表征确定，到第15天炎症已经消退，纤维化已经建立并正在进展。尽管未评估肺细胞因子，但模型的其他技术方面保持不变。在这项研究中，通过口服灌胃给予30或100 mg·kg⁻¹·天⁻¹吡非尼酮（分三次给药）减轻了博来霉素诱导的肺羟脯氨酸含量和肺纤维化的增加，但未将纤维化降低到治疗开始时已建立的水平以下。延迟给予10、30和100 mg·kg⁻¹的吡非尼酮使博来霉素诱导的肺羟脯氨酸升高分别降低了30%、40%和60%。这些结果与预防性治疗观察到的30%、60%和70%的减少几乎无法区分[38]。平行药代动力学研究表明，两个有效剂量的吡非尼酮暴露低于用2,403 mg·天⁻¹治疗的IPF患者获得的暴露，这是上述临床研究004和006中给药的剂量。因此，吡非尼酮可以在临床相关暴露下显著减少已建立的博来霉素诱导纤维化过程的进展。
吡非尼酮的抗纤维化效果也在一系列由单次气管内给予博来霉素引发的较短持续时间的博来霉素模型中得到证明（表1）[40-44]。在这些研究中，预防性给予吡非尼酮（整个研究期间饲料中0.5%）显示出肺胶原含量的一致降低，其中部分研究还证明了胶原合成标记物（如脯氨酰羟化酶活性）[40-42]和胶原mRNA表达[42]的额外降低。其中三项研究证明了吡非尼酮相关显著降低的氧化应激标志物，包括脂质过氧化[40]、超氧化物歧化酶活性[40, 41]、髓过氧化物酶活性[40, 41]和丙二醛当量[42]。重要的是，Schelegle等人[44]证明，在21天模型中预防性吡非尼酮治疗（饲料中0.5%）使博来霉素诱导的肺羟脯氨酸增加减少了约70%，并保留了肺顺应性、总肺容量、用力肺活量和吸气容量的功能测量指标（图2c）。
移植诱导的肺纤维化
吡非尼酮在临床前肺同种异体移植物模型中还可有效减少移植后肺纤维化和功能障碍。慢性肺排斥，临床上表现为闭塞性细支气管炎，是一种慢性纤维化疾病，是肺移植长期幸存者死亡的重要原因。在临床前肺同种异体移植物模型中，纤维化在排斥和/或感染导致的损伤后发展，用纤维化组织替代肺实质，导致肺功能障碍和气道阻塞[45, 46]。
Liu等人[45]研究了预防性吡非尼酮方案（饲料中0.5%）在Sprague-Dawley和Lewis大鼠之间原位左肺移植模型中的效果（表1和图2d）[45]。吡非尼酮治疗显著降低了间质性和支气管周围纤维化，保留了肺泡/间质结构，并将同种异体移植物诱导的胶原含量增加减少了约45%。此外，吡非尼酮改善了移植肺的气道峰值压力升高。
Zhou等人[46]在小鼠异位气管同种异体移植物模型中证明了吡非尼酮的治疗效果（表1）。在该模型中，从BALB/c供体到C57BL/6受体的皮下气管移植导致移植组织的排斥，表现为呼吸上皮丧失、炎性细胞浸润、炎症、管腔内肉芽组织形成和纤维化，最终导致气道闭塞[46]。纤维化成分发展较慢，在第28天更为显著。在整个28天研究期间继续的预防性吡非尼酮治疗（饲料中0.5%）降低了胶原沉积、上皮细胞丧失和管腔内脱颗粒。此外，64%的未经治疗的同种异体移植物表现出气道被肉芽组织完全闭塞，而吡非尼酮治疗组中只有7%。在第9天或第16天开始并在第28天继续的治疗方案未能提供可证明的益处。总体而言，这些研究表明，吡非尼酮在肺模型中的抗纤维化效果不仅限于由博来霉素等化学损伤引起的纤维化。
过敏原诱导的气道重塑
Hirano等人[47]在过敏原诱导的气道功能障碍的短期和长期模型中证明了吡非尼酮的抗纤维化和抗炎效果。反复暴露于过敏原可诱导慢性炎症并导致气道重塑，包括上皮下纤维化、肌成纤维细胞增生、平滑肌增殖和血管变化。在过敏原诱导的气道功能障碍的短期动物模型中，小鼠通过两次腹腔注射（第0天和第14天）对过敏原（佐剂配制的卵清蛋白；OVA）致敏，随后用气溶胶化的相同过敏原重复挑战（第28、29和30天）。在第26-31天给予吡非尼酮（125、250和500 mg·kg⁻¹，皮下注射）显著降低了乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性（AHR；500 mg·kg⁻¹剂量），并以剂量依赖性方式降低了支气管肺泡灌洗（BAL）细胞计数、生长因子和细胞因子。在长期模型中观察到气道重塑，包括上皮下纤维化和支气管周围平滑肌层增厚，其中初始致敏后约5周内，动物每周接受三次雾化OVA（第26-59天；表1和图2e）。在该模型中，整个雾化OVA挑战期间给予吡非尼酮治疗（500 mg·kg⁻¹·天⁻¹，皮下注射）在短期模型中对AHR、细胞计数和细胞因子表达显示出治疗效果。吡非尼酮治疗还显著减少了支气管周围平滑肌层的增厚，通过组织学评估减少了纤维化，并使羟脯氨酸积累减少了约60%。
心脏纤维化模型中的效果
心脏纤维化是几种疾病的显著因素，包括慢性高血压[33]和充血性心力衰竭[59]，并导致心肌梗死后的心脏功能障碍和发病率[3]。纤维化组织区域损害心脏功能，干扰协调的电传导，并增加心律失常的易感性。在细胞和分子水平上，心脏纤维化与其他器官的纤维化有相似之处，包括持续的肌成纤维细胞和升高的促纤维化介质（TGF-β、PDGF和结缔组织生长因子）[60]。
Lee等人[2]研究了吡非尼酮在心力衰竭模型中减少心房纤维化和相关心房颤动易感性的能力。通过在配备单腔起搏器的狗中进行3周的心室快速起搏诱导充血性心力衰竭（表1和在线补充材料）。饮食给予吡非尼酮（800 mg，每日三次）使充血性心力衰竭诱导的左心房纤维化减少了约50%，并显著降低了左心房传导异质性和心房颤动易感性。
心肌梗死后持续的纤维化被认为会损害梗死周围的存活组织[3]。纤维化组织的指状突入梗死边缘区导致传导不均一，使患者易患心室心律失常。Nguyen等人[3]在大鼠缺血再灌注模型中评估了吡非尼酮限制心肌梗死后纤维化的能力（表1和在线补充材料）。吡非尼酮治疗（1.2%饮食给药）在缺血再灌注后1周开始，并持续4周。吡非尼酮治疗导致较小的梗死面积，左心室纤维化减少了约50%，并且纤维化延伸到邻近组织的程度减轻。这一发现与心脏功能（左心室射血分数）的保留和心室心律失常易感性的降低相关。
心脏纤维化在慢性高血压的反应中发展，并与舒张期刚度增加、心脏功能丧失和心律失常风险增加相关[33]。Mirkovic等人[33]研究了吡非尼酮在高血压大鼠中对心脏纤维化的影响（表1和在线补充材料）。通过切除左肾并给予1%氯化钠饮水和皮下注射脱氧皮质酮醋酸酯来诱导高血压。吡非尼酮治疗（饲料中0.4%）在手术后2周开始，并持续到第4周研究结束。吡非尼酮治疗减轻了心室肌细胞肥大，并阻止了心脏纤维化和舒张期刚度的增加。心脏纤维化和舒张期刚度降低到略低于治疗开始时（第2周）平行动物观察到的水平，表明吡非尼酮可能逆转该模型中的早期纤维化。如前所述，平行药代动力学研究表明，吡非尼酮血浆浓度在24小时内相对恒定，与用2,403 mg·天⁻¹治疗的IPF患者观察到的Cmin相似。总体而言，这些研究表明吡非尼酮可以在肺以外的器官中发挥抗纤维化作用，表明吡非尼酮靶向的纤维化途径不是组织特异性的。
肾纤维化模型中的效果
肾纤维化是几乎所有进展为肾衰竭的肾脏疾病的最终共同途径[61]，纤维化的进展与肾功能丧失相关[62, 63]。肾纤维化的许多细胞和分子介质与其他器官的纤维化相同，包括持续的成纤维细胞和肌成纤维细胞、升高的促纤维化介质（TGF-β、PDGF、白细胞介素（IL）-1β和碱性（b）FGF）以及基质金属蛋白酶及其抑制剂的失衡[63]。吡非尼酮在减少肾纤维化方面的效果已在几项研究中得到证实，包括由部分肾切除[49, 50]、单侧输尿管梗阻（UUO）[48]、糖尿病肾病[51]、环孢素[64, 65]和钒酸盐[66]驱动的模型。下面总结了这些研究的一个有限子集。
一个特征明确的肾纤维化模型使用UUO来诱导进行性肾小管间质纤维化。Shimizu等人[48]研究了吡非尼酮在大鼠UUO模型的两个版本中的效果（表1和在线补充材料）。在一个实施中，纤维化在持续梗阻的3周内发展。在该模型中，预防性给予吡非尼酮（饲料中0.6-0.9%）使UUO诱导的胶原沉积减少了约50%，并降低了胶原和TGF-β mRNA的表达。在梗阻开始后1周开始并持续整个研究的延迟吡非尼酮给药显示出胶原沉积减少的趋势和TGF-β mRNA表达的显著降低。在UUO模型的第二个实施中，梗阻在1周后释放（表1和在线补充材料）。在梗阻释放时，平行动物中观察到升高的羟脯氨酸，纤维化在随后的5周内继续发展，尽管梗阻已解除。这些结果表明，在梗阻释放时，纤维化过程已经建立并正在进展。在梗阻释放时开始的吡非尼酮治疗（饲料中0.6-0.9%）显著抑制了进一步的肾纤维化，但未将纤维化降低到治疗开始时已建立的水平以下。在研究结束时，UUO诱导的羟脯氨酸积累减少了约60%，组织学切片中显示出间质纤维化减少的证据。该模型中肾功能恢复的可逆性与梗阻的长度成反比，这预计会定义组织损伤的程度。通过测量梗阻释放后5周的菊粉清除率，吡非尼酮治疗的动物显示出肾功能的部分恢复，而未经治疗的动物则没有。总之，这些实验表明吡非尼酮治疗可以预防肾纤维化，改善正在进行的肾纤维化并降低胶原mRNA表达。
在大鼠次全（5/6）肾切除模型中，手术切除一个肾脏的三分之二和对侧整个肾脏导致残余肾脏中的炎症和纤维化。Takakura等人[49]证明，预防性吡非尼酮治疗（饲料中1%）使纤维化阳性染色面积的增加减少了约80%，并显示出对蛋白尿以及肌酐和血尿素氮水平改善的趋势（表1和在线补充材料）。Shimizu等人[50]还在5/6肾切除模型中评估了吡非尼酮的效果。在这项研究中，吡非尼酮治疗（饲料中0.6-0.9%）防止了肾切除术后约60%的胶原积累，并降低了TGF-β和胶原mRNA的表达（表1）。这些效果与改善的肌酐清除率相关。总体而言，吡非尼酮在这一特征明确的慢性肾脏疾病模型中显示出显著的抗纤维化效果。
肝纤维化模型中的效果
肝纤维化发生在与病毒性肝炎、酒精中毒和自身免疫性肝病相关的慢性肝病患者中[6, 67]。肝纤维化由与其他器官相同的许多促纤维化介质驱动，肝星状细胞（与肌成纤维细胞类似）相对于细胞外基质沉积和生长因子产生处于超活化状态[6]。
大鼠慢性四氯化碳（CCl4）中毒导致肝酶升高和肝纤维化。Salazar-Montes等人[52]在该模型中评估了口服给予吡非尼酮200 mg·kg⁻¹的疗效（表1和在线补充材料）。吡非尼酮治疗使肝纤维化减少了40%，并显著降低了胶原I mRNA表达。与对照组相比，吡非尼酮治疗的动物中肝损伤标志物（天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素和直接胆红素）显著降低，证明了吡非尼酮治疗的功能益处。吡非尼酮治疗还降低了肝中的氧化应激标志物，包括硝酸盐和丙二醛；这些变化伴随着超氧化物歧化酶和过氧化氢酶mRNA表达的降低。Garcia等人[53]在CCl4诱导的肝纤维化模型的两个实施中评估了吡非尼酮的效果（表1和在线补充材料）。在CCl4停用后给予吡非尼酮导致纤维化阳性染色面积减少70%，肝星状细胞数量减少，总肝羟脯氨酸减少约40%。肝纤维化的减少与肝酶和纤维化分子标志物的降低相关。在二次研究中，与持续CCl4损伤同时给予吡非尼酮使纤维化阳性染色面积减少了40%。总体而言，这些研究表明吡非尼酮治疗能够减少纤维化，调节纤维化分子标志物，并改善CCl4诱导的肝纤维化模型中的肝损伤（通过肝酶水平评估）。
二甲基亚硝胺（DMN）诱导的肝纤维化是大鼠中另一种常用的实验模型，其中DMN的慢性给药导致肝重塑和肝硬化。Di Sario等人[54]评估了吡非尼酮（饲料中0.5%；在5周模型的第3-5周给药），发现DMN诱导的肝纤维化阳性染色面积增加了70%的减少（表1和在线补充材料）。这与ALT、坏死炎症评分、肝星状细胞积累以及TGF-β和前胶原-1 mRNA表达的显著降低相关。在第二项研究中，Tada等人[55]证明吡非尼酮（500 mg·kg⁻¹·天⁻¹，通过口服灌胃）使纤维化面积（通过组织病理学）减少了40%，肝羟脯氨酸含量和胶原I mRNA表达显著降低（表1）。
胆管结扎模型是肝纤维化的另一种广泛使用的模型。Salazar-Montes等人[52]用吡非尼酮（200 mg·kg⁻¹，通过口服灌胃）治疗胆管结扎大鼠，观察到肝纤维化（马松三色染色面积）减少了60%，胶原I mRNA表达降低（表1和在线补充材料）。吡非尼酮治疗还降低了肝中的氧化应激标志物，包括硝酸盐和丙二醛，同时伴随着超氧化物歧化酶和过氧化氢酶mRNA表达的降低。Garcia等人[53]发现，吡非尼酮治疗（200 mg·kg⁻¹，每日口服灌胃）使纤维化阳性染色面积和总肝羟脯氨酸减少了约50%（表1和在线补充材料）。总体而言，这些研究表明吡非尼酮在几种广泛使用的肝纤维化实验模型中的有效性。
纤维化介质的效果
上述几种体内研究检查了吡非尼酮调节细胞因子和生长因子产生或降低氧化应激的能力（表2）。这些效果可能是吡非尼酮治疗的直接结果，也可能是与尚未表征的主要分子靶点调节相关的次级、连锁效应的结果。无论哪种情况，细胞因子、生长因子和氧化应激标志物的调节表明观察到的体内抗纤维化效果与正在进行的纤维化相关途径的调节相关，并为观察到的抗纤维化效果提供了进一步支持。
表2中评估的纤维化研究中最常评估的标志物是TGF-β。11项研究评估了TGF-β的表达；所有这些研究都表明TGF-β在纤维化状态下上调，而吡非尼酮治疗显著降低了TGF-β表达（表2）。TGF-β是纤维化最著名的诱导剂，已知可诱导额外促纤维化介质的表达，促进肌成纤维细胞分化并诱导上皮-间质转化[68]。在转基因动物中过度表达TGF-β或通过腺病毒载体递送导致肺和其他器官的显著纤维化[68]。此外，TGF-β在取自纤维化疾病患者（如肝硬化、肾小球硬化、心肌病、硬皮病和IPF）的样本中过度表达[68, 69]。TGF-β在纤维化中的核心作用促进了通过多种方法对其活性进行治疗调节的努力，包括使用中和单克隆抗体、抑制相关TGF-βRI（ALK5）受体酪氨酸激酶和调节下游信号级联[69]。TGF-β抑制剂已被证明可以减少非临床模型中的纤维化，包括肺纤维化模型[68, 69]。吡非尼酮调节TGF-β表达的能力表明它可以下调大量下游纤维化相关效应。
吡非尼酮还调节其他促纤维化介质的活性，包括生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（MMPs）。对生长因子的影响包括下调PDGF和bFGF。PDGF是强大的成纤维细胞有丝分裂原和趋化因子。PDGF的表达在纤维化疾病（包括IPF、硬皮病和闭塞性细支气管炎）患者样本中上调[68]。此外，PDGF的实验引入（作为重组蛋白或通过病毒载体）导致肺纤维化，PDGF受体酪氨酸激酶活性的抑制剂可改善TGF-β、辐射和博来霉素诱导的动物模型中的纤维化。bFGF是几种细胞类型（包括成纤维细胞、肌成纤维细胞和平滑肌细胞）的有丝分裂原。bFGF的表达在实验模型中对博来霉素和百草枯损伤的反应中上调，并已被证明在IPF和硬皮病患者肺中上调[68]。在博来霉素模型中，吡非尼酮下调了基质细胞衍生因子（SDF）-1α/CXCL12的产生。这种趋化因子诱导纤维细胞 trafficking/招募并促进实验模型中的肺纤维化，并被证明在IPF患者的肺和血浆中升高[21, 70, 71]。
MMPs在IPF和肺纤维化实验模型中显著上调[72]。这些蛋白质在建立和/或维持纤维增生状态中的作用复杂且尚未完全理解。MMPs已知可降解细胞外基质蛋白，但在几个额外过程中也可能发挥作用，包括促纤维化生长因子的激活或降解、基底膜破坏和上皮细胞凋亡。在心脏和肾纤维化模型中，吡非尼酮使MMP-2和MMP-9的产生正常化（表2）。这两种蛋白质在IPF患者中上调，并与基底膜破坏有关。
吡非尼酮治疗调节了一系列在纤维化过程的启动和维持中具有拟议作用的炎性细胞因子。这些包括促进细胞招募、成纤维细胞增殖、上皮细胞增生和气道上皮细胞凋亡的TNF-α[11]。在啮齿动物肺中过度表达TNF-α导致炎症和轻度纤维化[73]。吡非尼酮治疗还下调了IL-1β的表达，IL-1β是一种诱导成纤维细胞产生促纤维化介质（如PDGF和TGF-β）的细胞因子[68]。在啮齿动物肺中过度表达IL-1β导致显著炎症、组织损伤和慢性纤维化[73]。纤维化T辅助细胞类型2细胞因子IL-4和IL-13被吡非尼酮治疗下调。IL-4促进细胞外基质沉积，IL-13在小鼠中的过度表达导致TGF-β和肺纤维化表达增加[13]。
吡非尼酮在肺和肝纤维化模型中降低了氧化应激标志物。在肝、肾和肺纤维化疾病的患者中已识别出氧化应激标志物升高[74]。活性氧与上皮细胞损伤和凋亡有关，由TGF-β诱导，是TGF-β诱导的肌成纤维细胞增殖、细胞外基质产生和收缩性的介质[74-76]。在IPF患者的血清、支气管肺泡灌洗和呼出气冷凝物中已证明氧化应激增加[75]，与疾病更稳定的患者相比，进展性IPF患者肺组织中与氧化应激相关的基因上调[18, 19]。一项比较155名IPF患者中N-乙酰半胱氨酸（NAC）与泼尼松和硫唑嘌呤联合使用与仅泼尼松和硫唑嘌呤的临床研究显示，添加NAC减缓了用力肺活量和一氧化碳扩散能力的恶化[77]。IPF中抗氧化治疗的潜在作用正在进一步研究中，比较安慰剂与NAC或泼尼松、硫唑嘌呤和NAC联合使用[78]。
总体而言，吡非尼酮在几类促纤维化介质中的广泛效果与体内观察到的强大抗纤维化效果一致。
基于细胞的测定中的效果
除了在动物模型中调节纤维化介质外，在基于细胞的测定中已报道了吡非尼酮的多种可能与其抗纤维化效果相关的活性。体外抗纤维化活性（表3）可分为三大类：减少成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖[79, 84-86]、抑制细胞外基质合成/沉积[79-83, 86]以及减少纤维化标志物[81, 82, 84, 85]。这些活性中的每一项都与慢性纤维化的减轻相关，与吡非尼酮在动物模型中报告的效果一致，并可能与吡非尼酮在IPF治疗中的使用相关。
吡非尼酮的抗炎效果也在基于细胞的测定中得到证实（表4）[87-89]。在这些研究中吡非尼酮最常见的报道效果是降低TNF-α产生。其他受影响的细胞因子包括IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白-1β。吡非尼酮治疗还增加了脂多糖（LPS）刺激的抗炎细胞因子IL-10的产生。在这些基于细胞的测定中观察到的细胞因子效果与上述动物模型中观察到的效果重叠，并通过额外的体内LPS挑战模型得到进一步支持[89, 90]。
有限数量的研究检查了吡非尼酮在体外的抗氧化活性。据报道，吡非尼酮降低了活化的中性粒细胞和巨噬细胞以及TGF-β刺激的小鼠系膜细胞产生的活性氧[51, 91, 92]。吡非尼酮还在微粒体和生化测定中降低了脂质过氧化[92, 93]。定义抗氧化效果机制的生化实验产生了不确定的结果。两项报告表明吡非尼酮淬灭Fenton化学产生的羟基自由基（过氧化氢与亚铁反应）。然而，关于吡非尼酮是否能够络合铁并可能防止羟基自由基的形成而不是充当自由基淬灭剂，存在相互矛盾的报告[91, 93]。关于淬灭超氧阴离子的能力，三项报告表明这要么不是吡非尼酮的效果[93]，要么是弱效果[92]，要么仅在与铁络合时有效[91]。
吡非尼酮在体外调节多种基于细胞的活性的能力，特别是成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积和促纤维化蛋白的产生，与体内观察到的系统性抗纤维化效果一致。然而，体外观察到的效果对体内观察到的药效学效果的相对贡献尚未明确定义，多种活性可能发挥作用。图3总结了动物模型和/或基于细胞的测定中吡非尼酮治疗调节的多种最终共同途径。抗纤维化、抗炎和抗氧化效果的组合可能是导致在广泛动物模型中观察到的纤维化减少的原因[35]。
结论
吡非尼酮是一种口服生物可利用的小分子，已广泛表征用于IPF的治疗。基于临床前动物模型中观察到的广泛抗纤维化活性，开始了吡非尼酮在IPF中的临床研究。这种活性在肺、肝、心脏和肾脏的多种纤维化模型中显而易见。几项研究证明了纤维化减少与相关功能终点改善之间的关系，包括改善肺功能、改善心脏功能、降低心律失常风险、改善肾清除率和降低肝损伤的生化标志物。在这些研究中，吡非尼酮治疗调节了几种被认为与纤维化相关的生长因子和细胞因子的表达，包括TGF-β、PDGF、SDF-1α/CXCL12和TNF-α。来自基于细胞的测定的支持数据扩展了这些发现，并证明了减少成纤维细胞增殖和调节细胞外基质沉积的能力。总体而言，吡非尼酮的临床前特征表明系统性抗纤维化效果，支持其在纤维化疾病中的临床评估。
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