意义
较高的血液维生素D水平与更好的健康结局相关。然而，维生素D缺乏在老年人中很常见。尽管大脑中存在维生素D的作用靶点，但维生素D如何影响认知功能尚不清楚。在老年啮齿类动物中，我们模拟了从缺乏到充足的人类血清维生素D水平范围，并测试增加膳食维生素D是否能维持或改善认知功能。治疗从中年期（衰老标志开始出现时）开始，并维持约6个月。与低或正常膳食维生素D组相比，只有高维生素D组的老年大鼠能够完成复杂的记忆任务，且血液水平处于最佳范围。这些结果表明，维生素D可能提高健康认知老化的可能性。
摘要
维生素D是一种重要的钙调节激素，在包括大脑在内的多种组织中具有多种功能。越来越多的证据表明，维生素D可能在维持认知功能方面发挥作用，而维生素D缺乏可能会加速与年龄相关的认知衰退。使用老年啮齿类动物，我们试图模拟从缺乏到充足的血清维生素D水平范围，以测试维生素D是否能在衰老过程中保护或改善认知功能。5-6个月来，中年F344大鼠被喂食含有低、中（典型量）或高（分别为100、1,000或10,000国际单位/千克饮食）维生素D3的饮食，然后在莫里斯水迷宫中测试海马依赖的学习和记忆。高维生素D组大鼠达到了最高的血液水平（在充足范围内），并在迷宫反转测试中显著优于低和中组，这是一个特别具有挑战性的任务，可以检测记忆中更细微的变化。除了钙相关过程外，海马基因表达微阵列还确定了突触传递、细胞通信和G蛋白功能等通路在高维生素D条件下被上调。基础突触传递也得到增强，证实了在基因表达和学习记忆方面观察到的效果。我们的研究表明维生素D状态与认知功能之间存在因果关系，并且维生素D介导的海马基因表达变化可能会提高成功脑老化的可能性。
维生素D是一种类固醇激素，以其在骨骼和钙稳态中的作用而闻名，现已广泛认可其在多种组织和细胞类型中具有多种功能和作用(1, 2)。维生素D通常指通过皮肤暴露于阳光下获得的激素前体形式[维生素D3(VitD3)]或从饮食来源获得的(VitD3或VitD2)。维生素D的代谢物25-羟基维生素D(25OHD)是维生素D状态或补充的血清生物标志物。近年来，人们特别关注人口的很大一部分可能具有低水平的25OHD，因此维生素D缺乏(3)。由于摄入减少、吸收降低和阳光暴露减少等因素，老年人(≥50岁)尤其易感(3-6)。值得注意的是，老年人25OHD水平较低的这种倾向与多种年龄相关疾病(包括癌症和代谢及血管疾病)的高风险相关(7-10)。
维生素D状态不足也与老年人认知能力下降风险增加相关(4, 11-15)，这表明最佳水平可能促进健康的大脑老化(16, 17)。由于大脑表达维生素D受体(VDRs)并能合成激素的活性形式，维生素D可能的认知增强作用可能反映其在大脑中的直接作用，而非继发性全身效应的结果(18-22)。事实上，我们和其他人已经表明，维生素D以及激素的生物活性形式1,25-二羟基维生素D具有直接的神经保护作用，并能减少一些大脑老化的生物标志物(20, 23-28)。
鉴于预计未来不久老年人口将大幅增加(29)，以及估计相当大比例的老年人维生素D缺乏(3)，迫切需要确定改善维生素D状态的努力是否能减少与年龄相关的认知能力下降。尽管呼吁进行更多确定性研究(30)，但很少有长期干预研究检查操纵维生素D对随年龄增长的认知功能的影响。为了检验高维生素D水平改善衰老动物认知功能的假设，中年雄性F344大鼠被置于含有低、中[国家研究委员会(NRC)要求量]或高剂量VitD3(或胆钙化醇)的饮食中5-6个月。选择中年期是因为它越来越被视为一个重要的时间窗口，此时可以开始干预以保护老年期的认知功能。在中年期，细微的认知障碍开始出现，同时伴有与大脑老化相关的结构和基因组变化(31-34)。我们的结果显示，高于正常水平的膳食VitD3可能提高成功大脑老化的几率，并且海马体中神经元突触功能的变化可能是其对抗与年龄相关认知能力下降的保护作用的基础。
结果
图1提供了本研究的概述。在含有不同量VitD3(低、中或高)的饮食上饲养的中年大鼠接受了认知表现的训练和测试。在动物子集中，一个半脑用于确定海马基因表达的变化，另一个用于免疫组织化学(IHC)。其余大鼠用于海马切片电生理学。
生理参数和血液分析。
在整个研究过程中，各组之间在食物摄入量(表1)或相应的体重(图S1)方面未检测到差异。开始时，动物体重约为500克，到研究结束时，它们增重约30-60克。由于维生素D是骨骼和矿物质代谢的重要调节剂，血液化学面板用于评估饮食对VitD3的操纵对钙和磷以及其他常见血清变量的影响(表1和表S1)。本研究中，血清钙和磷水平随着饮食中VitD3的操纵而保持不变，肾脏或肝脏功能的多个指标也是如此。
为了确定饮食操纵VitD3是否影响维生素D状态，使用基于血液斑点LC-串联MS(MS/MS)的方法(36, 37)在动物子集中确定了25OHD的血液水平。25OHD是维生素D状态最常见的指标，因为它是维生素D的稳定且长寿命代谢物。结果显示，循环25OHD水平与饮食中VitD3的量成比例。饮食VitD3含量每增加10倍，循环25OHD水平大约增加一倍，证实维生素D状态可以通过饮食摄入来改变(图2)。
莫里斯水迷宫。
经过5-6个月的饮食VitD3操纵后，评估了莫里斯水迷宫(MWM)中的表现，以确定对空间学习和记忆的影响。所有组别在3天训练期间都同样良好地学会了任务，如到达隐藏平台的路径长度和潜伏期所示(图3B)。24小时后，在探测试验(平台移除)中评估了记忆。在潜伏期(P = 0.14)或路径长度(P = 0.22)方面，组间无统计学差异(图3C)，尽管低VitD3饮食组在潜伏期和路径长度上显示出较高的趋势。
我们接下来使用更具挑战性的认知任务评估表现，该任务要求动物学习新的平台位置(空间反转)(图3A)。所有组别都能在仅1天的训练中学会新位置，因为在空间反转训练(第5天)中的潜伏期和路径长度与之前任务(第3天)中观察到的相当；组间无差异(图3B)。72小时后进行的反转探测试验(第8天)显示，高VitD3饮食的大鼠在到达目标所需时间和行进距离方面显著优于其他两组，在潜伏期和路径长度方面均优于其他组(图3D)。代表性的路径长度追踪图(图3E)证明了高VitD3饮食动物的显著更好表现。
维生素D敏感基因/生物通路的鉴定
对于动物子集，每只大鼠的海马体在单个Affymetrix微阵列上进行处理(每个治疗组n = 9只大鼠)(图1)。分析海马体是因为它在学习/记忆中的作用及其对突触功能年龄相关变化的敏感性。过滤掉存在和注释良好的基因探针(31)后，保留了10,071个基因进行测试。通过单向方差分析对所有三个VitD3处理组中的每个基因进行测试，发现144个基因在P ≤ 0.005时存在差异，错误发现率(FDR)为0.31(38)；其中128个基因以VitD3剂量依赖性方式调节(Dataset S1)。我们还使用更严格的P值P ≤ 0.0015和FDR 0.17分析了微阵列数据，产生了总共52个基因(显示在Dataset S1中每个处理类别的顶部)。
为了确定显著基因是否在某些生物类别中过度表达，我们使用注释、可视化和综合发现数据库(DAVID)生物信息学工具(39-42)进一步分析了显著基因(P ≤ 0.005)。这种方法可以为统计显著基因列表提供生物学见解，并且还可以提供针对多重测试的第二层置信度。也就是说，通过多重测试错误识别的基因不太可能在通路内分组。DAVID分析(表2)确定的高膳食VitD3过度表达的通路包括G蛋白偶联受体活性、突触传递和细胞通信类别。有趣的是，在大脑中发现的多种细胞类型(如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞)中，高VitD3上调通路中的基因似乎主要是神经元性质的。以VitD3剂量依赖方式上调的类别包括阳离子稳态、细胞质膜部分和钙结合，所有这些都与钙调节/稳态有关。这些结果表明，除了其在调节外周钙依赖性功能的既定作用外，维生素D似乎在大脑中发挥类似作用。值得注意的是，许多更显著的基因(P ≤ 0.0015)包含在DAVID分析确定的通路中(在表2中指出)。
为了识别可能被VDR直接靶向的基因，我们在显著基因列表(Dataset S1)中搜索了可能包含经典VDR元件(VDRE)基序的基因(43)。表3显示了高VitD3上调且包含假定VDRE的海马基因。相应的共识序列、高度保守的核苷酸和与经典基序同源性的质量评分也指出。这些基因中的几个(即突触足蛋白1、突触结合蛋白2、接触蛋白4、β-1-突触蛋白)主要是神经元的。需要使用如ChIP等技术进行更明确的研究，以确认这些使用计算机方法识别的具有假定VDRE的海马基因是否确实包含功能性VDRE。
维生素D敏感靶点的可视化
选择几种蛋白质(VDR、突触足蛋白1和突触结合蛋白2)进行免疫组织化学(IHC)分析。与先前研究一致，证实了VDR存在于海马神经元中(18, 19)。组间未检测到VDR染色差异(图S2)。突触足蛋白1和突触结合蛋白2，它们是突触可塑性通路的代表性蛋白，并包含假定的VDRE，被选中以扩展基因微阵列数据。IHC数据通过显示两个蛋白的预测方向上的强烈效应验证了基因微阵列结果：突触足蛋白1：P = 0.05，学生t检验(图4A)；突触结合蛋白2：P = 0.03，学生t检验(图4B)。
海马切片电生理学
为了确定操纵VitD3状态是否影响与认知相关的生理功能，检查了海马CA1区域的长时程增强(LTP)。比较了theta脉冲刺激前后的场EPSP斜率，组间未观察到LTP差异(图S3)。然而，通过绘制输入刺激的渐进增加与测量的诱发反应获得的输入/输出(I/O)曲线显示组间存在显著差异(图5)。与低和中VitD3组相比，高VitD3组具有显著更陡的I/O斜率。这些结果表明，高VitD3可能改善神经元兴奋性，已知这种兴奋性随年龄增长而降低(44)。然而，高VitD3的这种增加的反应性似乎不是由于过度兴奋性，因为切片存活率和完整性在各组之间相当。
讨论
尽管越来越担心维生素D缺乏是与不健康认知老化相关的风险因素，但很少有研究调查慢性维生素D(VitD3)补充的效果。因此，尚不清楚是否存在潜在的因果关系。在这里，我们检查了长期饮食操纵血清维生素D(25OHD)的效果，并检验了高维生素D水平可以减缓或防止衰老相关的认知能力下降的假设。中年雄性F344大鼠被喂食含有低、中(NRC要求量)或高VitD3的饮食5-6个月，随后评估认知功能、海马电生理学和基因表达。我们的研究结果提供了潜在因果关系的证据，因为提高25OHD水平防止了与年龄相关的认知能力下降。此外，这些研究确定了突触功能的影响作为维生素D促进健康大脑老化的机制(图6)。增加维生素D摄入的相关风险相对较少，特别是当以非活性形式(VitD3或胆钙化醇)服用时(45)。最令人担忧的潜在副作用是高钙血症；然而，高钙血症很少见，除非血清25OHD水平远超过推荐用于最佳健康的水平(45)。本研究中高VitD3饮食的动物25OHD水平约为30 ng/mL，血清钙无变化(图2和表1)。
更高的维生素D水平减少中年期的认知缺陷
MWM任务用于测试空间参考记忆，并被广泛认为与人类海马依赖记忆相关(46-50)。虽然不常用，但MWM中的反转学习比标准任务更难，因此可用于检测细微的记忆缺陷(46)。此外，由于其更复杂的性质，反转学习可被视为执行功能的任务(51, 52)。中年期通常以这种认知表现的细微变化开始为特征，最显著的是执行功能和处理速度(32, 53, 54)。我们最初评估了空间参考记忆，其中大鼠被训练在特定位置定位隐藏平台，并发现接受不同水平维生素D处理的中年动物组之间无显著差异。然而，在空间反转中，动物需要在一天内学会新的平台位置，然后在几天后记住新位置。这个更难的任务需要区分旧的、现在不相关的记忆和新的记忆，可能涉及海马体和更高级皮质区域。低和中VitD3组表现出缺陷，在反转探测试验中难以回忆新平台位置，显得迷失或困惑。另一方面，高VitD3组在这个任务上表现极佳，到达目标的时间和距离仅为其他两组的一半。因此，这些结果表明，较高的25OHD血清水平可能对认知功能中一些早期、细微的变化具有保护作用。
维生素D靶向突触的分子机制
大脑老化的一个共同特征是突触强度降低或神经元之间通信受损(32, 44, 55-58)。突触连接变得功能失调，部分可能是由于囊泡运输和神经递质释放减少，导致可塑性降低(56, 59-61)。这些变化可能导致与年龄相关的认知能力下降，并似乎是大脑中最早出现的与年龄相关的改变之一。在老年动物中，高VitD3上调了参与突触囊泡运输和神经传递的多个基因/功能通路(表2)。包括突触足蛋白1和突触结合蛋白2在内的几个基因在其启动子区域包含潜在的VDRE，可能受到维生素D的直接调节(表3)。这两个基因的上调也通过海马体中相应蛋白的免疫反应性增加得到证实(图4)。在突触前末梢，突触足蛋白1通过其磷酸酶活性帮助突触囊泡的回收，而突触结合蛋白2则通过其钙感应功能启动突触前膜上的囊泡停靠和融合，最终导致神经递质释放(62, 63)。高VitD3增加的突触前机制的另一个组成部分是囊泡谷氨酸转运蛋白2，这是一种将谷氨酸包装到突触前囊泡中的囊泡转运蛋白，使其可在突触处释放(64, 65)。
其他对突触前/后功能重要的基因也被VitD3上调(表2和Dataset S1)。这些基因包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ(CaMKIIδ)和几种主要神经递质(多巴胺、谷氨酸和血清素)的受体。CaMKIIs是在突触后部位富集的钙激活酶，大量证据表明它们增强突触强度和记忆形成(66)。CaMKIIδ定位于细胞核，在通过cAMP反应元件结合蛋白(CREB)调节活性依赖性基因转录中起关键作用，CREB是一种主要的转录因子。CaMKIIδ磷酸化CREB，导致BDNF表达，BDNF是一种中枢神经系统生长因子，可增强神经发生、树突发育和突触可塑性，所有这些都被认为最终促进记忆(32, 66-68)。另一种靶向BDNF并被高VitD3上调的转录因子是核受体4A2(Nr4a2)，它属于孤儿核受体家族。Nr4a2被视为增强认知的有希望靶点，因为它似乎在选择性促进长期记忆巩固方面发挥作用(69)，正如高VitD3动物在空间反转任务中所展示的那样(图3 D和E)。
与认知功能潜在相关的其他通路
与它作为外周钙调节激素的作用一致(1-3, 5, 7, 70)，我们发现维生素D也在海马体中靶向钙调节通路(表2)。这些结果补充了对突触功能的影响，因为突触过程也是钙依赖性的。我们和其他人已经表明，钙稳态失调在大脑老化过程中起关键作用(44, 56, 71)，并证明维生素D逆转与大脑老化相关的钙相关电生理标志物(24, 27)。这些结果一起表明，维生素D对钙调节和突触功能的影响可能相互作用以对抗衰老过程中的认知能力下降。
其他研究发现了维生素D对参与神经元功能的特定基因的相关影响，包括神经营养因子、钙结合蛋白和参与神经递质合成的蛋白的基因(20, 30)。一些研究还涉及含有维生素D的化合物在对抗胶质反应性方面的作用(28)。我们和其他人先前已经表明，与胶质反应性和炎症相关的基因，可能改变神经元能量代谢，是大脑老化中最早受影响的基因之一，并与认知障碍相关(28, 34, 41, 72, 73)。这里观察到维生素D能够维持和增强突触功能，显然是通过增加关键突触分子的表达，这提出了维生素D直接作用于神经元通路，而不与衰老中的胶质反应直接相互作用的可能性。
维生素D缺乏与脱髓鞘疾病(如多发性硬化症)之间也有充分记录的关联(1-3, 74)。尽管DAVID分析(表2)没有确定特定于髓鞘相关过程的功能通路，但接触蛋白4和β-1-突触蛋白的基因在高VitD3下上调(Dataset S1)。这些基因包含假定的VDRE(表3)，并且已知在髓鞘结构和功能中起关键作用。特别是接触蛋白对于将髓鞘锚定到轴突至关重要，其缺失会导致神经传导受损(75)。此外，接触蛋白及其锚定复合物随年龄在中枢神经系统中减少(34, 76, 77)。鉴于髓鞘改变和由此导致的传导减慢与大脑功能受损相关(78, 79)，维生素D对接触蛋白和突触蛋白的上调可能反映了维生素D增强衰老中认知功能的另一种机制通路(80)。图6将髓鞘相关变化与突触处的变化整合到一个提出的模型中，展示VitD3如何促进突触传递并影响记忆等认知过程。
结论
我们的研究提出了它们对人类认知老化的相关性问题。值得注意的是，该动物模型中大脑老化的几个方面与人类大脑老化相似(81)。首先，认知老化的最初迹象，以细微缺陷为特征，在人类和大鼠生命周期中大约同一时间出现，即中年期(32-34, 82)。其次，这里使用的评估海马依赖空间记忆的行为任务也与人类记忆相关，因为海马病变患者在虚拟迷宫测试中表现不佳(47, 48)。最后，这里达到的维生素D水平模拟了在人类中发现的临床相关水平，从缺乏到充足(70, 83, 84)，并且25OHD水平最高的动物，根据某些推荐被视为"最佳"(5, 85-88)，在一项具有挑战性的认知任务中表现优于水平较低的动物。
由于维生素D的剂量-反应研究很少(89)，很难确定什么水平最有利于获得超出已知对骨骼影响的益处(88)。然而，较低水平越来越多地与人类和动物研究中大脑的负面效应相关(1-8, 11-14, 16, 17, 30, 74, 90-92)。需要进行额外研究以确认当前发现并更好地理解潜在机制，特别是与认知健康相关。重要的是，目前正在开展临床干预试验，将评估补充[每天2,000国际单位(IU)的VitD3]对老年人认知能力下降的影响(VITAL-Cog, DO-HEALTH)(93)。鉴于认知老化的最初迹象在中年期出现，并且与年龄相关的大脑疾病(如阿尔茨海默病)被认为具有很长的临床前阶段(94)，我们的结果提出了干预时机的问题。因此，从中年期早期开始干预维生素D可能更有效地促进健康认知老化，并减缓大脑老化过程多个标志物的出现(95)。
材料与方法
更详细的方法在SI材料与方法中提供。
动物和维生素D饮食
所有方案均获得肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。六十只中年雄性F344大鼠(11-13月龄)被分为三组，并喂食不同量的胆钙化醇(VitD3)(70)5-6个月。纯化AIN-93(Harlan-Teklad)饮食被修改，使得每千克饮食含有100 IU(低)、1,000 IU(中，典型量)或10,000 IU(高)VitD3。动物体重(图S1)和食物摄入量(表1)每周测量两到三次。
莫里斯水迷宫
莫里斯水迷宫程序与先前描述的类似(96)。简而言之，动物被训练在水池中找到淹没的平台(第1-3天)。在评估此任务的学习和记忆后(第4天)，移动平台，大鼠被训练学习新的平台位置(第5天)。第8天评估对新位置的记忆(图3A)。通过测量到达平台的路径长度和潜伏期来评估迷宫表现。
组织分离/血液分析
大鼠被深度麻醉并用冰冷的生理盐水灌注，然后断头取脑。右半脑置于4%(wt/vol)多聚甲醛中，用于IHC。左半脑的海马体被解剖用于微阵列分析。收集血液斑点，并使用LC-MS/MS方法(ZRT实验室)(37)测量25OHD水平(图2)。LC-MS/MS检测到的25OHD水平与放射免疫测定获得的25OHD水平相关良好(36, 37)；然而，它们略低，因为LC-MS/MS可以区分25OHD与其他维生素D代谢物(例如24,25OHD，内酯形式)(97)。还对分离的血清进行了化学面板检测(IDEXX RADIL，密苏里大学研究动物诊断实验室)(表1和表S1)。
微阵列
微阵列程序和分析按照先前工作进行(34)。简而言之，分离海马RNA，定量并检查RNA完整性。一个低VitD3样品未能通过RNA质量控制。将剩余的RNA样品应用于Affymetrix Rat Gene 1.0 ST阵列(每个受试者一个阵列)。预统计过滤去除了注释不良的探针集、低强度信号和离群值(>2 SD组均值)。使用单向方差分析分析过滤后的数据以识别显著差异，并使用FDR程序(31, 38)估计多重测试的误差。使用Pearson检验将显著基因分配到四个理想化表达模式之一，并根据其相关性的符号进行分离；相对基因表达值以log-2标度提供(Dataset S1)。使用DAVID生物信息学工具(39, 42)确定显著基因的功能分类(表2)。结果已上传到基因表达综合数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
假定VDRE的鉴定
Partek Genomics软件用于识别包含与经典VDRE(Pu-G-G/T-T-C/G-A-nnn-Pu-G-G/T-G/T-C-A)(43)至少70%同源性的基序的显著基因。
免疫组织化学
选择VDR和微阵列鉴定的突触足蛋白1和突触结合蛋白2，对30-μm海马切片进行IHC分析。在2-3天主要抗体溶液和适当的二抗1小时后，进行免疫过氧化物酶染色。由于突触足蛋白和突触结合蛋白在低和中VitD3组之间无差异，它们被合并并与高VitD3进行比较。
电生理学
在未用于微阵列或IHC的大鼠的分离海马切片上进行分析(图1)。获取海马切片，并如前所述记录LTP(96)。通过记录刺激强度增加时CA1区域中产生的fEPSP来检查I/O关系。
统计
食物摄入量、血液化学、行为和电生理数据通过单向方差分析与Newman-Keuls多重比较事后检验进行分析。IHC使用学生t检验，体重比较使用配对t检验。统计显著性定义为P ≤ 0.05。结果表示为平均值±SEM。
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