eLife评估
本研究显示，对小鼠中脑多巴胺神经元进行慢性化学遗传学（DREADD）激活后，会导致黑质致密部（SNc）与腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元出现差异性退化。这项发现具有重要意义：首先建立了无需毒素注射（如6-羟基多巴胺或MPTP）的帕金森病小鼠模型，该模型具有2-4周适合研究的轴突先退化时程；其次阐明了直接激活多巴胺神经元引发选择性退化的机制。激活多巴胺神经元不仅改变运动行为，还引发mRNA表达变化，其证据说服力达到eLife评估体系中的"令人信服"级别。
摘要
帕金森病(PD)以黑质致密部(SNc)多巴胺(DA)神经元死亡为特征，但驱动死亡的病理生理机制尚未明确。虽然已知DA神经元活性在PD中发生改变，但慢性活动变化如何导致退化仍不清楚。为解决这个问题，我们建立了化学遗传学（DREADD）小鼠模型，通过慢性增加DA神经元活性，并用离体电生理学证实活性增加。慢性过度激活导致光周期运动活性持续增加而暗周期减少，符合慢性DA释放变化及昼夜节律紊乱。我们观察到SNc投射的早期选择性退化，重现了PD中SNc轴突易损和VTA轴突相对抗性的特征，随后出现中脑DA神经元丢失。持续DREADD激活导致基线钙水平升高，支持钙离子在神经退行性变中的作用。最后，DREADD小鼠的空间转录组学分析结合PD患者样本，揭示了过度活性诱导毒性及PD的潜在机制。本研究揭示了SNc DA神经元对活性增加的易损性，支持神经元过度激活可能驱动PD退化的假说。
引言
在帕金森病(PD)中，SNc DA神经元的丢失会破坏基底神经节电路动态平衡。DA丢失会引发生存神经元及其他电路神经元活动变化。在大鼠黑质纹状体通路病变后，存活SNc DA神经元呈现超活性化、DA释放增加和再摄取减少。大量DA神经元丢失、线粒体复合物I活性完全丧失及PD相关蛋白PINK1缺失也可导致爆发性放电增加。因此，在广泛丢失或应激环境下，DA神经元易发生活动异常，这可能推动疾病进程。有证据表明超活性化在疾病启动中的作用，包括MitoPark小鼠DA神经元退化前的活性增加、PD患者诱导多能干细胞DA神经元的自发放电增加，以及PD遗传模型中的黑质纹状体DA神经元活性增加。此外，关键PD相关蛋白如α-突触核蛋白、LRRK2、PINK1和Parkin也会影响神经元活动水平。特别是α-突触核蛋白的正常功能被认为与调节神经元活动有关，进一步支持活动异常可能参与疾病发病机制的观点。纹状体亚丘脑核等环路变化也可能通过谷氨酸能投射增强影响SNc神经元活性。虽然系统级变化可能具有代偿作用，但也可能导致不良后果。
健康的SNc DA神经元具有巨大的能量需求，源于其起搏活性、活跃的钙泵功能、无髓鞘/少髓鞘纤维及巨大轴突树，这种能量需求使它们对线粒体损伤特别敏感。相比之下，邻近的VTA神经元在PD中相对存活，可能与其起搏依赖钙振荡程度较低、钙缓冲能力更强及轴突树较小有关。因此，结合疾病相关应激，即使轻度超活性化可能触发或加速SNc DA神经元的退化。支持这个假设的证据包括：抑制STN到SNc的兴奋性输入可保护神经元免受6-OHDA和MPTP毒性；PD患者黑质神经元记录显示较健康动物有两倍高的爆发性放电，尽管缺乏人类对照组数据。此外，超活性化引发的钙动态变化可导致代谢应激。SNc DA神经元依赖电压门控的Cav1.3钙通道支持起搏活动，阻断这些通道可对抗6-OHDA和MPTP毒性。虽然经典兴奋毒性涉及胞质钙超载和急性细胞死亡，但慢性突触超活性化会导致亚致死性的线粒体应激，促进钙失调和树突萎缩。Lrrk2突变和PINK1缺陷中也观察到线粒体钙超载。因此，活动异常、代谢应激和钙超载可能共同导致DA神经元死亡。
为确定慢性多巴胺神经元超活性化是否足以导致神经退行性变，我们建立了化学遗传学小鼠模型。结果表明，持续增加中脑DA神经元活性不仅改变昼夜运动模式，还导致SNc轴突选择性退化，最终引发中脑DA神经元死亡。这些变化伴随细胞内钙动态变化和转录组改变，支持活性增加在PD神经退行性变中的作用。
结果
为模拟PD中可能出现的DA神经元慢性增加，我们采用化学遗传学方法。首先在DATIREScre小鼠的SNc和VTA中立体定向注射Cre依赖的hM3Dq AAV，特异性表达兴奋性DREADD。通过离体电生理学证实了hM3Dq表达导致的活性增加。我们使用小鼠转轮跑动作为体内DA功能变化的代理指标。hM3Dq表达小鼠在腹腔注射CNO后出现急性跑动增加（图1-图补充1A），证实了DREADD表达成功。随后将小鼠随机分为对照组（2%蔗糖饮水）和CNO组（300mg/L CNO+2%蔗糖），持续2周（图1A）。这种策略实现了SNc和VTA DA神经元的慢性激活。
在治疗第1天，CNO组在暗周期活动度高于对照组，光周期也呈现增加趋势（图1B和C）。但到第3天，CNO组暗周期活动度明显下降并持续至治疗结束，而光周期活动度保持增加。暗周期跑动减少可能反映昼夜节律紊乱。行为变化的持续性表明化学遗传学激活产生了长期影响。对照实验显示，无DREADD的小鼠接受CNO处理没有明显活动度变化，排除了CNO本身的影响。未对急性CNO反应的小鼠（非应答者）也显示暗周期使用减少，表明DREADD表达水平差异可能影响应答程度。
离体全细胞记录显示体内持续7天的DREADD激活引起SNc神经元细胞体和树突的多个特性改变。包括超极化激活的非选择性阳离子电流Ih显著降低，自发放电率增加（图1D，图补充2C），但放电规律性保持不变。动作电位(AP)峰电压在CNO处理组更去极化，但AP阈值和持续时间无变化，表明AP波形未退化。有趣的是，急性CNO灌流对CNO预处理小鼠的SNc神经元急性反应消失（vehicle组4.9±2.9 mV vs CNO组-0.5±1.0 mV, p=0.05），可能反映受体脱敏、神经元适应或稳态应答，也可能提示早期毒性发生。
对VTA神经元的记录显示，慢性激活导致放电率增加，但放电规律性提高（图1-图补充2B）。VTA神经元的Ih电流和AP峰电压未发生改变，且对急性CNO的反应部分保留（vehicle组11.2±8.5 mV vs CNO组2.0±2.2 mV, p=0.17）。这些数据可能反映VTA神经元对慢性激活具有更强的抗性。
SNc轴突对慢性hM3Dq激活特别易损
通过分析纹状体DA轴突完整性发现，CNO处理小鼠SNc投射丢失约40%（TH免疫反应性和mCherry荧光降低），而伏隔核和嗅结节DA传入受影响较轻。非应答小鼠也观察到类似但较弱的改变。治疗1周的小队列中CPu已有TH免疫反应性下降趋势（图2-图补充1B）。
在治疗2周时，通过体视学分析未发现CNO处理对中脑DA神经元数量有影响（图2C），表明此时仅存在轴突退化而无神经元死亡。4周CNO处理后，CPu轴突大量丢失，而VTA神经元仍相对存活（图2E和F）。此时TH+中脑DA神经元数量显著减少（图2G和H），mCherry+神经元减少支持真实神经元丢失。这种轴突先退化而细胞体后丢失的模式与人类PD进展相似（Kordower et al., 2013）。
慢性激活增加中脑DA神经元群体钙水平
hM3Dq激活可能通过增加胞内钙水平（Roth, 2016），我们通过钙指示剂GCaMP6f观察到：治疗第7天后钙水平显著升高（图3F），与轴突退化进展平行。荧光信号在停止CNO处理后仅出现小幅下降，提示存在持续性改变。钙瞬态频率和幅度在慢性CNO处理后下降，清除后频率保持下降而幅度恢复，这可能反映神经元爆发电活动的永久性功能障碍。有趣的是，CNO组开放场运动在第11天回到基线水平，正好对应钙水平显著升高（图3-图补充1B），提示钙变化与功能障碍密切相关。
空间转录组学揭示激活相关基因表达变化
我们利用空间转录组学分析慢性激活引发的机制。DATIREScre小鼠注射AAV-hM3Dq-mCherry后接受1周CNO或对照饮水处理，在发生轻度轴突丢失而无细胞体退化时采集样本。同时设置未注射对照组。利用10x Visium平台进行空间转录组分析显示：SNc和VTA中涉及DA合成（Th）、摄取（Slc6a3）和储存（Slc18a2）的基因表达显著下降，可能反映退化前的神经元应激或减少DA释放的代偿。中脑DA神经元中突触传递相关基因（Syt1、Snap25、Snca、Ap2a1）表达减少，与后期CNO处理中观察到的轴突功能障碍和丢失一致。此外，我们观察到钙通道调节基因（表1）和钙调节蛋白激酶Sgk1的表达变化，支持钙在活性诱导退化中的核心作用。光度分析还显示中脑DA神经元钙水平在CNO处理7天后显著上升（图3F），此时轴突退化进展中。
SNc轴突易损性的机制
SNc神经元对hM3Dq激活引发的胞内钙增加更敏感，这种易损性可能源于其依赖Cav1.3通道的起搏活动、清除钙的高能量需求以及缺乏钙结合蛋白calbindin的表达（Surmeier和Schumacker，2013）。尚需进一步研究DREADDs是否在SNc和VTA DA神经元中差异增加钙水平，或SNc神经元是否对相同水平的钙升高更敏感。此外，尚不清楚钙增加是直接通过能量衰竭或活性氧(ROS)增加引发退化，还是通过增加胞外DA释放等下游过程间接作用。
讨论
我们的研究表明，持续增加DA神经元活性可产生毒性，SNc神经元比VTA神经元更易受此影响。考虑到DA神经元活性可能因其他死亡DA神经元的代偿或某些致病蛋白作用而增加，我们的数据支持活性增加贡献PD病理生理学假说。证明这一观点并确定其随疾病阶段演变的方式将是未来的重要研究方向。
慢性激活引发退化的机制
空间转录组学分析显示SNc和VTA中DA合成、摄取和储存基因（Th、Slc6a3、Slc18a2）表达下降，可能反映退化前的神经元应激或减少DA释放的代偿。中脑DA神经元中突触传递相关基因（Syt1、Snap25、Snca、Ap2a1）表达减少，与后期观察到的轴突功能障碍和丢失一致。此外，hM3Dq激活引发的胞内钙水平变化（表1），以及Sgk1（钙激活的丝/苏氨酸激酶）表达增加，提示钙可能在活性诱导的退化中起核心作用。
钙通道调节基因的改变（Calm2下调，Trpc6下调）可能反映对慢性钙升高的代偿性反应。有趣的是，Hspa4在小鼠和人类数据中均显著下调。热休克蛋白在清除错误折叠蛋白中发挥作用，但Hspa4在神经元中的功能尚不明确。在帕金森小鼠中，Hspa4去乙酰化与小胶质细胞激活和神经炎症减少相关（Yang et al., 2022）。我们的活性模型中Hspa4表达减少可能表明对炎症的应答失效，促进神经退行性变。
研究局限性与未来方向
本研究的空间转录组学分析细胞类型分辨率有限。未来研究应采用更高空间分辨率分析小鼠组织，并评估PD患者不同疾病阶段、脑区和细胞类型的转录组变化。此外，某些致病蛋白或环路变化可能降低神经元活性，因此需要研究活性增减的场景，以及降低DA活性对退化的影响。有趣的是，慢性尼古丁可能通过激活烟碱型乙酰胆碱受体抑制SNc DA神经元，这可能解释吸烟与PD保护性关联。深部脑刺激(DBS)可能通过抑制亚丘脑核起作用，因此需要研究DBS如何影响DA神经元活性及其对神经退行性变的潜在影响。最近的临床试验数据显示DBS可能延缓早期患者疾病进展（Hacker et al., 2020）。
总之，我们的数据表明持续增加DA神经元活性可产生毒性，SNc神经元对此效应可能更敏感。考虑到DA神经元活性可能因其他死亡DA神经元的代偿或某些致病蛋白作用而增加，我们的数据支持活性增加贡献PD病理生理学至少部分亚型的假说。
【全文结束】
