摘要
基质金属蛋白酶（MMPs）作为前列腺癌（PCa）的诊断和预后生物标志物备受关注。本研究探讨了尿液外泌体MMP水平与前列腺癌发生率之间的关联。研究收集了接受前列腺活检或前列腺切除术的患者以及年龄匹配的健康对照者的尿液样本。共有147名参与者，包括37名在前列腺切除术前提供样本的患者、41名活检结果为阳性的患者、21名活检结果为阴性的患者以及48名健康对照者。研究发现，前列腺癌患者与健康对照者之间的MMP-2表达水平相似，但在活检结果为阴性的患者中显著更高。MMP-9表达在活检结果为阳性的患者中升高，在活检结果为阴性的患者中甚至更高。经年龄调整的多变量逻辑回归显示，MMP-2表达增加与活检结果为阴性的可能性更高相关（OR 1.12 [1.002,1.252]，P = 0.046），而MMP-9表达增加与前列腺癌诊断的可能性更高相关（OR 1.106 [1.002,1.22]，P = 0.045）。这些发现表明，尿液MMP-9水平在前列腺癌患者中升高，但活检阴性病例中更高的水平可能反映了良性前列腺炎症等混杂因素。
引言
前列腺癌（PCa）是男性中仅次于肺癌的第二大常见癌症，也是男性癌症相关死亡的第五大原因。由于前列腺特异性抗原（PSA）血液检测的广泛使用，在实施积极筛查计划的国家，前列腺癌在早期阶段被诊断出来，导致过去十年发病率上升和死亡率改善。尽管PSA检测存在局限性，包括特异性低以及在良性疾病（如良性前列腺增生、前列腺炎、炎症）和年龄增长、前列腺体积增大等情况下的升高，但目前尚无血清、尿液或唾液标志物能够替代PSA在前列腺癌诊断中的作用。临床上使用的前列腺癌基因组标志物主要检测与前列腺癌相关的遗传多态性。商业试剂盒价格昂贵，其作用仅限于识别可能需要前列腺活检的患者、识别高风险进展和转移的患者以及协助医生选择治疗方式。使用基因组、组织和循环生物标志物进行风险分层仍然是一个重要的未满足需求。
基质金属蛋白酶（MMPs），特别是MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）通过降解细胞外基质（ECM）促进血管生成、肿瘤生长、侵袭和转移，已被认为与癌症进展有关。动物研究表明，前列腺癌细胞中MMP-2的表达与生存率降低相关，而MMP-9的表达与更高的转移率相关。
外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，由于其存在于体液中并在细胞间通讯中发挥作用，已成为癌症研究中很有前景的生物标志物。在前列腺癌中，外泌体已被证明可以通过引导正常细胞表达前列腺特异性基因来影响其体外行为，并通过改变肿瘤微环境协助转移过程。
尽管具有潜力，但关于前列腺癌中外泌体衍生MMP的研究产生了不同的结果，一些研究表明其在前列腺癌诊断和预后中具有重要作用，而另一些研究则强调其在前列腺癌风险确定中的次要作用。
本研究旨在探讨尿液外泌体中MMPs的表达水平是否与前列腺癌的发生率和负担相关，并讨论先前研究的方法学局限性，包括样本异质性、检测敏感性和解释阴性发现的挑战。
方法
研究设计和参与者
在获得机构审查委员会批准（IRB批准号IM.DM.08，2015年8月19日）后，2015年至2019年间到美国大学医学中心接受经直肠超声引导（TRUS）活检或根治性前列腺切除术的患者被纳入研究，并提供了书面知情同意书，同意在手术前提供尿液样本以分析尿液外泌体中MMP的水平。随后回顾患者病历，收集患者人口统计学资料、诊断日期、诊断时肿瘤分期和分级、诊断时PSA水平、转移发展情况、随访时总PSA以及疾病进展或死亡日期。在招募患者后，从社区志愿者、医院工作人员和非泌尿科诊所就诊患者的同伴中招募了年龄匹配的男性对照组。所有对照组在过去12个月内均有正常PSA值，无泌尿系统症状或疾病史，也无恶性肿瘤或慢性炎症疾病的既往诊断。通过病史和近期实验室结果审查进行资格筛查。对照组以1:2的比例选择，以减少潜在混杂因素同时确保统计效力。
对于所有三组患者（接受活检、接受前列腺切除术、对照组），采用便利抽样法，即向肿瘤科、泌尿科和初级保健诊所就诊的患者介绍并告知其参与研究的信息。同意参与的患者签署知情同意书并被纳入，拒绝参与的患者则不包括在内。所有组中的患者如果年龄小于50岁，或之前被诊断为任何恶性肿瘤，或之前或目前正在接受任何恶性肿瘤的局部或全身治疗，则被排除在外。此外，活检组中的患者如果因PSA升高以外的原因或与可疑MRI结果一致的直肠指检临床发现可疑而接受活检，则被排除。对照组中的患者如果有任何泌尿系统主诉或任何泌尿系统病史，包括良性前列腺增生，则被排除。尿液样本在任何前列腺癌相关程序之前收集。参与者被分配到三个组：（1）活检阳性+前列腺切除术；（2）活检阴性；（3）健康对照组。
尿液收集
从接受根治性前列腺切除术或活检的患者以及年龄匹配的对照组收集尿液；在任何程序之前。根据机构生物伦理指南，在获得患者和对照组受试者的同意后收集尿液样本。尿液样本在冰上保存不超过2小时，然后储存在-80°C。在分析前，使用Ames Multistix 7试剂条（Miles）测试尿液样本是否存在血液，含有血液的样本被排除在后续检测之外。
尿液中外泌体的纯化
将尿液样本转移到15ml锥形管中，在2,000 x g下离心30分钟。将含有澄清尿液的上清液转移到新的干净15ml管中，不要扰动由细胞和碎片组成的沉淀，然后加入等体积的总外泌体分离试剂；根据Total exosome isolation kit from urine（Cat# 4484452, Invitrogen™, ThermoFischer Scientific, Karlsruhe, Germany）制造商的说明。轻轻涡旋混合，直到溶液变得均匀。将混合物在室温下孵育1小时，然后在10,000 × g下离心1小时。去除上清液而不扰动沉淀，将沉淀重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。分离的外泌体根据后续检测的需要，储存在-20°C或固定在2%多聚甲醛（PFA）中。
通过扫描电子显微镜对外泌体进行表征
将外泌体沉淀固定在2%多聚甲醛中，并在干燥环境中吸附在碳粘附标签上20分钟。用PBS洗涤一次后，将标签转移到1%戊二醛溶液中5分钟，然后用蒸馏水冲洗2分钟，共八次洗涤。将固定的外泌体通过5分钟浸入乙醇梯度（40%、60%、80%和97%）中脱水。乙醇蒸发后，将标签在室温下在玻璃显微镜载玻片上风干24小时。然后将标签安装在铝制样品架上，并用Mira3 LM扫描电子显微镜（SEM）（Tescan, Czech Republic）检查（图1A）。
免疫印迹分析外泌体
为了确认提取的外泌体的身份，进行了蛋白质印迹分析。将50 µg蛋白质加载到10%分离凝胶上，以检测外泌体标志物如TSG101、CD63和CD9的蛋白质表达。使用的不同抗体为：抗-TSG101（Cat# ab125011, Abcam, Waltham, Massachusetts, USA）、抗-CD63（Cat# ab59479, Abcam, Waltham, Massachusetts, USA）和抗-CD9（Cat# 10626D, ThermoFischer Scientific, Karlsruhe, Germany），稀释至工作浓度1 µg/ml。使用化学发光检测适当的辣根过氧化物酶偶联抗体。使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad, Hercules, California, USA）通过Image Lab软件可视化条带（图1B）。
图像获取和呈现
所有凝胶和印迹使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad, Hercules, California, USA）由Image Lab软件成像。主图中呈现的图像被裁剪以提高清晰度并专注于感兴趣的条带，没有修改对比度、亮度或曝光。为确保符合数字图像完整性政策，提供了补充图1S中的原始未裁剪全长凝胶和印迹，包括可见的膜边缘。这些未裁剪的图像代表图2中所示的相同实验。
通过明胶酶谱法检测金属蛋白酶活性
为了评估尿液前列腺癌衍生外泌体中MMPs的表达，进行了明胶酶谱法。将从尿液外泌体中提取的50 µg蛋白质加载到4%堆积凝胶中，并在含有4%明胶的10%聚丙烯酰胺分离凝胶中迁移。使用0.5%的FBS作为阳性对照，以检测不同分子量的MMP-2和MMP-9酶活性。然后用含0.025% Triton X-100的PBS洗涤凝胶两次，每次20分钟，并在含Tris-HCl、CaCl2和叠氮化钠的底物缓冲液中在37°C下孵育过夜。然后用0.5%考马斯亮蓝染色1小时，然后用30%乙醇、10%乙酸和60%水进行脱色步骤。最后，通过生物成像系统可视化凝胶。酶活性在蓝色背景上以白色条带检测。使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad, Hercules, California, USA）通过Image Lab软件量化条带。
统计分析
进行了单变量和多变量分析，以探索MMP表达水平与前列腺癌存在、诊断时总PSA、诊断时临床分期和格里森评分（GS）之间的关系。对提供尿液的前列腺癌患者和健康受试者进行了所有与疾病相关的变量的描述性分析。定量变量报告为中位数和四分位距（IQR）。定性变量报告为计数（频率）和百分比。进行了双变量分析，以探索三个群体组中尿液外泌体表达水平与其他疾病相关变量之间的关系。由于研究参与者中外泌体表达的分布是偏斜的，使用非参数检验（Kruskal-Wallis）比较三个患者组中MMP表达的均值。随后，使用Mann Whitney U检验来辨别两组之间的关系。此外，为了减少异常值的影响，在构建图3时使用了MMP-2和MMP-9表达的以10为底的对数。对所有可用的患者因素进行了探索性单变量逻辑回归分析，并确定了比值比（OR）与95%置信区间（CI）和P值。在单变量水平上P值< 0.1的变量被考虑用于多变量逻辑回归分析。合格变量在第一步同时输入，并进行逐步多变量逻辑回归分析。所有统计分析均使用社会科学统计软件包（SPSS）软件v.26（IBM Corp., Armonk, New York, USA）进行。统计显著性设定为alpha水平0.05。
结果
研究参与者特征
在被邀请参与研究的200名患者中，共有147名参与者（平均年龄61.7岁）同意并提供了尿液样本。参与率为73.5%。在前列腺癌相关程序之前收集尿液样本：62份样本在TRUS引导活检前（42.2%），37份在前列腺切除术前（25.2%），48份来自健康对照组（32.6%）。在62名接受活检的患者中，21名没有前列腺癌（活检阴性），使前列腺癌患者总数为78名（53.1%）对69名（46.9%）无前列腺癌患者。入组时中位总PSA水平为前列腺癌患者6.7 ng/mL（IQR: 4.9-9.6 ng/mL）对活检阴性患者6.5 ng/mL（IQR: 5.4-9.3 ng/mL）。对照组患者没有PSA值。在诊断时，78名前列腺癌患者中有53名（83.4%）的疾病临床分期早于T3，57名（80.3%）的格里森评分低于8。3名患者（3.8%）在诊断时有远处转移，6名患者（7.6%）在随访期间发展为远处转移。总共，52名患者（75.4%）随后接受了前列腺切除术（表1）。在5年的随访中，只有一名患者死亡。
尿液外泌体的分离和表征
从参与者的尿液样本中分离外泌体并进行SEM处理。图1A显示了尿液外泌体的代表性电子显微照片。图1B显示了外泌体特异性生物标志物的表达；证明SEM检测到的膜结合囊泡是外泌体。
尿液外泌体中的MMP表达
在健康对照组、前列腺癌患者（前列腺切除术或活检阳性）和活检阴性患者的尿液外泌体中绘制了尿液MMP-2和MMP-9。酶谱结果显示，前列腺癌患者尿液中在125 KDa和> 220 KDa处有明胶酶活性，分别对应MMP-9/NGAL复合物和MMP-9二聚体（图2A）。与42%和39%的健康对照组相比，87%的前列腺癌患者检测到MMP-2和MMP-9的表达和活性（P < 0.001，图2B）。图2C显示了健康对照组和前列腺癌患者尿液中的明胶酶种类。条带量化强调了前列腺癌患者中MMP-2和MMP-9种类和复合物的活性增加，与其健康对应物相比。
与健康受试者相比，从健康受试者尿液中分离的外泌体中MMP-2和MMP-9的表达较低。为了评估尿液MMP表达是否可用作前列腺癌生物标志物，我们研究了从活检结果为阴性的受试者提取的外泌体中的MMP表达。图3A显示，MMP-2表达在前列腺癌患者和健康对照组之间相似（P = 0.714），但在前列腺活检结果为阴性的患者中显著更高（P = 0.015）。另一方面，与健康受试者相比，前列腺癌患者的MMP-9表达更高（P = 0.016）。活检结果为阴性的前列腺癌患者MMP-9表达水平甚至更高（P = 0.014）（图3B）。总体而言，分析显示，接受前列腺活检后提供尿液样本的患者与健康受试者之间的MMP-2和MMP-9表达不同。
单变量回归分析显示，MMP-2和MMP-9表达与年龄（P = 0.59和P = 0.90，分别）、诊断时总PSA、诊断时分期和格里森评分无关。在多变量逻辑回归并调整年龄后，以对照组为参考，MMP-9表达每增加1 × 10^6，被诊断为前列腺癌的几率增加（OR = 1.106 [1.002,1.22]，P = 0.045），而MMP-2表达每增加1 × 10^6，活检结果为阴性的可能性增加（OR 1.12 [1.002-1.252]，P = 0.046）（表2）。MMP-2表达对被诊断为前列腺癌的可能性没有显著影响（OR 1.08 [0.971-1.202]，P = 0.156），MMP-9表达对活检阴性的可能性没有显著影响（OR 1.097 [0.990-1.214]，P = 0.076）（表2）。
讨论
人们对研究前列腺癌尿液生物标志物的兴趣日益增长，作为一种无创且相对经济有效的诊断方法，用于前列腺癌患者的诊断和治疗计划设计。MMP-2和MMP-9是尿液生物标志物的例子，显示出对患者进行风险分层以筛查和诊断前列腺癌的巨大潜力。
与我们发现前列腺癌患者尿液中MMP-9表达增加相比，几项研究发现，与良性前列腺增生患者相比，前列腺癌患者的血清和前列腺组织中MMP-9表达更高。然而，我们的数据显示，在前列腺活检结果为阴性的患者中，尿液MMP-9表达水平显著。这些患者表现为PSA升高和前列腺MRI上的可疑病变。我们假设，这部分患者中MMP-9表达升高的原因是与前列腺中的炎症变化有关，可能与感染有关。事实上，Sun等人的研究表明，前列腺炎患者的血清MMP-9表达增加。除了在前列腺癌中的作用外，MMP-9还被证明在神经系统、呼吸系统和心血管系统中多种疾病的病理生理机制中发挥重要作用，其在血清和尿液中的表达受身体多种炎症条件的影响，包括自身免疫和特发性炎症疾病。因此，其在前列腺癌诊断和管理中的使用可能受到其他导致尿液、血液和前列腺组织中MMP-9水平升高的混杂因素的威胁。
在本研究中，发现前列腺癌患者与健康受试者之间的MMP-2表达相似。相比之下，Xie等人的系统评价和荟萃分析显示，MMP-2表达增加与前列腺癌相关。活检无前列腺癌的患者中MMP-2表达水平甚至更高，这可能归因于与上述MMP-9表达相似的原因。此外，我们的多变量分析显示了尿液中MMP-2表达的矛盾保护作用。这可能是由于样本量有限，或者可能是由于我们的队列来源人群中前列腺癌的不同遗传行为。事实上，已经确定包括前列腺癌在内的癌症在不同种族和民族之间具有不同的遗传行为，而大多数研究遗传易感性的研究都是在西方国家进行的，来自欠发达国家或发展中国家的数据稀缺，这使我们无法进行有意义的比较。我们的数据显示，MMP-2和MMP-9表达与格里森评分、诊断时PSA和诊断时分期之间没有显著相关性。这与现有数据相矛盾，现有数据显示MMP-2和MMP-9表达升高的患者格里森评分更高，诊断时分期更高，但与现有数据一致，表明其水平与诊断时PSA水平无关。
与我们的结果相似，强调活检结果为阴性的患者亚组中MMP表达甚至更高的研究，生物标志物研究中的几项研究提到了如何省略考虑良性炎症条件的明确定义的对照组可能影响结果的有效性和可推广性。事实上，一项研究表明，在分子水平上，MMP-9过表达发生在围绕前列腺癌细胞的炎症细胞中，而不是前列腺癌细胞本身，这可能部分解释了为什么MMP表达在前列腺癌患者中升高，但在活检无前列腺癌的患者中更高，因为这一患者亚组可能有炎症条件导致PSA升高，从而促使进行活检。
许多研究在建立生物标志物与癌症之间的相关性时，未能区分炎症驱动的升高和恶性肿瘤特异性引起的升高。鉴于炎症可能导致某些生物标志物（如基质金属蛋白酶）水平升高，这一点特别关键。未能考虑对照组中良性炎症条件的生物标志物研究可能会高估这些生物标志物在多种癌症（包括但不限于胰腺癌和乳腺癌）中的特异性。因此，未来生物标志物研究必须包括精心选择的对照组，不仅包括健康受试者或前列腺癌阴性患者，还包括患有良性前列腺炎症疾病的患者，以更好地阐明MMP等潜在生物标志物的真实诊断价值。
我们的研究有几个局限性。我们无法将前列腺癌患者与良性前列腺增生患者进行比较，因为我们缺乏队列中良性前列腺增生病史的数据。此外，我们相对较小的样本量可能使我们无法就MMP表达与其与PSA、格里森评分和诊断时分期的相关性得出显著结果。众所周知，小样本量会降低统计功效，增加I型和II型错误的风险，并可能导致效应大小估计膨胀，从而限制我们研究结果的可靠性和可推广性。此外，其他合并症包括炎症性疾病、类固醇使用、吸烟状况、种族/民族、前列腺癌家族史和其他医疗状况未包含在我们的分析中，它们可能会导致我们一些患者的MMP表达升高。另一个重要局限是缺乏关于先前尿路感染/前列腺炎病史的信息，因为许多患者的这些数据缺失。此外，关于健康受试者是否患有前列腺癌没有信息，因为该组中没有参与者接受前列腺活检。最后，我们的研究可能受到无应答偏倚的影响，因为拒绝参与的个体可能与同意参与的个体有系统性差异，这可能会影响我们样本的代表性。
结论
总之，我们的数据表明，应谨慎评估MMP-2和MMP-9尿液表达作为前列腺癌诊断和管理规划的生物标志物的使用。多种混杂变量可能影响其表达水平，从而阻碍其作为恶性肿瘤可靠指标的使用。然而，需要前列腺活检的患者尿液中MMPs（尤其是MMP-9，其次是MMP-2）水平更高；这意味着尿液MMP水平可能表明需要进行前列腺活检。未来评估MMP-2和MMP-9尿液生物标志物作用的研究应包括具有非恶性前列腺炎症疾病的适当功率的对照组。
【全文结束】
