海藻酚类化合物因其促进健康的潜力而受到越来越多的关注，但它们的生物利用度与肠道微生物群之间的相互作用仍未得到充分理解。本研究探讨了海藻酚类化合物在48小时结肠发酵过程中对肠道微生物群、短链脂肪酸（SCFAs）生成及酚类物质转化的影响。结果表明，在发酵8小时后，Durvillaea potatorum表现出最高的总酚含量（3.14 mg GAE/g），而在0小时时Phyllospora comosa的黄酮含量最高（0.73 mg QE/g）。在12和48小时，D. potatorum的褐藻多酚含量显著增加。Cystophora siliquosa在48小时时抗氧化能力达到峰值（FRAP: 0.14 mg TE/g；TAC: 0.62 mg TE/g），而Sargassum fallax和P. comosa分别在18和24小时时自由基清除活性最高（DPPH: 1.15 mg TE/g；ABTS: 0.36 mg TE/g）。研究发现，补充海藻可调节微生物群，改变微生物群落结构和多样性。此外，P. comosa在12小时时包括乙酸、丁酸、异戊酸和总脂肪酸在内的短链脂肪酸显著增加。这些发现表明，海藻衍生的酚类化合物可能调节微生物组成并增强短链脂肪酸的生成。
尽管酚类化合物具有潜在的健康益处，但由于其分子量大，阻止了其在小肠中的吸收，因此生物利用度有限。低分子量的酚类化合物如酚酸和黄酮单体通常在150至500 Da之间，而高分子量化合物如褐藻多酚和聚合前花青素则超过1000 Da。根据先前的研究，褐藻多酚的质量范围更广（从126到1×10^5 Da甚至更高）。相反，酚类化合物通常到达结肠，在那里被肠道微生物群代谢成具有生物活性的代谢产物。例如，黄酮类化合物如橙皮苷和柚皮苷可能会先转化为其苷元，然后进一步分解为其他酚类化合物。海藻还含有膳食纤维，与酚类一起可能作为益生元，促进有益肠道菌如乳杆菌属和双歧杆菌属的生长。最近的研究表明，其他微生物群包括真杆菌属、罗氏菌属、拟杆菌属、某些梭状芽孢杆菌种、粪球菌属和阿克曼菌也可能参与酚类代谢和短链脂肪酸的生成。
虽然已认识到海藻酚类化合物与肠道微生物群之间的相互作用，但影响微生物组成和代谢输出的作用模式仍不清楚。猪（Sus domesticus）由于其肠道微生物群组成和功能与人类相似，被用作人类消化的良好模型。本研究旨在调查五种澳大利亚褐藻的结肠发酵，重点关注它们对肠道微生物群组成、酚类生物转化、抗氧化潜力和短链脂肪酸生成的影响。研究结果详细揭示了富含酚类的澳大利亚褐藻在结肠发酵过程中如何影响肠道微生物群组成、酚类生物转化和短链脂肪酸生成，从而更好地理解它们在促进肠道健康方面的潜在作用。
澳大利亚褐藻在肠相中的酚类含量
在这项研究中，我们评估了肠相中总酚含量、总黄酮含量和褐藻多酚含量的变化。图1A显示了不同时间点结肠发酵过程中酚类含量的变化，这有助于了解不同海藻之间的生物活性和组成的差异。在所研究的海藻种类中，D. potatorum在8小时时表现出显著高的酚类含量（3.14 GAE mg/g，p < 0.05），与其他种类和时间点相比显著更高。这与之前的一项研究一致，该研究表明酚类含量在8小时时增加。然而，在2小时时，所有种类的酚类含量相似，范围为1.08至1.68 GAE mg/g，这与另一项观察到大多数水解单宁在2小时内被肠道微生物组发酵的研究一致。
胃消化后，约85%的黄酮并未完全释放或消化，仍然需要结肠细菌和酶进行水解。在图1B所示的总黄酮含量测定中，P. comosa在0小时时显示出高水平的黄酮（0.733 QE mg/g）。结肠发酵初期黄酮含量较高可能是由于原花青素的降解增加了酚类含量。D. potatorum在2小时时表现出显著的黄酮含量（0.063 QE mg/g，p < 0.05），而P. comosa在4小时和8小时时显示出较高的水平（0.31 QE mg/g）。在18小时时，D. potatorum再次显示出显著的黄酮含量（0.35 QE mg/g），而在8小时时，D. potatorum（0.25 QE mg/g）和S. fallax（0.32 QE mg/g）也观察到增加的水平。C. siliquosa的黄酮化合物含量最低。
使用两种方法测量了褐藻多酚含量，如图1C和D所示。Folin Denis法捕捉了更广泛的酚类化合物谱，通常比Prussian Blue法得出更高的总酚含量，后者主要检测高分子量酚类。特异性差异解释了不同海藻物种总酚值的观察变化。Prussian Blue法在0小时检测到所有物种中较低的褐藻多酚水平。然而，E. radiata在所有时间段均表现出较高的褐藻多酚含量，其次是S. fallax和C. siliquosa。Folin-Denis法在12小时时显示D. potatorum（0.255 PGE mg/g）、C. siliquosa（0.24 PGE mg/g）和S. fallax（0.20 PGE mg/g）的褐藻多酚水平较高，接着在18小时时S. fallax（0.223 PGE mg/g）和C. siliquosa（0.223 PGE mg/g）也有高水平。在本研究中，酚类水平最初较低，随后在2至18小时期间增加，之后在较晚的时间点逐渐下降。这种模式可能反映了早期可溶性酚类的释放、随后的微生物生物转化、结合酚类的释放以及最终被肠道微生物群降解或利用的过程。这些变化的程度和时间受海藻组成、微生物群动态和发酵条件的影响。
澳大利亚褐藻在肠相中的抗氧化剂含量
在本研究中，我们进行了四种抗氧化剂分析：DPPH、FRAP、ABTS和TAC，如图2所示。不同方法的结果略有差异，这可以归因于它们不同的反应机制。DPPH分析测量自由基清除能力，主要检测氢供体抗氧化剂，如酚酸和黄酮。另一方面，FRAP分析评估抗氧化剂通过将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力，偏爱具有强还原能力的化合物，如褐藻多酚。
在本研究中，S. fallax（1.156 TE mg/g）和C. siliquosa（0.953 TE mg/g）在18小时时表现出高DPPH活性，而所有物种在24小时时FRAP值显著提高，范围在0.07至0.12 TE mg/g之间。这种差异可能是由于每个时间点主导的抗氧化化合物不同，某些黄酮和酚酸优先通过自由基清除机制（DPPH）起作用，而其他化合物如褐藻多酚和单宁则更有效贡献于还原能力（FRAP）。
同样，ABTS分析同时测量亲水性和亲脂性抗氧化剂，在24小时时P. comosa、S. fallax和C. siliquosa表现出高活性，而TAC活性在所有阶段持续存在于S. fallax中，但在C. siliquosa中8小时时缺失。这些差异可以通过抗氧化剂与分析试剂的溶解度和相互作用的变化以及每种物种中存在的不同酚类化合物之间的潜在协同效应来解释。
海藻酚类化合物在体外结肠发酵过程中对微生物群的影响
为了观察各种海藻，包括P. comosa、E. radiata、D. potatorum、S. fallax和C. siliquosa对体外结肠发酵过程中微生物群组成的影响，我们分析了每种海藻浸渍样品的细菌配置。这一分析是通过检查在各个时间点（0、2、4、8、12、18、24和48小时）孵育处理的16S rRNA扩增子进行的。
如图3所示，使用ACE和Chao1两个alpha多样性指数分别评估每种处理的分类群分布以衡量丰富度和多样性。对于ACE，对照组和海藻样品在0小时时表现出高细菌群落丰富度，这一数值在8小时和12小时时有所增加，随后从18小时开始大幅下降。这一模式同样反映在Chao1多样性指数中。在处理组中，D. potatorum样品在0小时时表现出最高的细菌群落丰富度，其次是P. comosa（8小时）和S. fallax（12小时）。
为了评估不同海藻处理在整个海藻结肠发酵过程中微生物群落组成的变化，我们在24小时进行了Bray-Curtis Beta多样性分析。我们的研究结果显示，E. radiata、P. comosa和D. potatorum拥有相似的细菌群落。同样，S. fallax和C. siliquosa也表现出相似的细菌群落。如图4所示，细菌的差异丰度受发酵过程中添加海藻样品的影响。例如，红杆菌目（Erysipelotrichales）的相对丰度受D. potatorum添加的影响。同样，E. radiata样品中更为丰富的猫链球菌属（Catenibacterium）被认为在纤维分解中发挥重要作用。
如图5所示，计算了各处理组在属水平上相对丰度最普遍（>1%）的微生物属，以确定48小时体外结肠发酵过程中特定细菌类群的变化。P. comosa、E. radiata、D. potatorum、S. fallax和C. siliquosa各自以不同方式影响微生物群组成，影响体外结肠发酵过程中不同发酵时间点不同微生物属的相对丰度。总体而言，由于微生物数据解析过程中的删减，一些结果可能丢失或未在较大的数据集中进行分析。每个样本有不同的读取深度，并且必须选择一个相等的深度长度，匹配最低样本的深度。
LC-ESI-QTOF-MS/MS表征和鉴定
LCMS/MS常用于识别和表征海洋海藻中的酚类化合物。这些酚类化合物的定性分析使用LC-ESI-QTOF-MS/MS在正离子化和负离子化模式下进行。质量误差<5或>-5 ppm且个人化合物数据库和库（PCDL）得分>80的化合物被选中进行MS/MS鉴定和表征。总共鉴定出32种酚类化合物，如表1所示，分为酚酸（包括5种羟基苯甲酸和10种羟基肉桂酸）、黄酮（包括3种黄烷醇、4种黄酮、1种黄酮酮、2种黄酮醇、1种花青素和2种异黄酮）和4种木脂素。
没食子酸（化合物2，[M-H]−，m/z 169.0152）和2-羟基苯甲酸（化合物5，[M – H]−，m/z 137.0234）被鉴定出来，由于CO2的损失，在m/z 125和m/z 93处观察到特征产物离子。没食子酸在2小时时在海藻种类P. comosa、E. radiata和S. fallax中被检测到，表明早期微生物水解，可能由乳杆菌属和双歧杆菌属介导，这些菌类已知能够将鞣质和黄酮糖苷裂解为生物可利用的苯甲酸衍生物。
2-羟基苯甲酸在4小时的S. fallax和0小时的E. radiata中被发现，接着在2小时的E. radiata、D. potatorum和C. siliquosa中被检测到，证实了体外试验中总酚类化合物的存在。在本研究中，推测枯草芽孢杆菌属和肠球菌属在将2-羟基苯甲酸羟基化形成2,3-二羟基苯甲酸化合物的过程中发挥了作用，这些化合物在结肠发酵后期被发现，可能会影响这一转化。
咖啡酸（化合物8，[M – H]−，m/z 179.0357）通过m/z 143和m/z 133的产物离子确认，这是由于失去2H2O和HCOOH造成的。该化合物在8小时的C. siliquosa中被检测到。咖啡酸主要与奎尼酸酯化生成绿原酸，先前已被观察到抑制常见病原菌和共生菌株如金黄色葡萄球菌的生长。此外，化合物10（[M – H]−，m/z 147.0446）被暂定认定为肉桂酸，由于失去CO2（44Da）在m/z 103处有产物离子。此外，推测将肉桂酸转化为对香豆酸的微生物为乳杆菌属和大肠杆菌属，这些微生物在本研究中被观察到，可能促进了这一转化。
柚皮素4'-O-葡萄糖苷（化合物23，m/z 741.2286，[M-H]−）被初步鉴定，由于[M–H–rha-glu]−的损失，在m/z 271处的产物离子确认了该化合物。柚皮素已被记录可以直接调节肠道微生物群及其代谢活性，显著降低与胃肠道疾病相关的细菌存在。它还被证明可以减少炎症相关蛋白的表达，减轻硫酸葡聚糖引起的结肠损伤，并增强结肠屏障功能。本研究中，该化合物在48小时的P. comosa和4小时的E. radiata中被发现。与我们的研究结果一致，该化合物先前已在Ecklonia stolonifera中被检测到。此外，在P. comosa中48小时检测到的酚类化合物如柚皮素4’-O-葡萄糖苷，先前已被关联到肠道屏障增强和炎症减少，进一步支持微生物发酵可能增强酚类抗氧化剂生物利用度的观点。这些发现可能表明海藻衍生的多酚不仅能促进产短链脂肪酸细菌的生长，还可能通过微生物生物转化增强抗氧化活性。海藻酚类化合物影响肠道微生物群组成的能力突显了它们作为功能性食品成分促进肠道健康的潜在可能性。不过，未来的研究需要验证并探索这些微生物转化的具体代谢途径，并评估其体内影响。
结论
本研究表明，澳大利亚褐藻富含酚类化合物，在结肠发酵过程中经历了显著的微生物转化，导致抗氧化活性增强、肠道微生物群调节和短链脂肪酸（SCFA）生成增加。在本研究中的物种中，Phyllospora comosa和Durvillaea potatorum表现出最令人满意的结果。P. comosa初始黄酮含量高，在12小时达到SCFA生产的峰值，并存在生物活性微生物代谢物如柚皮素4′-O-葡萄糖苷。这些效果可能归因于其独特的酚类组成和较高的发酵性。另一方面，D. potatorum在8小时时表现出最高的总酚含量，并在12和48小时时显著提高了褐藻多酚水平。它还支持了0小时时最高的细菌群落丰富度。这些结果突显了D. potatorum作为一种丰富的酚类来源和早期发酵过程中微生物多样性的可能调节因子的潜力。使用猪粪便接种物提供了一个生理相关的模型来模拟人类结肠发酵，允许评估微生物变化和代谢物生成。值得注意的是，添加海藻影响了肠道微生物组的丰富度和多样性，表明微生物调节与海藻衍生酚类之间可能存在相关性，尽管需要更详细的分析来证实这一理论。需要注意的是，所使用的海藻样品是全提取物，而不是纯化的酚类，因此基质成分如多糖和蛋白质可能对观察到的生物活性有所贡献。虽然这代表了现实世界中的饮食条件，但仍需进一步研究使用分馏提取物以确定个别酚类的贡献。总体而言，这项研究提出了P. comosa和其他澳大利亚海藻作为开发功能性食品或营养品候选者的潜力。未来的研究是必要的，应集中在这些发现在体内模型中的验证，以确认海藻衍生酚类化合物的健康益处。此外，研究具体的微生物代谢和宿主-微生物相互作用机制将提供更深入的见解，了解这些生物活性化合物如何促进肠道健康。探索海藻衍生功能性食品的配方和稳定性对其成功整合到食品工业至关重要。
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