人类心脏-巨噬细胞组装体模拟免疫-心脏相互作用并实现心律失常疾病建模
卵黄囊来源的胚胎心脏组织驻留巨噬细胞（TRMPs）在发育早期定植心脏，对心脏正常发育至关重要，支持组织重塑、血管生成、电传导、凋亡细胞清除和免疫调节。我们在此通过将自体人多能干细胞（hPSC）衍生的胚胎单核细胞整合到心脏类器官中，开发了一种人源心脏-巨噬细胞组装体（hHMA）模型，生成在生理上相关的TRMPs，这些TRMPs长期存在并对心发生有贡献。通过单细胞转录组学、活体成像和蛋白质组学，我们证明TRMPs调节心脏旁分泌信号、执行凋亡细胞清除，并调控细胞外基质重塑和电传导。在成熟hHMA的慢性炎症概念验证模型中，TRMPs采用促炎表型，通过NOD样受体含吡啶结构域3（NLRP3）炎性小体的激活促进心律失常活动，与心房颤动一致。该系统能够对免疫-心脏相互作用进行详细的机制研究，并为模拟人类心脏发育和炎症驱动的心律失常提供强大的体外平台。
主要发现
- 人类心脏-巨噬细胞组装体模型可模拟胚胎心脏巨噬细胞整合过程
- 组织驻留巨噬细胞调节心脏形态发生和电传导
- 巨噬细胞通过细胞外囊泡（EVs）和凋亡细胞清除途径与心脏细胞通信
- 成熟hHMAs中慢性炎性小体激活可模拟心律失常表型
关键词
- 人源心脏类器官
- 组装体
- 多能干细胞
- 心房颤动
- 心脏发育
- 炎性小体
- 组织驻留巨噬细胞
- 疾病模型
- 胚胎单核细胞
引言
心血管疾病是发达国家死亡和发病的主要原因。尽管如此，我们对人类心脏的大多数认识基于动物模型，这些模型通常不能忠实地再现人类心脏的生理特性，导致临床转化效果不佳。为了克服这些研究限制，人们做出了重大努力来在体外工程化人类心脏模型，类似于心脏的生理特性。随着人多能干细胞（hPSCs）的出现，已开发出协议来在培养中生成更复杂的用于疾病建模、药物研究和其他应用的心脏细胞类型。然而，这些模型通常在反映人类心脏的解剖、细胞和生理复杂性方面存在不足。为了创建更相关的心脏组织，已经开发出基于细胞自组装、生物工程技术或两者的组合方法来创建不同类型的心脏类器官。
在这些心脏类器官模型中，那些依赖于细胞自组织的方法由于能够模拟心脏的结构组织和多细胞组成，最近显示出巨大潜力。过去，我们的研究小组已开发出先进的由hPSCs衍生的人类心脏类器官（hHO）系统。hHOs再现了人类心脏生理的许多方面，包括解剖特征（心室样结构和内皮网络）、功能、细胞复杂性（心室心肌细胞[VCMs]、心房心肌细胞[ACMs]、心脏成纤维细胞[CFs]、心内膜细胞、内皮细胞[ENC]、传导细胞[CCs]和心外膜细胞[EPCs]），以及发育标志，包括心脏管模式形成。尽管取得了这些进展，hHOs仍然缺乏与心脏发育和生理相关的关键细胞群，如神经嵴细胞和胚胎心脏组织驻留巨噬细胞（TRMPs）。
我们对TRMPs在心脏发育中的当前理解主要来自动物模型。在小鼠中，卵黄囊来源的TRMPs在心跳开始后不久出现。随后是胎儿肝脏来源的TRMPs，骨髓来源的TRMPs在骨钙化开始时出现。这些TRMPs对小鼠心脏发育至关重要，有助于电传导、瓣膜重塑、淋巴管形成和内皮网络模式形成等关键过程。虽然TRMPs在人类心脏发育中的确切作用尚未得到充分表征，但它们在胚胎心脏中早在妊娠4-6周就已存在，表明其具有保守且关键的功能。最近的研究开始阐明这些作用：TRMPs已被证明可将心肌细胞(CMs)极化为心室表型，执行凋亡细胞清除，增强收缩力，并通过分泌蛋白和细胞外囊泡(EVs)调节细胞外基质(ECM)组成和细胞间通信。
为了在发育和生理相关背景下研究TRMP功能，我们通过在关键时间点向我们先前描述的hHOs添加hPSC衍生的单核细胞，开发了一个组装体平台，预期这些细胞会自然整合到hHOs中并转变为原生心脏TRMPs，从而形成我们所描述的人类心脏-巨噬细胞组装体(hHMAs)。先前的体外共培养系统已使用单核细胞衍生物来模拟组织特异性发育、维持和病理，包括心律失常条件和与COVID-19相关的心脏功能障碍。然而，这些2D共培养系统缺乏hHOs中存在细胞多样性、组织和高水平的生理相关性。
通过逐步实施与发育和成人心脏生理相关的成熟条件，我们还成功使hHMAs成熟，用于研究心房心律失常，这是一个临床相关的疾病模型，其中TRMP功能和组织微环境都起着关键作用。心房颤动(AF)是最常见的心律失常，其特征是不规则和快速的电活动，可导致中风和心力衰竭。慢性炎症已被认为是AF发病机制的因素，特别关注NOD样受体含吡啶结构域3(NLRP3)炎性小体——一种关键的先天免疫信号复合物。多项临床和实验研究表明，NLRP3的持续激活，特别是在ACMs中，有助于电重构，这是AF的标志。因此，NLRP3炎性小体激活现在被认为是心律失常的主要驱动因素和AF的潜在治疗靶点。我们假设我们的hHMA模型将成为该领域机制和治疗筛选研究的有力工具。
结果
一种发育启发的策略，可有效将自体hPSC衍生的卵黄囊样胚胎单核细胞整合到hHOs中
我们的首要目标是建立一个将心脏TRMPs整合到hHOs中的协议。对第15天和第26天hHOs的单细胞RNA测序(scRNA-seq)证实了内源性TRMPs的缺失，因为未检测到PTPRC、CD68、CD163或CD14等标记物的表达，也未检测到内皮来源的TRMPs，尽管如先前报道的那样存在NFATC1+/CDH5+内皮细胞。因此，我们测试了自体卵黄囊样CD14+ hPSC衍生的单核细胞是否能在适当的时间窗口添加后分化为心脏TRMPs。
时间选择受小鼠和人类胚胎心脏发育的指导：在小鼠中，心跳在E8.5开始，卵黄囊来源的TRMPs在E10.5定植心脏，心外膜形成对该过程是必需的。由于在第7天暴露于CHIR99021可诱导hHOs中的前心外膜器官，因此在该步骤后添加单核细胞。冠状血管在小鼠E13.5出现，在hHOs中最早在第12天出现，支持第7-12天作为单核细胞整合的时间窗口。hHOs的转录组学分析进一步显示，在第7天左右，与白细胞粘附、单核细胞分化和巨噬细胞(MP)趋化相关的基因表达增加。此外，关键粘附分子VCAM1在第11天升高，并与心脏肌钙蛋白T 2型(TNNT2)共定位，与胚胎小鼠心脏中的发现一致。考虑到单核细胞在体外约4天内分化为MPs，我们在hHO分化第8天开始添加单核细胞。
单核细胞使用已发表的分化协议生成，并通过CD14+细胞的磁激活细胞分选(MACS)纯化，因为>94%的人类心脏TRMPs表达CD14。CD14+单核细胞表达PTPRC(CD45)、CD14、CD68和CD163，但缺乏CCR2，与卵黄囊样TRMP前体一致。第8天，hHOs含有约2.9×10^5个细胞，增加到第16天的约4.0×10^5个，表明需要约4.0×10^3-1.2×10^4个单核细胞每hHO以达到生理TRMP水平(心脏细胞的1%-3%)。因此，我们在第8天、第12天和第16天分别添加10,000、20,000或30,000个单核细胞，使用标准hHO培养基而不添加MP特异性补充剂，因为此阶段的hHOs产生支持MP存活和趋化的细胞因子。
早期形态保持不变，但CD45+细胞的整合呈剂量依赖性增加。Z轴堆叠免疫荧光(IF)确认CD45+细胞存在于表面和内部，更倾向于内部区域。到第20天，重复添加20,000-30,000个单核细胞产生了生理相关的CD45+细胞群，与胚胎心脏scRNA-seq数据集一致。在三个hPSC细胞系中确认了稳健性，所有细胞系在添加20,000个单核细胞时都显示出相似的CD45+细胞整合。这些结果共同表明，hHOs可以可靠地接种自体胚胎单核细胞，通过发育自组织生成hHMAs。
整合的单核细胞获得胚胎心脏TRMP命运并在hHMAs中长期存在
为了确认单核细胞分化为心脏TRMPs，IF显示CD45与MP标记CD163共定位。鉴于TRMPs在心脏中长期存在，我们将hHOs和hHMAs培养至第60天。hHMAs比hHOs具有更高的圆形度指数，并在整个第60天保留了TRMPs。TRMP数量在第28天达到峰值，在第36天下降约25%，此后稳定在生理水平(总细胞的1%-3%)。转录组分析进一步证实了TRMP身份：第26天hHOs缺乏TRMPs，而第26天hHMAs中2.1%的细胞是TRMPs。RT-qPCR显示第20天hHMAs与hHOs相比，胚胎心脏TRMP标记物的表达强劲。单细胞RNA测序均匀流形近似和投影(UMAP)显示了一个独特的TRMP簇，表达MRC1、CD74、AIF1、CSF1R、CD68、CD14和PTPRC，但缺乏CCR2，与胚胎TRMPs一致。最后，单细胞RNA测序点图分析确认TRMPs类似于骨髓来源的细胞(单核细胞、MPs和树突状细胞)，而非其他白细胞类型。
TRMPs促进糖酵解活性并改变hHMA形态
基因集富集分析(GSEAs)显示第26天hHMAs与hHOs相比糖酵解基因表达增加。从第16天到第24天测量的氧消耗率(OCR)在大多数48小时间隔内hHMAs显著高于hHOs。第26天的光学相干断层扫描(OCT)显示hHMAs比hHOs具有更大的互连低密度区域，表明MPs对心室形态发生有贡献。OCT显示第20天hHMAs与hHOs相比具有更大的体积压缩和更高的圆形度指数。这些结果共同表明MPs影响hHMAs的代谢活性、形态和结构组织。
心脏TRMPs改变hHMA细胞组成并镜像胚胎人类心脏TRMP谱型
在第15天hHOs、第15天hHMAs、第26天hHOs和第26天hHMAs上进行单细胞RNA测序，以确定TRMPs如何影响细胞群和基因表达。簇分配使用每个簇的前五个差异表达基因和三个经典身份基因完成。TRMPs在第15天占hHMAs细胞的1.7%，第26天占2.1%，与胚胎人类心脏一致。TRMP整合改变了簇组成，第26天hHMAs显示CF、VCM和瓣膜细胞(VC)群体扩大，CC、心脏祖细胞(CPC)、ENC、EPC、基质细胞(SC)和增殖性心外膜来源细胞(PEDC)群体相对于hHOs减少。与胚胎人类心脏数据集的比较确认了相似性，因为第6.5-7周后受孕周(PCW)心脏的关键群体存在于hHMAs中。hHMAs中的CSF1R+ TRMPs与PCW 6.5-7周心脏中的CSF1R+细胞强烈相关(Pearson's r = 0.8, R² = 0.64)。从第15天到第26天，TRMPs下调了M1相关基因CCL2和MIF，表明向组织驻留状态转变。最后，GSEA显示TRMP相关通路富集，包括先天免疫反应、白细胞迁移、肿瘤坏死因子(TNF)产生的负调控和白细胞介素(IL)-10信号传导。
TRMPs分泌SPP1+细胞外囊泡并在hHMAs中贡献于细胞信号传导
TRMPs通过细胞因子、生长因子和细胞外囊泡与其它细胞通信。GSEA显示hHMAs与hHOs相比细胞因子介导的信号传导通路富集。单细胞RNA测序配体-受体(L-R)和差异L-R分析预测MP与所有心脏细胞类型之间的相互作用，前20个中有7个涉及SPP1(骨桥蛋白)，TRMP在胚胎人类心脏中表达的一种蛋白质。IF证实SPP1与CD45+CD163+ TRMPs共定位。
从第20-26天hHOs和hHMAs的培养基中分离的细胞外囊泡(EVs)，通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析显示，hHMA EVs中有150种独特蛋白质，而hHO EVs中只有55种，包括MP特异性蛋白质(LYZ、LPL、CD44、FERMT3、FTL、HLA-DRA、ITGB2、ITGAX、CAPG和SOD2)以及仅在MPs存在下表达的其他蛋白质(CALR、LDHA、TRAP1、MFGE8、PRDX6、VCP、RAN和VCL)。基因本体(GO)和STRING分析显示，hHMA EV蛋白质在内体运输、低密度脂蛋白(LDL)反应、整合素结合、ATP合酶活性、细胞-基质粘附、巨自噬调控、肌动蛋白组织和迁移方面富集，而hHO EV蛋白质在系统发育、细胞生长和增殖通路方面富集。共享的EV蛋白质主要是细胞骨架管家蛋白质。蛋白质印迹证实hHMA EVs中存在显著的SPP1。前18个TRMP配体在第15天和第26天hHMAs中比hHOs表达更高，GO分析将这些配体与上皮-间质转化、补体级联、血管生成、炎症和肌发生联系起来。这些发现验证了L-R预测，并证明TRMPs产生SPP1+ EVs，突显了人类心脏发育过程中巨噬细胞-心脏通信的潜在机制。
hHMAs包含功能性心脏TRMPs，与电系统耦合，执行凋亡细胞清除，改变胶原纤维组织，并增强心室肌发生
TRMPs已被认为与心脏电生理学有关，促使我们检查它们在hHMAs中的作用。第20天hHMAs的共聚焦IF染色显示CD45、TNNT2和连接蛋白43(CX43)表明TRMPs和CMs之间形成缝隙连接，85.2%的TRMPs显示与相邻CMs的CX43连接。CX43在MP-CM接触处的定位表明功能性耦合，RT-qPCR显示AREG显著上调，AREG是调节小鼠心脏中CX43介导的TRMP-CM缝隙连接的调节因子。
活细胞共聚焦成像显示mCherry标记的TRMPs与CMs同步的Ca2+瞬变和动作电位(使用Fluo-4和FluoVolt染料)。离子通道点图分析显示TRMP表达钙和钾通道，包括CACNA1F、KCNA3、KCNJ10、KCNMA1、KCNN4、TRPA1、TRPC2、TRPM2、TRPV2和TRPV4。动作电位持续时间(APD)分析显示TRMPs与CMs相比APD90、APD50和APD30延长。伪批量、行标准化Z分数基因表达热图分析进一步显示，与hHOs相比，第26天hHMAs中与心脏动作电位第2-4阶段相关的基因上调。这些数据共同表明TRMPs有助于hHMAs的电生理活性和成熟。
TRMPs在心脏稳态功能中发挥作用，如凋亡细胞清除。hHMAs和hHOs之间差异表达基因的GSEA显示吞噬作用相关通路富集。通过用MERTK抑制剂BMS-794833处理第20天hHMAs 40天并在第60天评估ApoTracker摄取，测试了TRMPs的MERTK依赖性凋亡细胞清除。未经处理的hHMAs比hHOs或抑制剂处理的hHMAs具有显著更多的ApoTracker+ TRMPs(PI−CD14+细胞)。作为被TRMPs识别的"吃我"信号，钙网蛋白(CALR)与第26天hHMAs中的CD45+ TRMPs共定位，定量分析确认优先定位于CALR+区域。IF染色进一步显示CD45+ TRMPs中MERTK表达显著增加，MERTK是参与心脏TRMP凋亡细胞清除和心脏外泌体处置的受体。这些发现证明hHMAs中TRMP的MERTK介导的凋亡细胞清除，这一角色传统上归因于心脏组织中的TRMPs。
TRMPs还与细胞外基质(ECM)相互作用并重塑ECM。GSEA显示hHMAs与hHOs相比胶原纤维组织基因上调。第26天hHMAs的IF显示COL1A1沉积改变，空间分布更广，熵减少，表明表达更均匀。RT-qPCR证实第20天hHMAs与hHOs相比COL1A1表达增加。这些发现表明自体心脏TRMPs调节hHMAs中的COL1A1组织。
最近的一项研究表明TRMPs在工程化心脏组织中增强收缩力和VCM形态发生。与我们在第26天hHMAs中发现的VCM组成增加一致，GSEA显示肌发生相关基因上调。Musclemotion分析显示hHMAs比hHOs具有更大的收缩幅度，而透射电子显微镜(TEM)显示更短的肌节长度，与收缩的CMs一致。IF确认hHMAs与hHOs相比MYL3表达显著更高。这些数据表明TRMPs在促进hHMAs内收缩力和VCM形态发生中起作用。
在成熟hHMAs中建立AF模型：慢性暴露于AF相关炎症触发物诱导NLRP3激活和心房心律失常
临床和动物研究表明炎症与心律失常发生有关，特别是AF。先前体外AF模型的一个关键限制是缺乏组织驻留和募集的MPs。为了解决这个问题，我们开发了一个高通量炎症hHMA平台，以剖析心房心律失常的细胞和分子驱动因素。我们假设，导致小鼠AF并强烈与人类AF相关的NLRP3炎性小体的慢性激活，可在hHMAs中诱导心律失常。
第20天hHMAs使用发育和代谢协议成熟，然后暴露于生理相关的促炎触发物——脂多糖(LPS)、IL-1β和干扰素-γ(IFN-γ)，这些物质在与AF相关的疾病中观察到，从第30天到第64天以低(Low; 1×)、中(Med; 2×)或高(High; 20×)剂量添加。FluoVolt成像显示，与对照组相比，促炎因子处理的hHMAs中自发不规则节律和异常ACM动作电位波形增加，伴随着搏动率升高和High hHMAs中收缩幅度降低。心律失常现象，包括早后除极(EADs)、迟后除极(DADs)和自发钙升高(SCaEs)，在促炎因子处理的ACMs中显著富集。第64天RT-qPCR证实NLRP3、CASP1、IL1B、CD68、COL1A1、LGALS3和RYR2的剂量依赖性上调，这些基因与慢性NLRP3驱动的AF相关。ECM基因COL1A1、COL3A1、FN1和LAMC1也增加，与AF患者心房一致，VCAM1也是如此，VCAM1是在AF中升高的粘附分子。高倍IF显示Med hHMAs中ACMs的NLRP3表达增加，与对照组相比。NLRP3激活进一步通过Med ACMs中升高的凋亡相关斑点样蛋白含CARD(ASC)斑点确认。
为了测试NLRP3炎性小体激活是否驱动hHMAs中的心房心律失常，我们用NLRP3抑制剂MCC950处理Ctrl和Med hHMAs，MCC950可阻断NLRP3 ATP酶活性并防止ASC斑点和CASP1激活。MCC950从第30天开始应用，与促炎因子暴露同时进行，并在整个培养过程中维持。与Med ACMs相比，Med + MCC950 ACMs表现出显著较少的自发不规则节律和动作电位异常，EADs减少的趋势相似，但DADs或SCaEs没有减少。与Ctrl和Ctrl + MCC950相比，Med + MCC950的搏动频率仍然升高。与Med相比，Med + MCC950的APDs显著延长。IF显示Med和Med + MCC950 ACMs之间NLRP3表达没有差异，但ASC斑点明显减少。这些发现证实了有效的NLRP3抑制，证明慢性炎性小体激活诱导具有AF样特征的自发性心房心律失常，并突显hHMAs作为心房心律失常药物测试的临床前平台。
TRMPs在慢性炎症下采用促炎表型并促进心房兴奋性增加
为了评估炎症-hHMA心律失常模型中TRMPs的功能，hHOs(缺乏TRMPs)和hHMAs(具有TRMPs)暴露于促炎因子(Low、Med和High)和/或NLRP3抑制剂MCC950。FluoVolt成像显示hHOs + Med和hHMAs + Med中的ACMs比对照组搏动更快，hHMAs + Med表现出比hHOs + Med显著更高的速率。与对照组相比，hHOs + Med和hHMAs + Med都表现出增加的不规则节律，包括EADs、DADs和SCaEs，hHOs + Med和hHMAs + Med之间没有差异。对Med hHMAs中CD14+ MACS纯化的TRMPs的RT-qPCR显示NLRP3炎性小体基因(NLRP3、CASP1和IL1B)和促炎细胞因子(IL1B、IL6、CXCL8和TNF)上调，抗炎基因(IL1RN、VEGFA和IGF1)下调，与Ctrl hHMAs中的TRMPs相比。IL10表达在Med TRMPs中显著增加，表明TRMPs试图通过限制或解决正在进行的炎症来反调节炎症过程，这是TRMPs的特征现象。
IF证实Med hHMAs中TRMPs的ASC斑点，这些斑点被MCC950减少，并显示裂解IL-1β与CD45+细胞的剂量依赖性增加共定位。Med hHOs和hHMAs之间ACMs的ASC斑点保持不变。%CD45+区域的定量显示仅在High hHMAs中增加。流式细胞术证实所有组中>95%的CD45+细胞为CCR2−。在Ctrl和Med条件下，第64天hHMAs中ACM和VCM群体保持不变。在增强成熟培养基2/1(EMM2/1)中培养的hHMAs表现出增加的搏动率，而在成熟培养基(MM)中培养的MPs中没有显著的转录组变化(PPARGC1A、OPA1、IGF1和IL6)。这些结果表明，在慢性炎症下TRMPs极化为促炎状态，增强hHMAs中的ACM兴奋性。
讨论
在这项研究中，我们报告了开发一种包含自体心脏TRMPs的hHMA，该模型完全基于发育自组织。我们的研究结果表明，hHOs可以通过整合hPSC衍生的单核细胞有效地被TRMPs定植，模拟胚胎心脏发育过程中MP的浸润。这与hPSC衍生的MPs遵循卵黄囊样发育途径的发现一致。在我们的研究中，hHMAs中的TRMPs不仅在转录组水平上与胚胎人类心脏相比类似于心脏胚胎TRMPs，而且长期存在，这与TRMPs在心脏中的长寿一致。值得注意的是，hHMAs中TRMPs的持久性和分布与已建立的体内数据非常吻合，表明这种体外模型重现了早期人类心脏发育的关键方面。因此，我们的hHMAs提供了一个平台，可以在受控环境中分离和研究TRMPs对人类心发生的影响。
TRMPs影响hHMAs中细胞通信的能力特别引人注目。单细胞RNA测序数据显示，TRMP整合改变了关键心脏细胞类型（如CFs、VCMs和VCs）的组成。这些值得注意，因为TRMPs已被证明在心脏发育和疾病中修饰心脏瓣膜，在心脏伤口愈合和稳态背景下与CFs广泛通信，并且在体外优先诱导工程化心脏组织中的VCM表型。众所周知，TRMP信号传导对于心脏在稳态和疾病背景下的细胞间通信至关重要。我们深入研究了hHMAs的转录组和EV蛋白质组，以确定TRMPs与其他心脏细胞类型之间的潜在通信网络。我们的研究提供了MPs如何在发育性人类心脏模型中与其他细胞类型通信的视角。
关于TRMPs在心脏传导中的作用，我们的数据显示TRMPs通过与CMs形成缝隙连接并参与钙信号传导和动作电位传播，对hHMAs的电生理特性有贡献，证实了过去在啮齿动物中进行的体内研究结果。TRMPs和CMs之间形成的CX43介导的缝隙连接表明功能性耦合，允许TRMPs影响心脏的电传导。活细胞成像进一步证实TRMPs与邻近CMs表现出同步的钙瞬变和动作电位。TRMPs与CMs相比表现出更大的APDs，并与过去关于TRMPs在心脏电生理学中的研究一致。我们推测hHMAs中TRMPs的APDs延长可能是由于固有的离子通道差异，不完全或发育中的电耦合，TRMP运动性或趋化状态引入的变异性，以及可能与非CM细胞类型形成的缝隙连接。因此，显著的MP存在，特别是在房室结中，可能导致传导减慢和异质性，导致心律失常如AF，如最近一项研究所示。
本研究的另一个组成部分是通过激活NLRP3炎性小体在人类心脏平台上模拟心房心律失常发生。ACMs中NLRP3的延长激活导致心律失常特征增加、EADs、DADs、SCaEs、不规则节律和心房搏动率升高，这些都是AF的标志。这些数据提供了令人信服的证据，表明由NLRP3炎性小体介导的MP驱动的炎症有助于人类心脏组织中心房心律失常的发病机制。在NLRP3激活的hHMAs中观察到的分子特征，如参与钙处理、ECM重塑、MP激活和MP募集的基因上调，与患有AF的哺乳动物和人类心脏中的特征相匹配。ACMs和VCMs的同时存在增强了AF的转化相关性，通过允许研究房室相互作用和下游心室效应。此外，NLRP3炎性小体的抑制几乎完全挽救了心律失常表型，除了心房搏动率升高。
关于TRMPs在心房心律失常发生中的作用很受关注。我们发现，在慢性炎症条件下，TRMPs极化为促炎表型，与hHOs（无MPs）相比，hHMAs表现出显著更高的心房搏动率，证明TRMPs增强了心房兴奋性。最近的一项啮齿动物研究表明，每日皮下注射IL-1β增加AF的可诱导性，这是通过与TRMPs上的IL-1R结合实现的，提出TRMPs对AF表型是必要的。另一方面，在没有TRMPs的情况下，通过向hPSC衍生的CMs和3D工程化心脏组织施用促炎因子，在体外诱导了收缩和电生理功能障碍。在我们的研究中，我们发现延长的IL-1β、LPS和IFN-γ暴露导致心房心律失常发生，无论TRMPs是否存在。为了调和这些发现，我们认为直接ACM暴露于促炎细胞因子/因子在慢性炎症下导致心房心律失常发生，这些细胞因子/因子由心房中的TRMPs在局部/系统性炎症反应下产生和分泌。我们假设募集样MPs的添加将显著加剧hHMAs中的心房心律失常表型，这已在体内和体外得到证明。未来的研究应阐明是否可以通过单独重组IL-1β暴露（无LPS和IFN-γ）在TRMPs存在下触发心房心律失常发生。基于MPs在促进心脏传导和炎症如何诱导心脏心律失常中的作用，免疫疗法可能是存在局部/系统性炎症时AF的适当治疗选择。
研究局限性
hHMAs代表了模拟人类心脏发育和疾病的重大进展，但它们仍然是一个无法完全复制成熟人类心脏复杂性的体外系统。它们缺乏功能性血管化、生理机械力和其他细胞类型，如神经嵴细胞、T细胞、B细胞和肥大细胞。其他研究小组已将机械负荷、电起搏和血管化整合到心脏类器官和工程化心脏组织中，提供了重要的互补进展。这些特征对于充分模拟心脏生理至关重要。虽然hHMAs提供了关于组织驻留免疫细胞的宝贵见解，但缺乏系统影响（例如，激素信号）限制了一些发现。最后，我们的心房心律失常研究受到FluoVolt记录获取的放大倍数太高而无法捕获再入现象（例如，兴奋环）的限制，未来整个组装体传导映射将需要评估再入贡献。
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