摘要
囊性纤维化(CF)是一种由CFTR基因突变引起的遗传性疾病，导致CFTR功能受损、粘液积聚、慢性感染和炎症。三联组合疗法elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (ETI)通过恢复CFTR功能，彻底改变了CF的治疗方式。然而，ETI诱导的生理改善如何影响长期存在的菌群失调以及跨微生物组栖息地的病原体定植，目前仍知之甚少。在这项前瞻性纵向研究(DRKS00023862)中，我们分析了35名囊性纤维化患者(pwCF)在ETI治疗前后以及49名健康对照者的痰液、咽喉和粪便微生物组。主要终点是通过16S rRNA基因测序分析呼吸道和肠道微生物组中多样性、物种丰富度和微生物组成的纵向变化。次要终点包括肺功能、全身和胃肠道炎症的变化。我们展示了改善的CFTR功能和ETI的直接抗菌作用如何在痰液微生物组中为金黄色葡萄球菌创造不利的生态位。呼吸道微生物组的变化是即时的，而肠道变化则逐渐显现。粪便中大肠杆菌-志贺氏菌属的丰度在囊性纤维化患者中最初升高，ETI治疗后下降，并与较低的粪便钙卫蛋白水平相关。这些发现表明，ETI可以通过改善宿主生理机能部分逆转CF相关的菌群失调。它们为治疗调控下的宿主-微生物组动态提供了见解，并强调了在复杂临床人群中需要考虑混杂因素的模型。
引言
囊性纤维化(CF)是一种危及生命的疾病，主要影响呼吸系统、消化系统和生殖系统。CF由CF跨膜传导调节因子(CFTR)基因突变引起，该基因编码的蛋白质作为氯离子通道，对调节上皮组织中的离子和水平衡至关重要。突变破坏了这一功能，导致产生粘稠的粘液，可阻塞气道、导管和身体其他通道。这为细菌肺部感染、慢性炎症以及最终进行性肺损伤创造了有利环境。在CFTR调节剂引入CF医疗之前，CF患者需要大量使用抗生素来对抗反复或慢性感染，这最终加剧了CF相关的菌群失调，并促进了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等病原体的选择。
自2019年获批以来，三联CFTR调节剂疗法elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor (ETI)通过改善携带特定突变(包括常见的F508del等位基因)的CF患者的肺功能和临床结局，彻底改变了CF护理。ETI改善了CFTR蛋白功能，虽然其对肺部健康的益处已被充分记录，但其对治疗前普遍存在的微生物菌群失调的影响仍不太清楚。
我们假设ETI通过两种方式调节微生物组：间接地通过改善宿主生理机能，以及直接通过其内在的抗菌特性。为验证这一假设，我们对35名CF患者在ETI治疗开始后24个月内，每3个月进行一次痰液、咽喉和粪便的纵向采样。我们的主要目标是描述这些不同身体栖息地中微生物组对ETI的动态响应。作为次要目标，我们评估了临床参数的同步变化，包括炎症标志物和抗生素使用情况。
本研究显示，ETI在呼吸道和胃肠道微生物组中诱导了显著变化。虽然呼吸道微生物组对ETI的反应迅速，表现为金黄色葡萄球菌丰度下降(由改善的CFTR功能介导)，但肠道微生物组显示出延迟反应，主要由全身抗生素使用减少和胃肠道炎症减轻驱动。我们的体外实验表明，大肠杆菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌等潜在致病菌种对ETI的直接抗菌作用不如其他微生物组成员敏感，后者显示出更高的敏感性。除对CF治疗的意义外，本研究还提供了一个框架，用于理解生理变化如何影响微生物组动态，并探讨已建立的微生物失调可以在多大程度上被逆转，为其他疾病状况提供可应用的见解。
结果
ETI治疗引起的临床改善
本研究招募了35名6-55岁的CF患者，来自德国一家CF门诊诊所。队列特征详见表1。在ETI批准扩展到该年龄组后中途入组的6-11岁儿童，仅提供了治疗前15个月的样本。此外，还纳入了49名健康、年龄和性别匹配的个体作为对照。
为了解决我们异质性队列中的变异性，我们采用了调整了性别和年龄的线性混合效应模型(LME)来分析收集的数据。这种方法证实，观察到的变化不是由于参与者亚组间采样不平衡造成的伪影。虽然年龄和性别显著影响了几个临床参数，但它们对微生物组组成的影响有限。
具体而言，我们观察到ETI治疗后肺功能(ppFEV1)显著提高，中位改善范围为6%至15%(LME，与基线相比FDR ≤ 0.01)。此外，汗液氯化物水平显著降低，中位减少41至44 mmol/L(LME，与基线相比FDR ≤ 0.001)。在某些情况下达到<30 mmol/L的水平，这被认为是健康的。
我们还发现参与者使用抗生素的天数减少，与ETI启动前一年相比，中位减少高达35天(LME，ETI治疗9个月后FDR ≤ 0.001)。全身炎症标志物显著降低，IgG水平与基线相比显示中位减少-1.0至-2.4 g/L(LME，ETI治疗3-21个月FDR ≤ 0.001，24个月FDR ≤ 0.01)。IL-6水平也持续下降，ETI治疗所有月份中位减少7-12.5 mmol/L(LME，与基线相比FDR ≤ 0.1)。然而，白细胞计数或IL-8水平未观察到显著变化。
粪便钙卫蛋白水平从基线时的中位数147 μg/g稳步下降至后续访视时的22-79 μg/g，表明肠道炎症减轻(LME，与基线相比所有时间点FDR ≤ 0.01)。HbA1c的降低(中位数-0.05至-0.55%，LME FDR ≤ 0.05在ETI治疗后6、9、12和18个月)表明胰腺内分泌功能改善。作为治疗副作用，丙氨酸氨基转移酶(ALAT)增加了中位数4-7 µl/l(LME FDR ≤ 0.05在3-12个月与基线相比)，但天冬氨酸氨基转移酶(ASAT)水平保持稳定。
ETI治疗导致一致的临床改善，包括更好的肺功能、降低的汗液氯化物、降低的炎症、更少的抗生素使用天数以及轻微、暂时性的肝酶升高。
痰液微生物组中金黄色葡萄球菌丰度降低驱动ETI治疗后的一致变化
为评估ETI治疗对微生物组的影响，我们首先通过16S标记基因qPCR量化了样本中的细菌负荷，并检测到与基线相比没有变化。
18名CF参与者提供了基线痰液样本，其中11名在ETI治疗开始后至少提供了一个痰液样本。在这些有随访痰液样本的参与者中，我们观察到ETI治疗开始后3个月，细菌组成发生了显著变化，通过BC相异性测量(PERMANOVA按供体分层：基线vs. 3个月样本：R² = 7.4%，p = 0.02)。当比较6个月或更晚收集的样本时，未检测到微生物组成的显著变化(PERMANOVA 6-12个月vs 15–18个月：R² = 2.6%，p = 0.54；6–12个月vs 21–24个月：R² = 2.8%，p = 0.58)，表明最显著的变化发生在治疗的前几个月，之后建立了一个"新的稳定状态"。
在个体样本中，我们观察到痰液Shannon多样性和微生物丰富度显著增加，当与基线相比时，6个月或更晚收集的样本中这一增加变得显著(LME 基线vs 6-12个月：估计值=0.7，FDR = 0.005，估计值=26.8，FDR = 0.001)。
我们进一步调查了分类水平的变化，发现金黄色葡萄球菌优势完全丧失，伴随着金黄色葡萄球菌和葡萄球菌科相对丰度的显著降低。
虽然11个基线样本中有6个以金黄色葡萄球菌为主导，但没有一个随访样本表现出这种模式。相反，微生物组成转向以链球菌、罗氏菌或铜绿假单胞菌为主导。值得注意的是，2名参与者在ETI启动后表现出以铜绿假单胞菌为主导的痰液微生物群，这两人在基线时均无金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌优势。此外，6名最初以金黄色葡萄球菌为主导的参与者中有2名在治疗后显示出铜绿假单胞菌相对丰度增加，尽管未达到优势。
在我们的队列中，ETI治疗导致痰液微生物组组成迅速而持久的变化，表现为金黄色葡萄球菌优势在前3个月内显著丧失，随后微生物多样性增加，新的稳定群落结构以链球菌、罗氏菌或铜绿假单胞菌为主导。
痰液微生物组动态反映药物和生理变化
鉴于ETI治疗后发生的显著宿主生理变化和常规药物的改变，特别是抗生素使用减少，我们进行了考虑混杂因素/协变量的分析，以确定哪些临床参数与痰液微生物组变化最密切相关。
为评估单个协变量如何贡献于微生物群落组成的变异(通过BC相异性测量)，我们应用了两步法。首先，我们使用简单的PERMANOVA独立测试每个协变量，按供体分层，以评估其对变异的边际贡献。除了采样时间点和ETI治疗总持续时间(天数)外，汗液氯化物、粪便钙卫蛋白、吸入DNAse治疗和肝酶GPT被发现显著解释了痰液微生物组组成中的变异。
在第二步中，我们对按供体分层的(N = 31样本)显著临床协变量进行了多重PERMANOVA。汗液氯化物与ETI治疗时间共线(VIF = 4.5)，但DNAse治疗与其独立。因此，当ETI治疗时间从多重PERMANOVA中排除时，汗液氯化物解释了显著的变异。排除ETI治疗时间后，汗液氯化物(R² = 11.2%，p = 0.009)和DNAse治疗(R² = 4.9%，p = 0.03)仍然是微生物组变异的显著贡献者。
为检查临床因素和药物如何影响特定微生物分类群和α多样性测量，我们使用了metadeconfoundR软件包。这种方法应用嵌套线性模型比较来考虑混杂效应，确保仅报告统计上显著的关联。此分析证实，金黄色葡萄球菌相对丰度随ETI治疗时间延长而降低(metadeconfoundR，Spearman's rho = -0.56，FDR = 0.009；混杂因素：汗液氯化物)。然而，这种关联被汗液氯化物水平混淆，汗液氯化物水平与金黄色葡萄球菌减少密切相关(metadeconfoundR，Spearman's rho = 0.57，FDR = 0.015)。通过中介分析进一步验证显示，99.8%的金黄色葡萄球菌丰度减少由汗液氯化物水平变化介导(p = 0.01)，这强烈表明观察到的金黄色葡萄球菌减少是由ETI治疗引起的CFTR功能改善驱动的。
铜绿假单胞菌相对丰度与白细胞计数呈正相关，与肺功能呈负相关(metadeconfoundR：白细胞：Spearman's rho = 0.6，FDR < 0.001；ppFEV1：Spearman's rho = -0.33，FDR = 0.034)，未观察到ETI治疗持续时间的显著影响。亚组分析显示，在铜绿假单胞菌阴性参与者中，ETI导致白细胞计数显著降低，但在总队列中则不然，突显了痰液微生物组对临床轨迹和ETI反应的影响。
此外，我们观察到几种痰液微生物组成员(如奈瑟菌、短小优杆菌群和弯曲菌)的相对丰度增加，与ETI治疗天数呈正相关，独立于其他临床变量。相反，左氧氟沙星吸入与几种微生物组成员的相对丰度呈负相关，并显著降低了痰液多样性。汗液氯化物水平较高与痰液Shannon多样性呈负相关(metadeconfoundR：Spearman's rho = -0.37，FDR = 0.07)，而ETI治疗天数与Shannon多样性(metadeconfoundR：Spearman's rho = 0.34，FDR = 0.02)和观察到的ASVs数量(metadeconfoundR：Spearman's rho = 0.52，FDR < 0.001)呈正相关。
我们的混杂因素意识分析表明，ETI治疗后的临床改善，特别是汗液氯化物水平的降低，通过减少金黄色葡萄球菌丰度和促进微生物多样性，显著影响了痰液微生物组的变化，而铜绿假单胞菌丰度仍与宿主炎症相关，而非ETI治疗持续时间。
ETI的直接抗菌作用可能进一步使金黄色葡萄球菌处于生态劣势
尽管生理变化和日常药物影响微生物组，我们假设ETI可能对痰液微生物组表现出直接的抗菌作用。因此，我们测试了ETI药物对肺部微生物组中常见细菌物种选择的直接抑制作用。elexacaftor和ivacaftor直接减少了包括金黄色葡萄球菌在内的几种痰液微生物组成员的生长，但对铜绿假单胞菌无效。因此，除了改变的宿主生理机能外，ETI的直接生长抑制特性可能有助于为金黄色葡萄球菌创造生态劣势，同时保护铜绿假单胞菌。有趣的是，我们观察到几种痰液微生物组属(如奈瑟菌和嗜血杆菌)的增加，其中一些成员在细菌-药物相互作用测试中未被elexacaftor或ivacaftor靶向。这强调了调节剂抗菌作用对肺部共生菌的潜在生态位塑造影响。
ETI治疗后肠道微生物组组成的渐进式变化
与在呼吸道微生物组中观察到的快速变化相比，肠道微生物组的改变更为渐进。在治疗的前3个月内未检测到显著变异。然而，显著变化开始在6至12个月之间出现(PERMANOVA：基线vs. 6-12个月，R² = 1.1%，p = 0.001)，在更晚的时间点与基线的差异进一步增大(PERMANOVA：基线vs. 15-18个月和21-24个月，R² = 2.6%，p = 0.001)。与痰液样本不同，粪便微生物组随时间继续发散，在后期时间点之间检测到显著差异。
与此同时，我们在后期时间点(15–18个月和21–24个月)与基线相比观察到微生物丰富度(观察到的ASVs数量)显著增加(LME 估计值：10.4和12.8，FDR = 0.029和0.015)。值得注意的是，粪便中大肠杆菌-志贺氏菌属的存在在ETI治疗后减少。
为识别观察到的微生物变化的潜在临床驱动因素，我们执行了两步PERMANOVA分析。在组合PERMANOVA中(排除因数据不足的变量假单胞菌_咽喉_阳性、CRP和钙卫蛋白)，四个变量显著解释了变异：吸入性甘露醇治疗(R² = 1.7%，p = 0.011)；治疗开始后月数(R² = 1.6%，p = 0.002)；采样前365天内全身抗生素治疗天数(R² = 1.5%，p = 0.001)；以及口服皮质类固醇治疗(R² = 1.3%，p = 0.028)。
同时，我们发现观察到的ASVs数量与抗生素治疗天数呈负相关(metadeconfoundR：Spearman's rho = -0.33，FDR < 0.001)，以及口服皮质类固醇使用与Shannon多样性呈负相关(metadeconfoundR：Cliff's delta = -0.25，FDR < 0.001)。
大肠杆菌-志贺氏菌属的减少与粪便钙卫蛋白的减少呈正相关，粪便钙卫蛋白是胃肠道炎症的标志物(metadeconfoundR Spearman's rho = 0.31，FDR = 0.046)。此外，大肠杆菌-志贺氏菌属的相对丰度在服用质子泵抑制剂的个体中更高(metadeconfoundR Cliff's delta = 0.34，FDR < 0.001)，这种关联先前已被发现，并进一步验证了我们的发现。
为跟进这一点，我们调查了大肠杆菌-志贺氏菌属的减少是否可归因于任何CFTR调节剂的直接抗菌活性，并在体外直接药物-细菌相互作用测定中测试了药物敏感性。大肠杆菌不受调节剂的直接影响，尽管几种共生肠道细菌受到影响。
总体而言，粪便微生物组的变化在ETI治疗6个月后变得明显，主要由抗生素和皮质类固醇使用驱动。大肠杆菌-志贺氏菌属的减少与肠道炎症减轻相关，突显了这些微生物变化的潜在健康促进作用。
咽喉微生物组：ETI治疗的细微但稳定变化
我们观察到咽喉微生物组组成从基线到随访样本的明显但细微变化。在基线和随访采样时间点之间发现了显著差异(PERMANOVA：基线vs. 3个月，R² = 2%，p = 0.037；基线vs. 6–12个月，R² = 1.4%，p = 0.014；基线vs. 15-18个月，R² = 2%，p = 0.047；基线vs. 21–24个月，R² = 2%，p = 0.022)。然而，在随访样本之间未观察到显著差异，表明转向"新的稳定状态"，类似于在痰液样本中看到的情况。
与痰液和粪便微生物组不同，我们未观察到ETI治疗后咽喉样本中分类丰度的显著变化。然而，在配对的痰液-咽喉样本子集(N = 90)中，我们发现采样时间点比样本类型解释了更多变异(按供体分层的简单PERMANOVA：R²样本类型= 6.9%，p = 0.001；R²样本时间点= 12.5%，p = 0.013)。此外，咽喉样本中随时间的个体内BC相异性与痰液中显著相关。这表明咽喉微生物组的纵向变化与痰液微生物组的变化平行，暗示对ETI疗法的气道反应在一定程度上是协调的。
重要的是，这种动态同步似乎仅限于呼吸道生态位：我们未观察到粪便-咽喉或粪便-痰液样本之间的类似关系，表明对治疗的特定栖息地反应。
CF患者中的跨栖息地微生物定植结构
为进一步了解CF患者中的跨栖息地微生物定植模式，我们分析了咽喉、痰液和粪便样本之间的微生物群落相关性。BC相异性的PCoA揭示了按样本类型的明显聚类，解释了26%的方差(p ≤ 0.001)。虽然采样时间点不影响肠道-呼吸道比较，但它在痰液-咽喉对中比样本类型解释了更多变异。
痰液-咽喉对表现出最高的个体内相似性，表现为一致的Procrustes排列和较低的BC相异性。相反，粪便-呼吸道对更为不同，反映了不同的微生物群落。在配对的痰液-咽喉样本中，每个部位含有在另一部位检测到的约70%的ASVs。在配对的痰液-粪便比较中，痰液样本包含13%也存在于粪便中的ASVs，而粪便样本与痰液共享10%的ASVs。与未配对样本相比，配对样本在所有位点组合中共享更多ASVs(p < 0.001)，表明在ASV水平上存在可测量的跨栖息地连接性。相关的α多样性指标进一步将上呼吸道和下呼吸道联系起来。
尽管铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌不属于前20个共享ASVs，并且在位点之间的丰度相关性较差，但它们的存在/不存在是一致且具有临床信息的，咽喉拭子以87%的敏感性和77%的特异性预测痰液中的铜绿假单胞菌。
ETI治疗对肠道-呼吸道微生物结构影响最小，肠道-肺轴上没有协调变化的证据。相反，咽喉和痰液样本之间的微生物谱保持紧密对齐，并且比样本类型更受治疗持续时间的影响。这些发现表明局部的、特定栖息地的治疗效果，并突显了咽喉拭子作为CF气道监测中痰液的微创替代品的价值。
与健康对照组的比较：CFTR调节剂疗法使肠道微生物组向健康对照水平转变，减少潜在致病性变形菌门
我们将CF队列的粪便和咽喉微生物组与性别和年龄匹配的健康对照组进行了比较。虽然在所有采样时间点，CF和对照之间在两种类型的样本中微生物组成差异显著，但粪便中方差解释明显大于咽喉(约10%对约3%)。
此外，与CF任何采样时间点相比，健康对照在粪便样本中具有更高的Shannon多样性(例如，LME 对照vs CF基线：估计值= -0.6，FDR < 0.001)。然而，在咽喉样本中未观察到这种模式，pwCF和对照之间的多样性水平更为相似。Wilcoxon检验显示咽喉样本中分类学差异最小，而粪便样本一致显示许多分类群在CF和对照之间显著不同。
我们调查了ETI治疗是否使CF微生物组更接近健康对照。在粪便样本中，几种分类群显示出向对照样丰度的转变。使用IQR-Z分数转换(其中0表示与对照中位数无偏差)，我们分析了52个在基线时与对照显著不同的分类群，并测试它们的Z分数是否随时间向对照收敛。13个分类群表现出显著变化，其中11个显示出向正常化的趋势。变形菌门(包括γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科和大肠杆菌/志贺氏菌属)、毛螺菌科和无害梭菌群的Z分数下降，而厚壁菌门、颤螺菌目、瘤胃球菌科和罗姆布茨菌的Z分数增加，更接近对照。
这些发现表明，CFTR调节剂疗法促进pwCF肠道微生物组向更类似于健康个体的组成转变，特别是在关键微生物分类群方面。
讨论
在本研究中，我们展示了24个月的ETI调节剂疗法如何通过诱导的生理变化和直接抗菌作用，在三个不同身体栖息地(上呼吸道、下呼吸道和胃肠道)重构CF微生物组。据我们所知，这是第一项同时研究CF中这些解剖学上不同微生物组的研究。虽然先前的研究主要描述了与ETI疗法相关的微生物组成变化，但我们旨在揭示驱动这些变化的宿主相关改变。使用考虑混杂因素的统计方法，我们在这种以多种疾病和治疗方式为特征的复杂临床环境中阐明了宿主-微生物组相互作用。
通过考虑临床混杂因素，我们区分了ETI治疗与抗生素使用减少对微生物组成的影响。虽然其他研究报道了肺功能降低与痰液微生物α多样性减少之间的联系，但我们的发现表明，痰液α多样性减少与吸入性左氧氟沙星治疗的关联比与肺功能更强。解除这些关系的混淆至关重要，因为在ETI上的pwCF中观察到的微生物组多样性增加可能由抗生素暴露减少驱动，而不仅仅是由CFTR调节。此外，对ETI的反应可能是位点特异性的。实际上，在我们的解除混淆分析中，痰液微生物组多样性与ETI治疗持续时间呈正相关，而粪便多样性与全身抗生素使用减少更密切相关。
多项队列研究报道了ETI启动后痰液中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌负担的总体下降。然而，许多患者在治疗后仍被相同的病原体定植。有趣的是，一项研究观察到这两种生物均无显著变化，甚至注意到铜绿假单胞菌通过培养检测增加。这些发现指向宿主和病原体(菌株)特异性因素可能是ETI疗法反应可变性的可能贡献者。尽管随访样本量适中，所研究人群的痰液样本清楚地显示了ETI治疗后金黄色葡萄球菌的统计学显著(FDR < 0.05)减少。我们注意到，痰液生产者代表了在临床上与非生产者不同的pwCF子集(表2)，因此这个亚组可能无法完全捕获肺部微生物组治疗反应的谱系。然而，CFTR调节剂疗法显然改变了气道微生物定植格局。因此，金黄色葡萄球菌的适应性优势(如耐盐性)，在CF痰液中盐浓度升高相关，免疫逃避和抗菌素耐药性决定因素，不再为该属在ETI治疗背景下提供适应性优势。此外，中性粒细胞和巨噬细胞中CFTR功能的恢复可能有助于改善金黄色葡萄球菌的清除。我们的研究揭示，金黄色葡萄球菌丰度的减少是由CFTR功能改善(基于汗液氯化物水平降低)和这种CFTR调节剂疗法三个成分中的两个(elexacaftor、ivacaftor)的直接抗菌作用介导的。因此，ETI治疗似乎使痰液微环境对金黄色葡萄球菌定植不利。然而，我们在研究中注意到，气道中的细菌负荷在ETI治疗前或后没有变化。相反，我们观察到金黄色葡萄球菌要么被共生气道微生物组成员取代，要么被包括嗜血杆菌和铜绿假单胞菌在内的呼吸道致病菌属取代。因此，在ETI治疗期间的临床进程，特别是对肺部加重的易感性，可能由金黄色葡萄球菌耗竭后出现的主导气道微生物组决定。
另一方面，铜绿假单胞菌尽管ETI治疗和相关的宿主病理生理学改善仍持续存在。虽然作为慢性炎症标志物的全身IgG水平下降，但血浆白细胞计数在铜绿假单胞菌阳性参与者中保持不变。此外，痰液中铜绿假单胞菌的丰度与白细胞计数相关，突显了其在CF气道中众所周知的促炎特性。与金黄色葡萄球菌不同，ETI活性剂对铜绿假单胞菌没有直接的抗菌作用。虽然一些研究报告铜绿假单胞菌丰度下降，但大多数发现它在大多数ETI治疗的pwCF中持续存在，相同的菌株通常在治疗前后被检测到。这种持续性可能部分反映队列特异性差异；例如，我们的痰液随访队列包括更大比例的具有更先进肺疾病的年长患者，这些因素先前与病原体清除减少相关。除了对ETI活性剂的耐药性外，铜绿假单胞菌在气道中表现出令人印象深刻的基因组可塑性和适应能力。铜绿假单胞菌种群已知即使在ETI环境中也能迅速进化出新变体，可能适应CFTR校正气道中的改变选择压力。我们的发现强调了铜绿假单胞菌的韧性、其在维持炎症中的作用以及其在CF护理中带来的挑战。
在我们的研究中，我们证明了肠道炎症和肠道微生物组组成之间的强关联，特别是在ETI给药背景下大肠杆菌-志贺氏菌属的相对丰度。与先前研究一致，我们观察到与健康对照相比，CF肠道中的变形菌门升高，主要由大肠杆菌-志贺氏菌属驱动。ETI治疗后，变形菌门水平显著下降，大肠杆菌-志贺氏菌属丰度趋向于健康对照受试者中观察到的水平。值得注意的是，大肠杆菌-志贺氏菌属相对丰度的减少与粪便钙卫蛋白的减少相关，与先前将肠杆菌科与ivacaftor进行CFTR调节下的肠道炎症联系起来的研究结果一致。大肠杆菌作为一种兼性厌氧菌，通过耐受更高氧气、使用呼吸电子供体和上皮衍生营养物质(如乙醇胺)在炎症环境中茁壮成长。此外，大肠杆菌具有高能力抵抗宿主衍生的抗菌素和抗生素。因此，ETI期间炎症和抗生素使用的减少可能使大肠杆菌处于劣势，促进微生物组恢复。
鉴于大肠杆菌对炎症环境的适应和抗生素耐药性，ETI期间炎症和抗生素使用的减少可能使它们处于劣势，促进微生物组恢复。这种肠道炎症和肠杆菌科之间的相互关系，在小鼠模型和关于粘附侵入性大肠杆菌(AIEC)的研究中得到了证明，突显了ETI对微生物组生态位和宿主生理学的主动调节。这种对肠道微生物组的调节在临床上具有重要意义，因为pwCF的早期肠道微生物组健康已被证明是比单纯调节剂使用更能预测CF儿童生长结果的更强预测指标。
ETI治疗对咽喉微生物组的变化很小，与先前研究一致。然而，ETI导致痰液产生减少使诊断复杂化，突显了探索咽喉-肺连接的临床重要性。在我们的研究中，咽喉和痰液微生物组变化之间的强烈个体内相关性强调了它们的关系，值得进一步研究，特别是考虑到关于咽喉拭子评估肺部感染可靠性的相互矛盾的报告。
尽管体内人类研究具有挑战性，但我们全面的统计方法是一个主要优势，考虑了抗生素使用、多药治疗、炎症和参与者特异性因素等混杂因素。我们的发现与先前的小鼠模型和临床CF研究一致，加强了它们的有效性，并突显了宿主-微生物组动态。然而，16S rRNA测序的依赖限制了分辨率到属水平，限制了对功能库和遗传适应的洞察。此外，痰液中CFTR调节剂的浓度仍不确定，亚治疗水平可能与抗生素相互作用使病原体处于劣势，如动物研究中所见。体外模型也缺乏关键宿主因素、微生物相互作用和体内药物浓度准确性。尽管我们的样本量适中，但研究设计允许在所研究人群中进行稳健的统计推断，包括FDR控制(< 0.05)，这最小化了虚假发现的风险。尽管如此，单中心设计和较小的亚组大小限制了对具有不同临床特征人群的普遍性。
更大、多中心的队列，延长随访和整合宏基因组、多组学和纵向设计，对于验证和扩展这些发现至关重要。鉴于CF的异质性，特别是CF肺微生物组，此类努力将特别有价值，用于捕捉子表现和人群的全谱(例如，铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌定植vs. 未定植，痰液生产者vs. 非生产者)，并解开塑造该疾病中宿主-微生物组相互作用的各种因素。此外，虽然我们的研究包括长达24个月的随访，但可能后期变化或进一步向健康状态的正常化可能仅通过长期观察显现，为未来研究提供令人兴奋的机会。尽管存在这些局限性，我们的研究通过多部位(呼吸道和肠道)采样、相对较大的匹配健康对照组以及考虑混杂和中介的统计框架，为未来大规模调查提供了必要的基础。总体而言，这项工作代表了理解ETI疗法如何在不同栖息地中调节CF的微生物组-宿主相互作用的关键一步，并突显了通过改善宿主生理机能逆转菌群失调的潜力。
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