摘要
背景：细菌耐药性及生物膜形成已成为全球医疗健康的重大挑战，导致愈合周期延长、自用药增加及治疗失败，进而引发更高死亡率、医疗支出和住院需求。本研究利用从埃及达米埃塔市临床样本分离的奇异变形杆菌PQ350419作为生物纳米工厂，开发了绿色合成的硒纳米颗粒（Se NPs）及其与壳聚糖（CS）和氨苄青霉素（AMP）的复合物（Se/CS/AMP）。通过透射电镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术确认，Se NPs和Se/CS/AMP的吸收峰位于350-360 nm，粒径分别为88-98 nm和86-129 nm，表面电位分别为-24.27 mV和-23.92 mV，表明其具有优异稳定性。该复合物对蜡样芽孢杆菌（MIC 30 µg/ml）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MIC 40 µg/ml）、肺炎克雷伯菌（MIC 60 µg/ml）和奇异变形杆菌（MIC 100 µg/ml）均表现出强效抗菌活性，显著优于单独的Se NPs和AMP。透射电镜显示，处理后的细菌出现细胞壁畸变、膜分离、空泡形成和完全裂解。100 µg/ml Se/CS/AMP可抑制50%的生物膜形成，且对Vero细胞的细胞毒性（CC50=199.09 µg/ml）显著低于单独Se NPs（CC50=40.95 µg/ml）。该成果为工业、医疗和环境领域的抗菌治疗提供了安全高效的替代方案。
材料与方法
样本采集：2024年4-5月间从埃及达米埃塔市3家医疗机构收集22例临床样本（尿液、粪便、表面拭子），纳入20-50岁感染患者，排除系统性疾病或免疫缺陷患者。样本经血琼脂培养后，通过Vitek 2系统鉴定出5株奇异变形杆菌（AUF1、AUF4、DUF、EUF18、FUM2），其中AUF1用于后续实验。
抗菌敏感性试验：采用纸片扩散法评估奇异变形杆菌对氨苄青霉素、阿莫西林/克拉维酸等9类抗生素的耐药性。结果显示：80%菌株对左氧氟沙星和万古霉素耐药，100%对氨苄青霉素、阿莫西林/克拉维酸、多西环素和头孢他啶耐药，证实其多重耐药特性。
生物膜形成检测：通过结晶紫法检测到2株（AUF1和FUM2）为强生物膜生产者，其余为弱生产者。这一结果与Wang等通过临床尿样分离的奇异变形杆菌研究一致。
结果
Se/CS/AMP的表征：
- FTIR光谱：Se NPs在544.792、693.284、1063.55 cm⁻¹等波长显示蛋白特征峰，证实其与纳米颗粒表面结合形成稳定结构
- XRD分析：在23.620°、30.051°等角度出现硒晶体特征峰，晶格常数a和c均小于4Å，与JCPDS标准数据（No. 06-0362）一致
- TEM观测：Se NPs呈均匀球形（88-98 nm），Se/CS/AMP粒径范围为86-129 nm，与Hassan等报道的Streptomyces parvulus合成结果（39.7-98.1 nm）相似
- Zeta电位：Se NPs和Se/CS/AMP表面电位分别为-24.27 mV和-23.92 mV，负电荷主要源于带负电的结合蛋白和壳聚糖的去质子化
抗菌活性：
| 浓度 (µg/ml) | Se NPs抑菌圈 (mm) | Se/CS/AMP抑菌圈 (mm) |
|---|---|---|
| 150 | 22±0.03 (B. cereus) | 25±0.12 (B. cereus) |
| 150 | 13±0.06 (S. aureus) | 18±0.09 (S. aureus) |
Se/CS/AMP对革兰氏阳性菌（如B. cereus）的抗菌效果显著优于革兰氏阴性菌，与纳米颗粒更易穿透前者多孔细胞壁的特性相关。最小杀菌浓度（MBC）为100 µg/ml（Se NPs）和30 µg/ml（Se/CS/AMP），符合杀菌剂标准（MBC≤4×MIC）。
生物膜抑制：在150 µg/ml浓度下，Se/CS/AMP对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌的生物膜抑制率分别达到60%、45%和38%，显著高于单独使用Se NPs（约22%）。这与Khiralla等关于壳聚糖稳定Se NPs的研究结果一致。
细胞毒性：通过MTT法检测Vero细胞活力，Se/CS/AMP的CC50（199.09 µg/ml）显著高于Se NPs（40.95 µg/ml），符合El-Fawal等报道的生物合成纳米材料低毒性特征。
结论
本研究通过基因测序将奇异变形杆菌PQ350419（GenBank登录号PQ350419）用于绿色合成Se/CS/AMP纳米复合物。该材料对耐药菌株（如MRSA）表现出强效抗菌活性（MIC 30-100 µg/ml），且生物膜抑制效率提升88%。纳米颗粒的抑菌机制包括细胞壁破坏（TEM观察到膜分离和空泡化）、ROS产生和代谢基因表达抑制。该复合物对Vero细胞的低毒性（CC50=199.09 µg/ml）证实了其生物安全性，为应对抗生素耐药危机提供了创新解决方案。
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