摘要
睡眠失调具有广泛的健康后果，包括DNA损伤的累积。墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）为研究睡眠丧失的进化及其后果提供了一个强有力的模型。该物种的多个洞穴适应种群已经独立进化出比地表种群更少的睡眠，但却没有表现出健康寿命或寿命的明显下降。为了检验进化而来的睡眠减少是否与DNA损伤相关，我们比较了不同种群间的DNA损伤应答（DDR）和氧化应激。洞穴鱼在大脑中表现出升高的γH2AX水平和肠道中增加的氧化应激，这与慢性睡眠剥夺一致。在急性紫外线照射后，地表鱼增加了睡眠并激活了光修复途径，而洞穴鱼则没有。从两个种群衍生的成纤维细胞系证实了洞穴鱼中DDR和修复能力的减弱，支持了急性DNA损伤应答的衰减。转录组分析显示，在地表鱼中随年龄差异表达的许多基因在洞穴鱼中保持不变，这表明衰老相关通路的调控发生了改变。总之，这些发现表明洞穴鱼虽然经历了睡眠剥夺的细胞标志物升高，但对长期后果表现出韧性，这突显了一个进化模型，可用于研究睡眠、DNA修复和健康衰老背后的机制。
引言
睡眠在动物王国中普遍存在，已在具有相对简单神经网络的动物中被发现，包括从水母和线虫到灵长类动物，这表明睡眠具有古老的功能和共同的进化起源（Aulsebrook等，2016；Joiner，2016；Keene和Duboue，2018；McNamara等，2009；Zimmerman等，2008）。虽然睡眠的主要功能尚未完全理解，但它对许多过程至关重要，包括神经连接、有毒代谢物的清除、免疫、学习和记忆（Frank，2020；Hartmann，1973；Siegel，2005）。越来越多的证据表明DNA损伤可能在睡眠驱动中发挥重要作用（Carroll等，2016；Vaccaro等，2020；Zada等，2021；Zada等，2019）。DNA损伤与长时间清醒有关，并在包括线虫、斑马鱼、小鼠和人类在内的众多物种中在睡眠期间减少（Bellesi等，2016；Cheung等，2019；Goetting等，2020）。相反，睡眠中断与DNA损伤相关，睡眠剥夺（SD）抑制了人类DNA修复基因的表达（Carroll等，2016；Goetting等，2020），这表明睡眠对维持基因组完整性和功能具有关键作用，以及睡眠丧失与DNA损伤之间的关联，可能导致神经退行性疾病。此外，睡眠丧失导致肠道和/或大脑中活性氧（ROS）水平升高，这是DNA损伤的已知介质，在果蝇中导致死亡（Haynes等，2024；Vaccaro等，2020）。睡眠丧失对肠道ROS产生的影响在小鼠中也存在（Vaccaro等，2020）。尽管取得了这些进展，但对睡眠丧失的细胞后果或DNA损伤与睡眠调节之间的进化关系知之甚少。
通过考察进化衍生的睡眠差异的比较方法，已为理解睡眠调节的遗传和功能基础提供了重要见解（Allada和Siegel，2008；Cirelli，2009；Zimmerman等，2008）。虽然大多数鱼类睡眠研究使用斑马鱼，但墨西哥脂鲤Astyanax mexicanus是研究行为和生理特征的遗传和进化基础的新兴模型（Keene等，2015；Keene和Appelbaum，2019；Kowalko，2020；McGaugh等，2020a；Yoshizawa，2015）。A. mexicanus以盲眼洞穴种群和现存地表种群的形式存在；虽然地表和洞穴种群在地理上是隔离的，但它们仍可杂交并在自然和实验室环境中杂交（Moran等，2023）。在此系统中，地理和地质隔离的洞穴种群之间存在相似的睡眠丧失表型（Aspiras等，2015；Duboué等，2011），不同洞穴之间可能具有独特的遗传基础（Duboué等，2011；Mack等，2021；Yoshizawa等，2015）。此外，在迄今为止研究的三个洞穴种群中都已鉴定出DNA修复基因的进化差异，包括调节睡眠、光反应性和DNA修复的机制之间的联系（Beale等，2013；Mack等，2021）。这些发现支持了睡眠的遗传和分子基础与洞穴鱼中DNA修复过程密切相关。
考察导致睡眠调节进化变化的生态因素及其对这种睡眠丧失的生理后果，有可能解决睡眠的基本功能。例如，在人类中，失眠与许多不同疾病和发病率增加相关，表明睡眠对健康衰老至关重要（Arble等，2015；Carroll和Prather，2021）。令人惊讶的是，洞穴鱼每天睡眠仅为1-2小时，而其地表对应物则每天睡眠6-10小时（Duboué等，2011）。尽管睡眠显著减少，但洞穴鱼没有表现出明显的健康后果，这表明它们对睡眠丧失建立了韧性（Cobham和Rohner，2024；Riddle等，2018a；Rohner，2018）。考虑到DNA断裂水平的变化与果蝇、斑马鱼、小鼠和人类中的睡眠调节相关（Bellesi等，2016；Carroll等，2016；Zada等，2021），内在的DNA修复和DDR通路变化可能导致洞穴鱼睡眠需求减少。
在此，我们试图研究DNA损伤与睡眠进化之间的关系，以测试洞穴鱼在细胞和有机体水平上是否具有慢性睡眠剥夺和加速衰老的标志物。我们发现洞穴鱼大脑中的DNA损伤升高，这与睡眠丧失与DNA损伤水平升高相关的观点一致。洞穴鱼对紫外线损伤的转录和行为反应减弱，洞穴鱼细胞表现出减弱的DNA修复能力，这表明减弱的DDR功能可能是洞穴鱼睡眠丧失的原因。为了检验DDR减弱的长期后果，我们检查了年轻和年老地表鱼和洞穴鱼的转录差异。虽然地表鱼中的衰老与跨组织类型的广泛转录变化相关，但年轻和年老洞穴鱼之间相对较少的转录差异。总之，这些发现表明，尽管DNA损伤可能源于睡眠丧失，洞穴鱼似乎已经发展出对衰老的分子韧性。
结果
在脊椎动物中，包括斑马鱼和A. mexicanus等硬骨鱼类，DNA损伤激活了一个高度保守和典型的应答和修复程序。DDR蛋白的标志物可以在细胞和整个有机体水平上定位和量化。组蛋白H2AX在丝氨酸139位点的磷酸化（γH2AX）提供了对DNA双链断裂的细胞应答的既定且可量化的生物标志物，这对修复复合物的组装是必需的（Siddiqui等，2015）。我们在ZT0时比较了地表鱼和Pachón洞穴鱼大脑中的γH2AX水平，此时两个种群在行为上活跃且睡眠最少（图1A-B和图1—视频1）。与地表鱼相比，洞穴鱼的菱脑、端脑和中脑中的γH2AX水平升高（图1C）。这些发现表明，与地表鱼相比，短睡眠的洞穴鱼中DNA损伤升高。
睡眠丧失与肠道功能下降相关，包括ROS的累积（Vaccaro等，2020）。为了检查睡眠丧失的标志物是否延伸到A. mexicanus的肠道，我们比较了地表鱼和洞穴鱼肠道中的ROS。6天龄的鱼在ROS标志物二氢乙啶（DHE）中孵育，并在共聚焦显微镜下对肠道进行成像。我们发现洞穴鱼肠道中的ROS上调，这强化了这些短睡眠鱼中细胞应激和DDR的典型标志物升高的观点（图1D-G）；ROS水平在胃、小肠和大肠中升高，但在直肠中未升高（图1G）。成像前，地表鱼和洞穴鱼都在温度控制的孵化器中培养，并仅依靠卵黄囊获取营养；因此，肠道ROS的差异不能归因于培养或喂养条件的差异。总之，这些发现加强了洞穴鱼相对于地表鱼肠道中细胞应激升高的观点。
为了进一步检查A. mexicanus中DNA损伤和睡眠之间的直接联系，地表鱼和洞穴鱼暴露于短时间的UV-B辐射中，已知这会导致DNA损伤并诱导双链断裂（Zada等，2021）。在地表鱼中，UV照射导致睡眠在长达3小时内呈剂量依赖性增加，类似于斑马鱼中的发现（Zada等，2021；图2A和B）。有趣的是，地表鱼在夜间睡眠减少，可能是白天睡眠增加导致的睡眠信用的结果（图2A；Öztürk-Çolak等，2020）。地表鱼睡眠量的增加由睡眠发作次数增加介导，在较高剂量下，睡眠发作长度也增加（图2C和D）。相反，UV处理对洞穴鱼白天或夜间的睡眠没有影响（图2E-H）。
睡眠-觉醒概率的分析与这些测量结果一致，显示地表鱼在处理后3小时内睡眠压力升高和觉醒压力降低；而在洞穴鱼中，没有变化（图2—图补充1）。这些结果证实UV诱导的DNA损伤促进了A. mexicanus地表鱼的睡眠，而这种反应在洞穴鱼中丧失。
我们检查了在明周期时间（ZT）0（光照开始）高剂量（60秒）UV处理对地表鱼和洞穴鱼转录反应的影响。6天龄的鱼在UV照射后90分钟收获用于RNA提取（图3—图补充1）。RNA表达的PCA分析显示，驱动样本间转录反应变异的最大因素是种群，主成分1按种群分离样本并解释了86%的方差。主成分2按处理分离样本并解释了9%的方差（图3B）。分析揭示了许多在两个种群中差异表达的基因，包括RNA聚合酶调节转录因子fosl1a的上调和spi-c的下调（图3C）。许多基因选择性差异表达，包括地表鱼中热休克蛋白hspb9的上调和洞穴鱼中葡萄糖传感器gck的下调（图3C，图3—图补充1）。为了确定DDR通路是否在UV照射后在洞穴鱼中激活，我们量化了地表鱼和洞穴鱼中通路成分的变化。在地表鱼中显著上调的DNA修复基因的热图显示，几个DNA修复通路的成分在UV处理后的洞穴鱼中差异表达（图3D）。值得注意的是，环丁烷嘧啶二聚体光解酶（cpdp），UV诱导DNA损伤光修复通路的重要组成部分，在地表鱼中反应强烈，但在洞穴鱼中没有反应。尽管先前的研究组报告说cpdp在成年洞穴鱼中组成性上调（Beale等，2013），但我们的分析与这一发现不符；然而，这可能是由于所研究的年龄或昼夜时间点的差异。对先前洞穴鱼昼夜转录组研究的更详细分析显示，两个DDR基因在昼夜周期的某些阶段升高，但并非所有阶段（图3—图补充2）。此外，xrcc3（人类rad51的旁系同源物，对同源重组很重要）和fan1（Fanconi贫血通路的组成部分）对洞穴鱼中的UV-B处理没有反应。相反，ube2al（对复制后DNA修复必需）在洞穴鱼中可能比地表鱼更强地激活。总之，这些发现表明洞穴鱼中的DNA修复过程经历了复杂的变化，一些通路变得无功能，而其他通路可能被上调以补偿其他区域的功能丧失。为了更全面地理解UV-B处理导致的转录变化，对地表鱼和洞穴鱼进行了基因集富集分析（GSEA）。大量通路在两个种群中富集（图3—图补充1）；为了检查两个种群转录反应之间的差异，我们识别了仅在地表鱼或洞穴鱼中富集的通路（图3E）。只有地表鱼显示出与ROS反应和细胞氧化还原稳态相关的基因的显著激活，这与洞穴鱼中ROS升高的测量结果一致，而洞穴鱼显示出与代谢过程相关的基因的激活和与突触信号相关的基因的抑制，表明对DNA损伤的反应改变。
为了在细胞水平上量化DNA损伤，我们建立了从地表鱼和Pachón洞穴鱼胚胎衍生的成纤维细胞系（图4—图补充1）。简而言之，我们在受精后12小时内解离并灭菌胚胎细胞，并分离在40多次传代中传播的单个克隆。为了确认细胞系确实代表成纤维细胞，我们用波形蛋白（已知的成纤维细胞标志物）对细胞进行了染色（Satelli和Li，2011）。两个细胞系均表现出稳定的波形蛋白表达（图4—图补充1）。我们通过RNA测序进一步验证了细胞系的成纤维细胞性质，显示与其他细胞类型（包括同一物种先前建立的肝源细胞系（Krishnan等，2022））相比，其他成纤维细胞特征基因（如col1a1）的表达增强。
我们接下来使用新生成的成纤维细胞系来测量UV辐射暴露后的DNA损伤水平。我们将细胞暴露于100 J/m² UV辐射下，并使用针对环丁烯嘧啶二聚体（CPD）的抗体可视化UV诱导的DNA损伤，作为DNA损伤标志物。地表鱼和洞穴鱼衍生的细胞系均表现出强烈的CPD诱导，表明明显的UV诱导DNA损伤（图4A）。我们使用ImageJ的Cellpose功能量化了细胞核区域的平均荧光，发现两个衍生细胞系之间没有显著差异（p=0.6404，双向方差分析，图4B）。
为了评估不同细胞系中相似水平的DNA损伤是否导致DNA损伤修复的变异，我们量化了UV处理后的γH2AX水平。在暴露后每两小时测量一次，持续6小时。地表鱼细胞显示出γH2AX的明显增加，而洞穴鱼细胞系仅显示出轻微上升，这意味着洞穴鱼细胞的UV损伤修复能力减弱（图4C和D）。为了验证这些结果，我们在肝源细胞系（Krishnan等，2022）上重复了这些实验，并观察到洞穴鱼衍生细胞在辐射暴露后γH2AX水平降低的类似趋势，而地表鱼细胞显示出强烈诱导（图4—图补充1）。这种模式表明DDR差异不仅限于组织类型。为了直接测试修复DNA的能力，我们采用了宿主细胞再激活测定法（Nagel等，2014；Tian等，2019）。简而言之，绿色荧光蛋白（GFP）质粒用600 J/m² UV处理。我们将细胞系转染完整或体外UV损伤的GFP质粒，并使用流式细胞术在50小时后跟踪GFP荧光恢复，作为宿主细胞修复质粒能力的代理（图4G）。与γH2AX发现一致，UV损伤质粒转染的洞穴鱼细胞显示出比地表鱼细胞（相对于对照约49%）明显更低的GFP信号恢复（相对于对照约22%）（图4E和F）。这些表明DNA修复能力减弱的观察结果，与我们在UV处理的鱼幼体中观察到的睡眠行为差异一致。
大脑中的DNA损伤、肠道中的ROS和睡眠丧失与衰老相关（Carroll和Prather，2021；Maynard等，2015；Schumacher等，2021）。虽然A. mexicanus洞穴鱼进化出了许多对人类或其他物种有害的特征，但有证据表明它们也进化出了代谢和生理韧性，使它们能够享受与地表鱼相似甚至延长的寿命（Lunghi和Bilandžija，2022；Medley等，2022；Riddle等，2018a）。为了检查大脑中DNA损伤长期累积、肠道ROS升高和睡眠丧失的影响，我们检查了年轻和年老鱼的组织转录谱。简而言之，我们解剖了年轻（约1岁）和年老（7-8岁）地表鱼和Pachón洞穴鱼的大脑、肠道、肝脏、肌肉和心脏。大脑样本的PCA分析显示种群对样本方差的强烈贡献，样本在PC1上按种群分离并解释了51%的方差（图5A）。有趣的是，虽然地表鱼样本在PC2上按年龄分离，但洞穴鱼中没有按年龄分离样本（图5A）。肠道中的基因表达也呈现出相同的趋势（图5—图补充1）。心脏和肝脏中基因表达的PCA图在种群或年龄上均未显示明显分离，而肌肉组织显示按种群分离，但不按年龄分离（图5—图补充1）。为了检查对更广泛转录组的影响，我们比较了地表鱼和洞穴鱼年轻和年老种群之间差异表达的基因数量。在所有组织中，地表鱼在大脑、肠道、心脏、肝脏和肌肉中年轻和年老之间差异表达的转录本明显多于洞穴鱼（图5B）。总之，这些发现表明，尽管睡眠丧失、ROS升高和DNA损伤，洞穴鱼的转录组对年龄相关变化表现出韧性。
我们试图检查地表鱼和洞穴鱼之间差异表达的特定基因，提供对DNA损伤和睡眠丧失韧性的潜在机制。因为睡眠被认为是神经元DNA损伤修复所必需的，我们首先检查了衰老地表鱼和洞穴鱼大脑中的转录差异。在大脑中，只有五个基因在两个种群中都显示出显著变化；其中包括基因top2a，在两个种群中均减少（图5C）。Top2a被认为是染色体结构维持在细胞分裂过程中所必需的。有趣的是，GSEA分析没有揭示衰老地表鱼大脑中任何显著富集的通路，尽管差异调控基因数量很高，而衰老洞穴鱼大脑显示出与染色体凝集和分离相关的基因集的抑制（图5D）。这些过程已知由于未修复的DNA损伤而随年龄恶化，特别是在大脑中（Barroso-Vilares等，2020）。在非大脑组织中，我们发现多种过程富集，其中一些在组织和种群之间重叠，而另一些则没有，这与衰老是由多种因素控制的复杂过程的观点一致（图5—图补充2）。总之，这些结果表明，尽管DNA损伤水平升高和DNA损伤和修复机制受损，洞穴鱼至少部分地免受其有害影响，并在衰老过程中表现出减少的转录变化。
讨论
我们研究了A. mexicanus中DNA损伤和DDR通路的差异，这是进化睡眠丧失的模型。UV和其他诱导DNA损伤的物质促进多种动物的睡眠，表明DNA损伤和睡眠调节之间存在基本且高度保守的关系（Bellesi等，2016；DeBardeleben等，2017；Zada等，2021）。同样，我们发现Pachón洞穴鱼大脑中的DNA损伤和肠道中的ROS水平比地表鱼高。这些发现与睡眠剥夺的无脊椎动物和哺乳动物的表型一致，支持洞穴鱼处于睡眠剥夺状态的观点（Bellesi等，2016；Vaccaro等，2020）。除了Pachón洞穴鱼种群外，迄今为止测试的另外两个幼体洞穴鱼种群与地表鱼相比睡眠减少（Duboué等，2011；Jaggard等，2020）。需要进一步研究这些种群中的DNA损伤，以确定睡眠丧失的细胞效应是否在独立进化的洞穴鱼种群中保守（Moran等，2022；Yoshizawa等，2015）。有许多物种已经进化出睡眠丧失，特别是在定义的生态背景下，包括放弃睡眠的新生鲸类、在繁殖季节抑制睡眠的北极燕鸥，以及在长时间飞行中减少和单侧睡眠的军舰鸟（Lesku等，2012；Lyamin等，2005；Rattenborg等，2016）。在自然生态背景下和睡眠改变的进化模型中调查DNA损伤和其他睡眠丧失标志物的存在将是非常有益的。
多项研究现已揭示了不同洞穴鱼物种中睡眠、运动行为和DNA损伤的变化（Keene等，2024）。这些变化在自然环境中的适应价值及其对寿命的影响仍知之甚少。需要额外的实验来解决睡眠和DNA损伤之间的细胞关系。在斑马鱼中，睡眠丧失诱导DNA损伤，而诱导DNA损伤促进睡眠（Zada等，2021）。这些发现表明DNA损伤有助于睡眠稳态。我们之前已经表明，洞穴鱼在睡眠剥夺后反弹，表明它们保持了完整的睡眠稳态（McGaugh等，2020b）。
我们的细胞分析进一步揭示了洞穴鱼中DDR减弱，这可能有助于体内观察到的DNA损伤增加。由于光解酶主要用于修复UV诱导的环丁烯嘧啶二聚体，其修复过程也依赖于光输入（Liu等，2011），这些基因可能在洞穴鱼中未被自然选择所青睐，导致累积突变和功能性DNA损伤应答丧失。这一假设得到索马里洞穴鱼失去了诱导DDR所需的DNA修复增强子的研究发现的支持（Zhao等，2018）。墨西哥洞穴鱼保留了一些光诱导DNA修复能力的事实可能归因于它们与其地表对应物相对较近的分化，估计不到20万年前（Fumey等，2018；Herman等，2018）。尽管我们的发现与关于其他洞穴鱼物种中DNA修复的研究一致，但它们与先前研究相矛盾，先前研究提出某些Astyanax洞穴鱼种群中DNA修复功能增强（Beale等，2013）。虽然我们的研究中也观察到一些DNA修复基因表达增加（图4—图补充1），但我们的细胞测定表明这并不等同于增强的DNA修复活性。然而，我们的分析仅关注两种不同的细胞系（胚胎成纤维细胞和肝源细胞），而先前的研究研究了鳍中的DNA修复（Beale等，2013）。需要进一步研究来解决这些差异并完全理解洞穴鱼中的DNA修复动态。
在果蝇和小鼠中，急性和慢性睡眠丧失与寿命缩短相关，并且推测ROS相关的肠道失调导致慢性睡眠剥夺个体死亡（Vaccaro等，2020）。因此，有趣的是，洞穴鱼与地表鱼相比没有表现出加速衰老的明显迹象（Medley等，2022；Riddle等，2018a）。A. mexicanus地表和洞穴种群的寿命据报道超过20年，这在很大程度上阻止了将寿命作为衰老读数的使用（Rohner，个人交流）。然而，DNA损伤和衰老相关的转录变化可以作为生物衰老的代理。洞穴鱼的转录架构与地表鱼相比变化不大的发现表明了一种基因组稳定性或衰老过程的减缓，这可能是未来研究衰老机制及其与睡眠和DNA修复关系的焦点。除了睡眠丧失外，洞穴鱼还具有脂肪肝、心脏再生减少和慢性升高的血糖（Aspiras等，2015；Riddle等，2018a）。这些发现引发了洞穴鱼可能已经进化出一系列生物应激韧性机制的可能性。与此观点一致，洞穴鱼已经进化出降低的代谢率和与缺氧和长寿相关的代谢物升高（Medley等，2022）。许多这些特征，如降低的代谢率，也存在于其他长寿生物中，包括裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）和洞螈（Proteus anguinus）（Lunghi和Bilandžija，2022）。比较地表鱼和洞穴鱼之间的差异，或洞穴鱼与其他长寿模型之间的相似性，可能提供一个系统来研究对生物应激的韧性。
总之，这些发现表明洞穴鱼可以用作研究DDR进化丧失和生物韧性的模型。洞穴鱼中不断发展的遗传和基因组工具，包括多个染色体水平测序的基因组和单细胞RNA测序图谱，可能允许识别DNA修复的选择标志物和睡眠调节神经元中的细胞类型特异性转录变化。此外，研究其他洞穴鱼种群中的DNA损伤和ROS提供了识别DNA损伤应答多种机制的机会。
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