摘要
再生能力丧失是器官衰老的关键特征，通常与干细胞耗竭相关。骨骼肌干细胞(MuSCs)在衰老过程中经历了数量和功能的下降，导致再生潜力降低。我们使用低输入多组学方法，系统地分析了来自三个年龄段（年轻、老年和高龄）和两种性别的单个小鼠的MuSCs的表观基因组、转录组和3D基因组。在基线状态下，年轻雄性MuSCs显示出细胞周期相关mRNA表达降低。在老年小鼠中，特别是雄性，MuSCs表现出早期变化（在从年轻到老年过渡期间出现），包括增强的促炎信号传导和细胞身份丧失。晚期变化（在从老年到高龄过渡期间出现）包括炎症加剧、广泛增强子激活和广泛的3D基因组重布线。促炎通路富集于干扰素信号传导，并与内源性逆转录病毒表达和NFκB活性相关。晚期表观基因组和3D基因组重布线反映了肌肉组织、对细胞因子的反应和肌源性身份丧失的下游退行性变化。因此，进行性的分子变化可能解释了MuSCs在衰老过程中观察到的增殖缺陷和功能障碍加剧。
1 引言
骨骼肌(SKM)约占体重的40%-50%，是一类受躯体神经系统自愿控制的组织。随着年龄增长，再生能力下降和骨骼肌质量进行性减少（肌少症）会导致功能下降、虚弱和死亡率增加（Sayer等，2024）。骨骼肌再生能力下降归因于成体干细胞（称为肌肉干细胞(MuSCs)或卫星细胞）的耗竭，这些细胞位于肌膜和基底膜之间（Munoz-Canoves等，2020；Yin等，2013）。消融研究表明MuSCs是主要的肌源性祖细胞（Lepper等，2011；McCarthy等，2011；Murphy等，2011；Sambasivan等，2011）。在没有损伤的情况下，MuSCs保持在静止状态，其特征是低代谢活性和PAX7以及其他干细胞标志物如NOTCH1-3、CD34和CXCR4的表达（Sousa-Victor等，2015；Yin等，2013）。损伤会触发一系列协调的事件，从MuSC激活和细胞分裂开始。一些激活的MuSCs(ASCs)产生成肌细胞，这些成肌细胞分化为肌细胞并融合形成肌管，而剩余的ASCs返回静止状态以维持干细胞池。肌管进一步成熟为肌纤维，细胞核从中心位置迁移到周边位置（Kuang等，2007）。
随着年龄增长，MuSCs的数量和功能都会下降，其原因仅被部分理解（Brack和Munoz-Canoves，2016）。年龄相关的数量耗竭可能归因于从静止状态逃逸，部分由老化肌纤维释放的成纤维细胞生长因子2(FGF2)触发（Chakkalakal等，2012），哺乳动物雷帕霉素靶标复合物1(mTORC1)和AKT信号传导激活（Rodgers等，2014），抗衰老KLOTHO表达下降（Ahrens等，2018；Sahu等，2018），有丝分裂灾难（Liu等，2018）或衰老（Moiseeva等，2023；Sousa-Victor等，2014）。相比之下，年龄相关的功能下降是由于特定的细胞外在（如微环境、机械应力、衰老生态位）和细胞内在（如DNA损伤积累、代谢变化、表观遗传改变）机制（Brack和Rando，2007）。本文重点关注解码导致老年MuSCs功能缺陷的复杂细胞内在表观基因组重编程事件。
与MuSCs数量随年龄减少相关的技术限制，给整合多种模态并同时估计生物学变异和性别差异带来了严重挑战。由于其敏感性，使用测序的转座酶可及染色质检测(ATAC-seq)是最容易实施的方法（Grandi等，2022），并揭示了随年龄变化的可及性变化（Dong等，2022；Lazure等，2023；Shcherbina等，2020）。Lazure等（2023）进一步报告了染色质可及性与全基因组亚硫酸氢盐测序测量的DNA修饰之间的反比关系。从RNA-seq和ATAC-seq推断的转录因子(TF)活性确定了干细胞身份和肌源性中的几个关键参与者（Chow等，2021；Garcia-Prat等，2020）。Liu等（2013）通过ChIP-seq分析了从多只动物汇集的年轻和老年MuSCs的组蛋白修饰（H3K27me3、H3K4me3和H3K36me3）。最显著的变化是H3K27me3在老年MuSCs中积累并扩散，特别是在表达降低的组蛋白基因上（Hu, Chen等，2014；O'Sullivan等，2010）。最近的一项研究报告了通过高通量染色体构象捕获(Hi-C)在老年MuSCs中局部接触的广泛重布线（Yang等，2023；Zhao等，2023）。然而，先前的研究很少在MuSC衰老的背景下检查动态染色质标记如H3K27ac，并且很少解决性别差异或纳入更广泛的多组学框架。
为解决上述差距，我们采用了敏感的低输入多组学方法，仔细分析了从三个年龄段和两种性别的单个小鼠中新鲜分离的MuSCs(FISCs)的表观基因组、转录组和3D基因组景观。我们从四种模态获得的综合发现揭示了不同的年龄相关时序事件，其中转录组和可及染色质显示出促炎变化的早期迹象。在后期阶段，我们发现了增强子景观的深刻重布线和持续炎症的证据，这可能会驱动下游退行性变化。
2 结果
2.1 FISCs随年龄增长表现出性别偏向的数量和质量下降
为研究MuSCs在衰老过程中的功能，我们从NIA啮齿动物群中获取了跨越三个年龄段（年轻2-4个月、老年20-24个月和高龄27-32个月）的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠（见第4节）。MuSCs从后肢SKM中新鲜分离(FISCs)，使用荧光激活细胞分选(FACS)从损伤或未损伤组织中分离，遵循既定协议和先前定义的标记物，VCAM1+、CD31-、CD45-和SCA1-（Liu等，2015）（见第4节，图1A和图S1A-E）。超过95%的分选细胞也对已知的MuSC标记物PAX7呈阳性（图S1F）。虽然老年小鼠的体重增加，但高龄雄性小鼠的体重略有下降（图1B）。后肢肌肉质量（归一化到体重）随年龄显著减少（图1C）。每只小鼠恢复的FISCs数量（归一化到后肢肌肉质量）在雌性小鼠中显著下降，但在雄性小鼠中未下降（图1D）。从未损伤SKM中分离的总单核细胞中估计的FISCs百分比随年龄在两种性别中均显著下降（图1E），这与先前报告一致（综述见Brack和Munoz-Canoves，2016）。
为测试功能，我们将等量的来自年轻和老年小鼠的FISCs接种在含有人成纤维细胞生长因子(hFGF)的生长培养基(GM)中培养4天，然后更换为分化培养基(DM)培养2天（见第4节，图1F）。来自两种性别的老年FISCs显示出增殖减少（图1G）和肌管形成减少（图1H），从肌球蛋白重链(MHC)表达（成熟肌管的标志物）可以看出。来自老年FISCs的肌管明显更细、更短、数量更少（图1H）。值得注意的是，融合指数（肌管内核数占总核数的百分比）随年龄保持不变。相比之下，每个肌管的核数在老年中显著减少（图1H条形图）。总体而言，这些观察表明增殖缺陷而非融合缺陷决定了随年龄增长肌管形成的不良。
有趣的是，我们发现无论年龄如何，雄性FISCs的增殖都低于雌性（图1G）。
我们在年轻和老年小鼠的后肢SKM中注射1.2% BaCl2以诱导损伤，并使用FACS测量了损伤后21天内肌肉中MuSCs的数量。与体外增殖缺陷一致，我们在损伤后2.5天从老年小鼠的肌肉中回收的FISCs更少，而年轻FISCs在此时显示峰值增殖（图1I）。
总体而言，我们证实了MuSCs随年龄增长的数量和质量下降（Sousa-Victor等，2015），但进一步证明这种下降主要是由增殖缺陷驱动的，在雄性中影响尤为明显。
2.2 整体转录组谱显示高龄FISCs的衰老加剧
为评估MuSCs在衰老过程中的转录组变化，我们采用SMART-seq（RNA模板5'端转换机制）方法生成全长度cDNA文库，用于来自年轻(n=7)、老年(n=8)和高龄(n=8)小鼠的低输入RNA-seq（见第4节，表S1）。重复再现性显示在图S2A中。主成分分析(PCA)显示转录组数据的主要变异来源是性别(PC1)和年龄(PC2)（图2A）。性别之间的变异由位于性染色体上的基因转录的mRNA驱动，如Ddx3x、Kdm6a、Kdm5d、Uty、Ddx3y等（图S2B）；然而，本研究的重点不是这些基因集。更值得关注的是，与雄性MuSCs的增殖缺陷一致（图1G），我们观察到雄性中编码细胞周期相关蛋白的mRNA表达相对较低（图2B）。值得注意的是，这种差异甚至在年轻小鼠中就已经存在。接下来，我们使用DESeq2（Love等，2014）来识别不同年龄组之间的差异丰度mRNA(DARs)。年龄间的两两比较显示，随年龄增加或减少的mRNA数量大致相等（图S2C，表S2）。当在三向比较中可视化所有DARs时，大多数要么单调增加（图2C簇1，表S2），要么单调减少（图2C簇8，表S2）（每类约1000个），高龄组显示出最明显的变化。
基因本体论(GO)分析（Huang da等，2009）显示簇1中的DARs富集于炎症相关通路，而簇8中的DARs富集于胶原和细胞外基质(ECM)相关通路（图2C气泡图）。这些通路也独立地在基因集富集分析(GSEA；Mootha等，2003，图S2D-F)中被捕获。考虑到抗病毒反应和I型、II型干扰素通路相关蛋白质编码mRNA的强烈存在，我们更详细地研究了这些通路中的已知mRNA。我们发现，主要的RNA传感器（图2D）和在较小程度上的DNA传感器（图2E）随年龄表达增加，以及相应的下游信号传导。这些传感器是一类模式识别受体(PRRs)，它们将核酸（通常来自外来病原体）作为配体结合并触发先天免疫信号（Li和Wu，2021）。PRRs的过度激活越来越被认为是炎症老化(inflammaging)的一个特征（Walker等，2022）。图2D、E中用红色标记的mRNA也在簇1中发现（图2C）。与雄性MuSCs的增殖缺陷一致（图1G），我们在老年雄性（但不是老年雌性）组中发现了RNA和DNA传感器的早期表达（图2D、E）。
我们展示了归一化RNA平均计数的热图（图2F），示例基因组浏览器快照（图S3A、B）以及来自单个动物的归一化RNA计数（图S3C、D）用于几个其他mRNA组。值得注意的是，小鼠基因组中44个胶原mRNA中有36个随年龄减少（图2F）。此外，我们注意到编码活性肌源性调节因子(MRFs)和一些增殖相关因子的mRNA增加，而与Notch信号传导和静止特征相关的mRNA减少，表明老年FISCs处于普遍激活状态，这与先前报告一致（Dong等，2022）。我们在条件培养基中使用多重LASER珠分析在蛋白质水平验证了这些转录组发现（图S2G），并通过胶原的定量免疫荧光(IF)进行验证（图S2H）。
我们进一步研究了转座元件(TEs)的表达，已知这些元件随年龄增加而增加，并通过cGAS-STING、干扰素和NFκB通路引发炎症反应（Chen等，2016；Di Giorgio和Xodo，2022）。值得注意的是，干扰素通路在GSEA中在老年FISCs中强烈富集（图S2D-F）。我们通过TEtranscripts（Jin等，2015）实施了多映射和期望-最大化算法，该算法概率性地将reads分布在重复元件上。我们的结果显示，与年轻相比，47个TEs在高龄雄性FISCs中升高，而仅9个TEs在高龄雌性FISCs中升高（图2G）。雄性中的TE类别主要是内源性逆转录病毒(ERV)类，虽然不能自主转座，但仍可通过RNA和DNA传感机制引发炎症反应（Chen等，2016；Di Giorgio和Xodo，2022）。
为检测随年龄发生性别二态性变化的mRNA，我们拟合了一个包含年龄-性别设计(~age*sex)的DESeq2模型。我们在高龄与年轻比较中获得了最多的年龄相关性别二态性mRNA（图S2I）。我们将46个差异表达mRNA聚类为四个组，以识别主要模式（图2H，表S2），然后进行通路富集分析。有趣的是，簇2（构成随年龄在雌性中增加但在雄性中显示相反趋势的mRNA子集，n=15）富集于免疫信号和白细胞迁移通路（图2I）。这些结果指向MuSC衰老过程中发散的、性别依赖的免疫和炎症程序。
总之，老年FISCs表现出强烈的促炎mRNA特征，特别是在高龄组中，这可能部分由细胞内在ERV表达触发。相比之下，胶原和ECM mRNA随年龄显著减少。
2.3 衰老FISCs中增强子区域的染色质可及性增加
为建立MuSC衰老过程中转录组变化的染色质基础，我们在来自年轻(n=8)、老年(n=8)和高龄(n=7)小鼠的FISCs中进行了ATAC-seq（Grandi等，2022）（见第4节，表S1）。重复再现性显示在图S3E中。与我们的转录组数据类似，ATAC-seq谱的PCA将年龄和性别确定为主要变异来源（图3A），尽管它们的相对贡献发生了逆转。PC1占方差的72%，并清楚地按年龄分离雄性，而雌性在此轴上显示出较弱的分离。鉴于年龄解释的方差远大于性别，我们在后续分析中优先考虑年龄效应。
ATAC峰总数在每个年龄组中没有统计学差异（图3B），尽管可及性随年龄逐渐增加（图3C）。使用DiffBind（Stark和Brown，2011）进行的差异峰分析确定了7893个在高龄与年轻相比显著不同的峰（图3D左，表S3），其中大多数（7322个）随年龄获得可及性（开放），仅有571个失去可及性（关闭，图3D右，表S3）。这些差异峰中的大多数注释到内含子和远端基因间区域，表明它们可能作为增强子发挥作用（图3E）。当分别注释随年龄开放或关闭的峰时，明显存在一小部分靠近基因的启动子峰（图3F）。我们在高龄与年轻比较中对这些启动子近端基因进行了通路富集分析。随年龄开放的峰附近的基因富集于肌动蛋白细胞骨架/纤维组织通路（图3G）；而随年龄关闭的峰附近的基因则富集于肌肉系统和收缩功能（图3H），这与肌源性潜力降低一致。尽管有这些趋势，但ATAC和RNA信号之间总体上只有弱正相关（图S3F），可能是因为差异ATAC峰主要位于内含子/远端基因间区域而非启动子区域。
然后，我们将精力集中在从染色质可及性模式中发现转录因子(TF)基序上。首先，我们使用HOMER（Heinz等，2010）对在高龄与年轻比较中开放的差异ATAC峰进行简单的静态基序富集分析。前3个TF基序都是NFκB位点（图3I）。其次，我们实施了TOBIAS（Bentsen等，2020）足迹分析，该分析整合了局部染色质可及性变化并将它们纳入TF活性预测。TOBIAS的稳健统计方法还支持跨条件比较，并确定NFκB1(p50)在衰老过程中具有显著不同的TF活性（高龄与年轻比较如图3J所示）。由于NFκB1缺乏转录激活域，它通常与p65(RelA)形成异二聚体以刺激转录（Zhang等，2017）。为验证TOBIAS的TF活性发现，我们对磷酸化-p65(Ser 536)进行了IF，这是活性NFκB信号的标志物。我们发现高龄FISCs中信号显著更高，并有核定位的证据（图3K，注意插图中更中心的点状信号）。
总之，衰老MuSCs中的ATAC-seq谱表明染色质景观在增强子处被大幅重塑，这可能通过NFκB活性促进促炎转录组。相比之下，启动子处的ATAC可及性变化表明肌动蛋白丝重组显著且肌肉相关功能下调。
2.4 组合分析组蛋白修饰和3D接触显示增强子状态的富集
认识到仅靠RNA-seq和ATAC-seq在完全捕捉表观遗传复杂性方面的局限性，我们采用了整合方法来纳入额外的表观遗传模态。由于ATAC-seq提供了增强子重构的线索（图3E），我们在来自年轻(n=5-6)、老年(n=7-9)和高龄(n=4-5)小鼠的FISCs中进行了针对两种增强子标记H3K4me1和H3K27ac的靶向释放使用核酸酶的切割(CUT&RUN)（Skene和Henikoff，2017）（见第4节，表S1）。重复再现性显示在图S4A、B中。与ATAC数据类似，主要变异来源(PC1)是年龄（图4A，图S4C），表明染色质水平的信息与干细胞年龄相关，无论模态如何。相比之下，转录组差异主要与性别相关，其次是年龄（图2A）。有趣的是，对于H3K27ac和H3K4me1，年轻和老年数据聚在一起，而高龄样本更为不同，表明在生命后期增强子重构更为稳健。我们还确定高龄FISCs中H3K27ac峰显著更高（图4B），而H3K4me1显示向上但统计学上不显著的趋势（图S4D）。两种修饰的中位峰信号随年龄增加（图4C，图S4E）。正如预期，H3K4me1峰主要注释到远端基因间和内含子区域（图S4F）。有趣的是，H3K27ac峰在年轻和老年中主要注释到启动子，而在高龄FISCs中注释到远端基因间和内含子区域（图4D）。
我们接下来将ATAC和CUT&RUN的增强子标记数据与已发表的H3K4me3和H3K27me3的ChIP-seq数据（Liu等，2013）结合起来，使用ChromHMM（Ernst和Kellis，2012）定义了10种染色质状态。在ChromHMM的背景下，"染色质状态"是每个基因组bin的功能注释（启动子、增强子等）的概率推断。值得注意的是，此分析在年轻和老年FISCs中进行，因为已发表的数据集不包括高龄组。ChromHMM优于我们的峰调用方法（图4B-D），因为它"学习"全基因组重复修饰和可及性的重新组合的染色质状态。使用ChromHMM，我们发现了多个富集于增强子的状态（图4E）。由经典增强子标记H3K4me1和H3K27ac标记的状态3-5和9在老年FISCs中显示出增加的基因组占用（图4F）。我们进一步通过超增强子的排序算法(ROSE)对增强子进行分类（Whyte等，2013），以识别超增强子和典型增强子。使用H3K27ac（图4G）或H3K4me1（图S4G），老年FISCs，尤其是高龄，显示出两类增强子的信号强度更高（表S4）。总体而言，这些方法揭示了MuSC衰老过程中增强子元件活性增加。
我们推测，随年龄增加的增强子活性表明3D基因组重组。确实，先前的报告指出了一些与年龄相关的3D基因组重布线事件，包括区室化改变、拓扑关联结构域(TADs)边界的绝缘丧失以及年龄特异性环（Zhao等，2023）。我们在年轻(n=2)、老年(n=2)和高龄(n=4)雄性小鼠中进行了Hi-C（每份样本MuSCs来自3-4只动物，表S1）。Hi-C数据的PCA显示样本按年龄明显聚类，几乎所有方差都由PC1解释（图4H）。重复再现性显示在图S4H中。我们的Hi-C文库测序深度约为每样本11.4亿reads，88%-90%的非重复reads代表有效高质量的Hi-C接触（表S4），从而支持具有稳健统计检验的差异TAD和环分析。我们在每个年龄组中以0.001的FDR阈值识别TADs，产生年轻组2261个TADs，老年组2279个，高龄组1877个。对于差异分析，我们使用年轻TADs(n=2261)作为参考，并评估了TAD内部、左TAD间和右TAD间区域的差异。如果这些区域中的至少一个显示出统计学显著变化(p<0.05)，则认为TAD是差异的。此分析确定了938个年轻与老年之间的差异TADs和1491个年轻与高龄之间的差异TADs（图4I）。在两种比较中，大多数差异发生在左或右TAD间区域，表明边界绝缘变化对与年龄相关的3D基因组重塑的贡献比域内部的改变更为显著。然而，也观察到了TAD内部的差异，约20%的差异TADs在老年组中显示绝缘丧失，约38%在高龄组中显示绝缘丧失（图4I，黑色堆叠条）。有趣的是，我们发现几个与肌肉干细胞功能或肌源性潜力相关的基因位点位于差异TAD区域。Myf5/Myf6位点在年轻与高龄比较中显示差异右TAD间变化，并且在老年和高龄样本中也显示几个差异环（图4J，左）。这些结果可能解释了Myf5/Myf6 mRNA在老年，特别是高龄MuSCs中的表达增加（图2F）。另一个有趣的变化是在Spry1位点，已知该基因可调节静止（Shea等，2010）（图4J，右）。TADs、差异TADs、TADs在已知肌源性基因附近的变化、环和差异环的综合列表见表S4。
最后，为确定可能影响功能的增强子列表，我们在雄性MuSC数据上实施了接触活性(Activity by Contact, ABC)模型（Fulco等，2019）。ABC整合了3个组学层的信息：活性（ATAC-seq和H3K27ac CUT&RUN）和接触（Hi-C），以预测调控元件活性（图S4I）。为专注于增强子-基因对，我们过滤掉了启动子和自身启动子类（自身启动子是元件-基因对，其中元件是该基因的启动子），并通过汇总每个目标基因的ABC分数来按目标基因聚合ABC分数，为每个基因(n=16,709)产生单个值。在进行分位数归一化后，我们计算了老年和高龄与年轻相比的ABC分数的倍数变化(FC)，并对FC>25的目标基因进行了通路富集分析。与增强子相关的基因在老年与年轻比较中显示出神经功能相关术语的强烈富集（图4K，绿色）。相比之下，高龄与年轻比较还揭示了除了几个神经术语外，与ECM重塑和肌肉骨骼分化相关的通路（图4K，蓝色）。此外，炎症术语在此比较中适度富集。三个示例浏览器截图视图显示了Sharpin（炎症）、Unc13b（神经元）和Nfatc1（成骨细胞分化）位点，具有5 kb分辨率的差异Hi-C环，见图S4J。值得注意的是，大多数这些增强子驱动的目标基因在我们的稳态整体RNA-seq测量中并不突出（图2，见第3节）。与炎症基因不同，尽管胶原基因mRNA和蛋白质水平随年龄下降，但胶原基因启动子未显示表观遗传变化（图2C簇8，图2F，图S2H、S3B、S3D、S4K），表明可能涉及转录后调控机制。
总体而言，我们的结果表明MuSCs中的增强子活性随年龄增加，可能损害细胞身份和肌源性潜力。待体内结果证实，我们推测靶向增强子可能是克服SKM功能年龄相关下降的可行策略。
3 讨论
MuSCs随年龄的功能障碍是肌肉再生不良的关键贡献者，但分子机制仍未完全理解。在本研究中，我们对三个年龄段（年轻、老年和高龄）和两种性别的多个生物重复的MuSCs进行了多组学分析。全面的数据集使我们能够验证MuSCs在衰老过程中的数量和质量趋势。我们查询了包括表观基因组（ATAC-seq、H3K4me1和H3K27ac的CUT&RUN）、转录组（RNA-seq）和3D基因组（Hi-C）在内的多种"组学"层面。我们的结果揭示了时序事件，包括早期在雄性中启动但随生命后期加剧的细胞身份丧失和强干扰素反应，以及表明MuSC功能障碍的广泛3D基因组重布线。
虽然已知老年肌肉的MuSCs较少，但我们发现雄性MuSCs在年轻组中表现出较低的基础增殖能力，并在老年中进一步加剧（图1G、H）。这种功能差异也反映在细胞周期相关mRNA的表达模式中（图2B），老年雄性中核酸传感器和干扰素通路的早期激活（图2D、E），以及高龄雄性中ERV的升高表达（图2G）。ERV可以利用病毒模拟通过cGAS-STING和NFκB引发强烈的炎症反应，或通过RNA传感激活干扰素反应（Di Giorgio和Xodo，2022）。最终，这些抗病毒机制可能会降低增殖能力。尽管基础条件下性别差异的原因尚不清楚，但性染色体上的细胞周期或表观遗传调节因子可能起作用。几种男性特异性蛋白质已与NFκB相互作用相关。例如，性别决定区Y(SRY)在其5'区域具有NFκB的结合位点，表明可能存在直接相互作用（Ross等，2008）。我们在雄性MuSCs中发现Ddx3y（编码RNA解旋酶）强烈表达（图S2B），而它通常在睾丸中表达。DDX3X（X染色体对应物）已知通过调节TBK1和IRF3激活I型干扰素（Soulat等，2008），增强p21表达（Chao等，2006），并驱动内质网应激（Adjibade等，2017），所有这些都可能降低增殖能力。
最有趣的发现之一是染色质可及性（在雄性中）和增强子相关组蛋白修饰（在两种性别中）显示年龄依赖性变化（图3A和4A，图S4C）。染色质可及性（图3A）和mRNA表达（图2A、C）的变异似乎是渐进的，而增强子标记（图4A，图S4C）在高龄组中更突然变化。然而，尽管大多数年龄相关的转录组改变在雄性和雌性中都是渐进的（图2C），但我们发现一小部分性别二态性炎症mRNAs遵循两种性别中相反的轨迹（图2H、I）。
跨"组学"层面的比较中出现了三种主要模式。首先，转录组数据显示强烈的I型和II型干扰素反应（图2C-F，图S2D-F），部分由于ERV表达激活（图2G）。一致地，基于染色质可及性的TF活性测量和IF显示NFκB活性升高，主要在增强子处（图3I-K）。最后，增强子修饰、开放染色质和3D基因组接触强化了炎症（图2C-F和4K）。有趣的是，SenMayo（Saul等，2022）或CellAge（Avelar等，2020）面板中的经典衰老mRNA特征似乎并未特别富集（数据未显示）。
其次，除了炎症外，广泛的增强子重布线和3D基因组重组也表明更广泛的肌源性身份丧失和谱系漂移（图3E、F，图4）。许多染色质变化发生在基因组的非编码区域（图3E、F和4D，图S4F）。随年龄减少可及性的启动子区域靠近与肌肉功能相关的基因（图3F、H）。此外，我们发现许多编码关键肌源性蛋白的基因组位点位于差异TADs中，并显示环形成改变（图4I、J，表S4）。识别最活跃增强子-基因对的整合多组学分析显示老年中众多神经术语（图4K，绿色）。在高龄组中，与骨和软骨发育相关的术语变得明显（图4K，蓝色），表明向更广泛的中胚层承诺的转变。重要的是，增强子活性的变化与整体RNA-seq数据不相关。我们推测高龄MuSCs的改变的多能细胞状态纯粹是表观遗传的，由于缺乏沿特定谱系的分化信号，因此在RNA中不反映。或者，新生RNA-seq方法如GRO-seq或PRO-seq可能更好地捕获新生转录，并识别mRNA稳定性改变的实例，而非稳态转录。
第三，尽管存在广泛的表观基因组改变（图3和4，图S4），但我们发现大多数胶原mRNA随年龄减少（图2C、F，图S2D-F），这一趋势在蛋白质水平也得到证实（图S2H）。虽然SKM中细胞外基质(ECM)的退化已被充分记录（Zhou等，2019），但在纯化MuSCs中胶原表达的大规模年龄依赖性减少此前未被报道，可能是因为我们使用SMART-seq方法构建了全长cDNA文库，能够捕获长转录本。胶原蛋白在维持MuSCs静止状态中起着关键作用。COLV的消耗破坏了NOTCH-COLV-CALCR（降钙素受体）信号级联，导致异常的细胞周期进入和MuSC池的逐渐下降（Baghdadi等，2018）。一致地，我们观察到Pax7、Notch和Calcr随年龄表达减少（图2F），表明MuSC静止在衰老过程中丧失。编码对静止维持重要的mRNA的Spry1位点（Shea等，2010）也显示3D基因组改变（图4J）。有趣的是，我们未在胶原基因的启动子处观察到染色质可及性或组蛋白修饰的任何变化（图S4K），表明胶原水平可能受转录后调控。在这方面，已发现许多RNA结合蛋白，如LARP6和αCP（hnRNPE）（Stefanovic，2013），结合胶原mRNA并影响其周转率。类似地，一系列microRNA(miRs)和长非编码RNA(lncRNAs)与胶原mRNA相关并调节其周转和转录后命运（Wen等，2022）。值得注意的是，miR-29a/b/c-3p已知靶向胶原mRNA降解（Maurer等，2010），随年龄在大鼠中增加（Hu, Klein等，2014），并驱动年龄相关表型（Swahari等，2024）。需要进一步研究以完全阐明胶原mRNA周转如何作为年龄函数由这些和其他因素调控。
总之，我们的多组学框架揭示了汇聚于与MuSC功能障碍相关通路上的时序协调变化。我们检测到早期、男性偏向的促炎程序激活，以及晚期广泛的表观基因组重塑，与谱系漂移和肌源性承诺丧失一致。虽然需要对高龄FISCs进行更深入的功能表征和年龄相关细胞命运变化的直接证据，但本研究提供了对多种表观遗传程序如何在衰老过程中协同作用的见解，并为后续功能研究提名了候选目标，以减轻肌肉衰退。
【全文结束】
