摘要
下呼吸道微生物群的多样性对其稳态至关重要，但在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中会大幅改变。体外膜肺氧合（ECMO）是严重ARDS患者肺部的终极保护性治疗手段，但对其对这些患者肺微生物群的影响知之甚少。为评估ECMO对ARDS患者肺微生物群的影响，我们对因COVID-19导致ARDS的患者进行了支气管肺泡灌洗液（BALF）的16S rRNA和真菌ITS1谱分析及宏基因组测序。共收集了13例患者的BALF，其中5例接受了ECMO治疗。在所有患者中，细菌中最丰富的属为假单胞菌属。接受ECMO治疗的患者假单胞菌属和克雷伯氏菌属的数量较未接受ECMO治疗的患者更多。真菌方面，接受ECMO治疗的患者以未分类真菌为主，而未接受ECMO治疗的患者则以Emmia lacerata为主。两组间细菌和真菌的α多样性无显著差异。所有患者中，人β疱疹病毒5型和人α疱疹病毒1型占主导地位，但ECMO患者中人β疱疹病毒5型随时间减少。接受ECMO治疗的COVID-19所致ARDS患者肺微生物群与未接受ECMO治疗的患者不同。
引言
健康成人的肺部含有独特的微生物群落，通过与宿主形成生态互动网络参与维持呼吸生理和免疫稳态。下呼吸道中丰富的微生物包括厚壁菌门（链球菌属和韦荣球菌属）、拟杆菌门（普雷沃氏菌属）等细菌；曲霉属、念珠菌属、枝孢属、马拉色菌属和酵母属等真菌；以及Anelloviridae和Redondoviridae等病毒。失调（即偏离正常微生物组成）与呼吸系统疾病的发生和发展密切相关。在ARDS患者中，由于疾病本身进展和正压通气的影响，肺部多样性随时间减少，失调进一步恶化。
体外膜肺氧合（ECMO）是一种用于治疗严重ARDS的手段，通过体外人工肺将气体交换后的氧合血液输送到体内，替代组织供氧不足的情况持续数天至数周，并防止因暴露于高浓度氧气和过度通气相关的机械通气引起的通气机相关性肺损伤。因此，在治疗和恢复过程中，肺部得以暂时休息，避免对受损肺部造成不可逆的损害。据我们所知，目前尚无关于接受ECMO治疗的ARDS患者肺微生物群的报告。
本研究旨在确定ECMO对因COVID-19导致ARDS患者肺微生物群的影响。
材料与方法
研究设计与参与者
这项单中心、前瞻性、观察性临床研究是在大阪综合医疗中心创伤与外科重症监护科直接从急诊科入院的因COVID-19导致ARDS的患者中进行的，时间为2021年4月至2022年3月。COVID-19诊断通过入院时鼻拭子聚合酶链反应检测确认。ARDS诊断遵循柏林定义。所有ARDS患者均按照已建立的临床指南进行治疗，包括低潮气量通气和适当PEEP设置等肺保护性通气策略。此外，患者作为常规通气护理的一部分，使用内部吸痰系统管理。临床和生物学参数如患者人口统计特征、机械通气和住院时间、合并症等信息从电子病历中收集。严重程度评分使用急性生理学和慢性健康评估（APACHE）II评分（范围0-71）和序贯器官衰竭评估（SOFA）评分（范围0-24），ARDS严重程度分为轻度、中度或重度。本研究经大阪综合医疗中心机构审查委员会批准（批准号：2021-002）。所有患者均签署书面知情同意书。本研究按照《赫尔辛基宣言》进行。
样本采集
所有患者均使用支气管纤维镜收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。在未接受ECMO治疗的患者中，BALF在ARDS诊断后24小时内收集。在接受ECMO治疗的患者中，BALF在ECMO启动后24小时内收集，并根据需要在初次BALF收集后再次收集。支气管肺泡灌洗程序在无菌条件下使用一次性AMBU® ASCOPE™ 4（Ambu A/S，丹麦巴勒鲁普）进行。按照标准化程序进行支气管肺泡灌洗，具体方法是向支气管内注射3 × 20 mL无菌盐水溶液。每次注射后，收集支气管内尽可能多的液体（总计约10 mL），置于50 mL无菌塑料管中并离心分离上清液和沉淀物。样品储存在−80°C直至使用。
扩增子文库构建和测序
使用PI-1200核酸提取系统（Kurabo，大阪，日本）从BALF沉淀部分提取细菌和真菌DNA。对于细菌宏基因组分析，使用Illumina MiSeq平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）以251-bp双端模式对16S rRNA基因的V1-V2可变区进行测序。对于真菌宏基因组分析，使用Illumina MiSeq以301-bp双端模式对真菌ITS1区域进行测序。所得的双端序列使用DADA2软件（ feature-classifier插件在Greengenes数据库（版本13_8）中进行细菌分类分配，在ntF-ITS1数据库中进行真菌分类分配。QIIME2管道，版本2020.2，用作处理所有相关原始序列数据的生物信息学环境。
宏基因组鸟枪测序
使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit（Qiagen，德国希尔登）从沉淀部分提取病毒RNA。然后使用ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit（New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯维奇）、NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second Strand Synthesis Module（New England Biolabs）和Random Primer 6（随机六核苷酸；New England Biolabs）合成双链DNA。接下来，使用Twist Library Preparation Enzymatic Fragmentation Kit（Twist Bioscience，美国加利福尼亚州南旧金山）和Twist Comprehensive Viral Research Panel（Twist Bioscience）为每个样本制备病毒宏基因组鸟枪文库。所有文库使用MGIEasy Universal Library Conversion Kit（App-A）转换为DNBSEQ文库。使用DNBSEQ-G400RS高通量测序试剂盒（MGI Tech，东京，日本）以100-bp双端模式进行测序。每个读段使用Kraken2分析针对PlusPFP数据库，该数据库包括古细菌、细菌、病毒、质粒、人类、UniVec_core、原生动物、真菌和植物序列。
统计分析
连续变量以中位数和四分位距（IQR）表示，分类变量以频率和百分比表示。使用Wilcoxon秩和检验测试连续变量，使用Fisher精确检验测试名义变量。p值<0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用JMP Pro17（SAS Institute Inc.，美国北卡罗来纳州凯里）和Prism 9（GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿）进行。
结果
患者特征
共有13名患者纳入研究：5名接受ECMO治疗，8名未接受ECMO治疗。患者特征见表1。接受ECMO治疗的患者中位年龄（IQR）显著低于未接受ECMO治疗的患者（44 [36–48] vs. 64 [53–74]岁，p = 0.007）。接受ECMO治疗的患者的中位APACHE II评分显著高于未接受ECMO治疗的患者（20 [17–22] vs. 15 [12–18]，p = 0.018）。中位SOFA评分也显著高于未接受ECMO治疗的患者（10 [9–13] vs. 8 [4–9]，p = 0.022）。所有患者在接受有创机械通气前均未接受高流量鼻导管氧疗或无创正压通气等非侵入性呼吸支持。作为ARDS辅助治疗，80%的未接受ECMO治疗的患者采用俯卧位治疗，而所有接受ECMO治疗的患者采用侧卧位治疗。ECMO的中位持续时间为11（10–22）天。接受ECMO治疗和未接受ECMO治疗的患者在机械通气时间上无显著差异。接受ECMO治疗的患者在重症监护病房（ICU）的中位住院时间显著更长（13 [11–29] vs. 9 [6–12]天，p = 0.045）。两组间的死亡率无显著差异。两组在ARDS诊断后24小时内使用的机械通气参数见在线补充表S1。接受ECMO治疗的患者通气量设置极低。
表1 人群特征。
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肺部细菌微生物群
在所有样本中，变形菌门和厚壁菌门在门水平上的菌群组成中占主导地位（图1A）。图1B显示了相对丰度大于1%的顶级细菌门在ECMO组和非ECMO组中的分布。这两个组中排名前三的细菌门相同，但其频率不同：非ECMO组中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的相对频率分别为51.3%、29.3%和6.3%，而在ECMO组中分别为76.6%、8.0%和6.5%。所有样本在属水平上的细菌菌群组成见图1C。图1D显示了在ECMO组和非ECMO组中平均相对丰度超过1%的顶级细菌属。假单胞菌属在这两个组中均为最主要的属。排名前四的革兰氏阴性杆菌（假单胞菌属、弯曲菌属和鞘氨醇单胞菌属）在ECMO组中更为常见，而在非ECMO组中链球菌属更为常见（图1E）。接受ECMO治疗的患者中排名前六的细菌属的相对丰度变化见图1F。假单胞菌属、弯曲菌属和鞘氨醇单胞菌属在同一患者中表现出相似的趋势。两名患者的克雷伯氏菌属在第21天之前呈增加趋势。无论是基于ECMO状态还是机械通气天数，样本之间的β多样性相似性较低（图2）。接受ECMO治疗的患者与未接受ECMO治疗的患者在α多样性上没有差异（见在线补充图S1）。
图1
接受和未接受ECMO治疗的患者的肺部细菌微生物群。（A）ARDS诊断后24小时内收集的样本在门水平上的肺微生物群组成。堆叠条形图表示所有样本在门水平上的平均相对丰度。（B）ARDS诊断后24小时内收集的样本在门水平上的顶级肺微生物群组成。柱状图显示了通过平均相对丰度1%或以上的细菌门得出的ECMO组和非ECMO组的顶级细菌门。（C）ARDS诊断后24小时内收集的样本在属水平上的肺微生物群组成。图例显示了前20个属。（D）ARDS诊断后24小时内收集的样本在顶级属水平上的顶级肺微生物群组成。柱状图显示了通过平均相对丰度1%或以上的细菌属得出的ECMO组和非ECMO组的顶级细菌属。（E）箱形图显示了ARDS诊断后24小时内收集的样本中接受和未接受ECMO治疗的患者的前四个属的相对丰度。（F）接受ECMO治疗的患者中排名前六的细菌属的相对丰度变化。ECMO，体外膜肺氧合。
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图2
接受和未接受ECMO治疗的患者肺部细菌菌群的PCoA2D图。（A）ARDS诊断后24小时内从接受和未接受ECMO治疗的患者收集的BALF的β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过未加权UniFrac距离测量。（B）所有患者按机械通气天数划分的BALF β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过未加权UniFrac距离测量。<1天表示机械通气的第一天内。2天-7天表示机械通气的第二天至第七天。>7天表示机械通气的第七天之后。（C）ARDS诊断后24小时内从接受和未接受ECMO治疗的患者收集的BALF的β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过加权UniFrac距离测量。（D）所有患者按机械通气天数划分的BALF β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过加权UniFrac距离测量。<1天表示机械通气的第一天内。2天-7天表示机械通气的第二天至第七天。>7天表示机械通气的第七天之后。BALF，支气管肺泡灌洗液；ECMO，体外膜肺氧合；PCoA2D，二维主坐标分析；ANOSIM，相似性分析。
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肺部真菌群
所有样本在物种水平上的真菌菌群组成见图3A。每个样本仅由少数几种真菌物种主导。图3B显示了平均相对丰度超过1%的顶级真菌物种。在ECMO组中，未分类真菌最为丰富，其次是限制性马拉色菌。在非ECMO组中，Emmia lacerata最为丰富，其次是限制性马拉色菌。接受ECMO治疗的患者在Shannon和Simpson多样性指数上显示出较不多样化的肺部真菌群（见在线补充图S2）。无论基于ECMO状态还是机械通气天数，β多样性均无差异（图3C）。
图3
接受和未接受ECMO治疗的患者在物种水平上的肺部真菌群。（A）ARDS诊断后24小时内收集的样本在物种水平上的肺部真菌群组成。图例显示了27个物种。（B）ARDS诊断后24小时内收集的样本在物种水平上的顶级肺部真菌群组成。柱状图显示了通过平均相对丰度1%或以上的真菌物种得出的ECMO组和非ECMO组的顶级真菌物种。（C）肺部真菌菌群的β多样性分析PCoA2D图。ARDS诊断后24小时内从接受和未接受ECMO治疗的患者收集的BALF的β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过未加权UniFrac距离测量。（D）所有患者按机械通气天数划分的BALF β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过未加权UniFrac距离测量。<1天表示机械通气的第一天内。2天-7天表示机械通气的第二天至第七天。>7天表示机械通气的第七天之后。（E）ARDS诊断后24小时内从接受和未接受ECMO治疗的患者收集的BALF的β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过加权UniFrac距离测量。（F）所有患者按机械通气天数划分的BALF β多样性分析PCoA2D图。样本之间的差异通过加权UniFrac距离测量。<1天表示机械通气的第一天内。2天-7天表示机械通气的第二天至第七天。>7天表示机械通气的第七天之后。BALF，支气管肺泡灌洗液；ECMO，体外膜肺氧合；PCoA2D，二维主坐标分析；ANOSIM，相似性分析。
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肺部病毒组
所有样本中病毒菌群的组成见图4A。每个患者组中相对丰度大于1%的病毒的柱状图见图4B。所有患者均患有COVID-19，但人β疱疹病毒5型和人α疱疹病毒1型而非严重急性呼吸综合征冠状病毒占主导地位。ECMO患者中人β疱疹病毒5型的相对丰度趋于降低，而严重急性呼吸综合征冠状病毒的相对丰度趋于增加。接受ECMO治疗的患者中排名前五的病毒相对丰度变化见图4C。人β疱疹病毒5型的相对丰度在21天内趋于减少，但一名患者在此之后有所增加。
图4
接受和未接受ECMO治疗的患者在物种水平上的肺部病毒组。（A）ARDS诊断后24小时内收集的样本在物种水平上的肺部病毒组组成。图例显示了前20个物种。（B）ARDS诊断后24小时内收集的样本在物种水平上的顶级肺部病毒组组成。柱状图显示了通过平均相对丰度1%或以上的物种得出的接受或未接受ECMO治疗的患者的顶级病毒。（C）接受ECMO治疗的患者中排名前五的病毒的相对丰度变化。ECMO，体外膜肺氧合。
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讨论
我们分析了因COVID-19导致ARDS患者的下呼吸道细菌、真菌和病毒菌群。接受ECMO治疗的患者的下呼吸道微生物群富含假单胞菌属中的细菌、未分类真菌中的真菌和人β疱疹病毒5型（巨细胞病毒：CMV）中的病毒。
变形菌门在因COVID-19导致ARDS患者的下呼吸道中占主导地位，据报道，假单胞菌属和肠杆菌属的丰度增加是COVID-19肺炎患者下呼吸道的特征之一，这与本研究结果一致。值得注意的是，接受ECMO治疗的患者假单胞菌属和克雷伯氏菌属的相对丰度高于未接受ECMO治疗的患者，而未接受ECMO治疗的患者链球菌属和金黄色葡萄球菌的相对丰度较高。病毒感染损害呼吸道途径的组织，导致失调并促进细菌菌落形成。在COVID-19中，铜绿假单胞菌被报道促进菌落形成，铜绿假单胞菌的富集与不良预后相关。重症ARDS患者的ECMO患者中铜绿假单胞菌的富集可能更大，因为他们的肺损伤更严重。老年人的口腔微生物群富含葡萄球菌和链球菌，据报道，严重ARDS患者的肠道中肠杆菌的相对丰度增加。ARDS患者的误吸也会影响下呼吸道微生物群。因此，未接受ECMO治疗的患者中链球菌可能增加，而由于疾病的严重性，主要在ECMO患者中确认了更多的肠杆菌。尽管ECMO患者中高度致病微生物的富集和严重性增加，但临床结局和多样性并未逊色于非ECMO患者。ECMO替代了肺部通常执行的氧合和二氧化碳去除功能，并允许进行显著降低平台压和驱动压的保护性通气。这导致血浆sRAGE、白细胞介素-6和单核细胞趋化蛋白-1浓度显著降低，从而限制了机械通气引起的肺部生物创伤。据报道，ECMO在大鼠实验中促进肺泡上皮功能的恢复。ECMO患者肺微生物群的变化并未导致多样性的减少，这可能有助于ECMO对肺部的保护作用。
据报道，ARDS患者的真菌菌群富含白色念珠菌，而白色念珠菌是死亡的风险因素。这在因COVID-19导致的ARDS中同样观察到，其中未感染念珠菌属的ARDS患者中未分类子囊菌的增加被报道。这与本研究结果一致，显示从早期阶段就被白色念珠菌污染的患者和未被污染病例中未分类真菌的增加。值得注意的是，本研究中限制性马拉色菌丰富。限制性马拉色菌在皮肤和肠道中广泛存在，在肠道真菌菌群中，限制性马拉色菌和白色念珠菌突出。类似于细菌菌群，限制性马拉色菌可能通过肠-肺轴在ARDS患者中得到富集。
呼吸道病毒菌群被认为通过与免疫系统的相互作用在呼吸系统疾病的发病机制中发挥重要作用。据报道，烟草花叶病毒在COVID-19中丰富，而Anelloviridae和Redondoviridae在重症病例中丰富，这些病毒的存在与住院期间插管呈正相关。在本研究中，CMV和人α疱疹病毒1型（单纯疱疹病毒1型：HSV-1）显著富集，但Anelloviridae和Redondoviridae没有。接受ECMO治疗的患者中人β疱疹病毒5型少于未接受ECMO治疗的患者。人β疱疹病毒5型和人α疱疹病毒是最常从机械通气患者中鉴定出的病毒，ICU患者中的病毒再激活，特别是疱疹组病毒，显著改变了病毒组。据报道，CMV肺部感染而非HSV-1与机械通气时间延长、ICU住院时间和死亡率增加有关。鉴于ECMO患者中CMV相对丰度随机械通气时间延长而下降的趋势，ECMO提供的肺部休息可能有助于抑制致病病毒的富集。先前报道的研究对象处于机械通气初期，尚未有报道关于单病毒富集随机械通气时间延长而进展的情况。
局限性
本研究有几个局限性。首先，未考虑几个混杂因素。据报道，高度致病细菌的富集与疾病进展和严重程度相关。ECMO患者显著比非ECMO患者病情更重，这可能导致由于疾病严重性而导致的高度致病细菌的富集。此外，样本收集前的治疗可能影响了肺微生物群。据报道，抗生素会改变肺微生物群并降低多样性。抗生素治疗可能影响了本研究的结果。我们在ECMO患者中发现了对肺微生物群的负面影响，如疾病严重性和高度致病细菌的富集，但由于ECMO对肺部的保护作用，可能没有出现多样性的减少和结局恶化。当前结果是基于单中心少量病例测量的初步研究结果。需要在更多病例和其他队列中进行验证，以准确评估ECMO对肺微生物群的影响。其次，虽然我们使用宏基因组测序检测到了大量微生物，但应始终考虑气道和支气管镜的污染。我们使用一次性支气管镜以尽量减少污染。第三，我们没有评估微生物是否真正致病或仅存在于气道中。使用动物模型的进一步研究应能提供关于ECMO患者微生物组变化致病作用的重要见解。
结论
接受ECMO治疗的ARDS患者肺微生物群不同于未接受ECMO治疗的患者。推测危重病、呼吸管理和各种其他因素共同影响ARDS患者的肺微生物群。需要进一步研究以确定ECMO的独特呼吸管理如何影响肺微生物群。
数据可用性
研究中使用和分析的数据集可以在在线存储库中找到（登录号PRJDB17654）。此数据可在此处找到：<
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