引言
H5N1亚型流感病毒是一种高致病性病毒，对野生鸟类种群具有毁灭性影响。这种病毒主要感染鸟类的呼吸道和胃肠道，并已在世界各地的多种野生鸟类中被发现。天鹅尤其容易感染H5N1，受感染的鸟类常表现出严重的精神萎靡和神经功能障碍，包括抽搐、震颤和明显的协调能力丧失。天鹅的迁徙行为进一步加剧了病毒的传播，因为它们可以在长距离内携带并释放病毒，从而影响其他鸟类种群和生态系统。
2006年，哈萨克斯坦首次暴发了高致病性禽流感H5N1，对野生天鹅种群造成了重大影响。这次疫情与里海地区的野鸟季节性迁徙相吻合，很可能是病毒跨区域传播的原因。此外，在2023年和2024年的冬季，哈萨克斯坦里海沿岸的卡拉科尔湖观察到因H5N1导致的天鹅大规模死亡。里海不仅是野鸟迁徙路线的重要过境点，也是它们的筑巢和越冬区域。由于H5N1和腺病毒感染，该地区经常发生海鸥和燕鸥的大规模死亡。
众所周知，感染致病性病毒会在受影响生物体的微生物组中引起显著变化。研究表明，禽流感病毒（AIV）感染会减少野生鸟类和家禽肠道微生物组成的多样性和改变优势分类群。在感染H5N1的天鹅中，观察到多个器官的严重坏死以及派尔斑中淋巴细胞耗竭，这对免疫系统至关重要。
在这项研究中，我们旨在调查2023年和2024年高致病性H5N1致命影响后天鹅微生物组的状态。H5N1感染对候鸟肠道微生物群的影响研究极少；此类研究对于理解流行期间发生的微生物学过程至关重要。
材料与方法
样品采集
从2023年12月和2024年12月因确诊H5N1感染死亡的疣鼻天鹅（Cygnus olor）和大天鹅（Cygnus cygnus）身上收集拭子样本（表1）。样品取自当天或1至2天前死亡的新鲜天鹅尸体。采样时的气温范围为0至2°C，尸体检视评估为非常新鲜。获得两种类型的拭子样本：幼年和成年天鹅的泄殖腔和气管样本。样品使用无菌拭子收集，放置在含有运输介质的小瓶中，并在液氮中以-195°C保存1至2天，直至送至实验室。在实验室中，样品放置于冷冻机中并在-80°C下保存，直到文库准备完成。
表1
表1. 2023年和2024年从死亡天鹅采集的样本。
16S rRNA基因扩增和测序
使用PureLink Microbiome DNA纯化试剂盒（Invitrogen，美国）提取微生物DNA。使用Qubit 4荧光计（Invitrogen，美国）评估提取的DNA浓度。按照制造商推荐的PCR热循环条件，使用包含Illumina适配子的引物对扩增16S rRNA基因的V3-V4区域（Illumina，美国）。通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增子，并用AxyPrep Mag PCR清洁珠（Axygen，美国）进行纯化。纯化的扩增子使用Illumina Nextera XT索引试剂盒进行索引，随后进行另一轮纯化。使用Qubit 1x dsDNA HS检测试剂盒（Invitrogen，美国）对文库进行定量，并按等摩尔浓度混合。使用MiSeq v.3（2×300 bp）化学试剂盒进行测序。由测序仪软件进行适配子去除。生成的原始16S rRNA基因序列上传至序列读取档案（BioProject ID: PRJNA1240282）。
生物信息学分析
使用RStudio中的DADA2管道进行质量过滤、错误校正和扩增子序列变异（ASV）推断。使用SILVA 138.1核糖体RNA数据库（silva_nr99_v138.1_wSpecies_train_set.fa）进行分类学分类。使用RStudio中的ggplot2进行细菌属相对丰度的可视化，并使用Wilcoxon秩和检验分析拭子类型之间的统计差异。使用R中的phyloseq包计算α多样性指标（Shannon和Simpson指数）和β多样性（Bray-Curtis相异性）。进行主坐标分析（PCoA）以评估群落组成差异。使用R Vegan包（版本2.6-4）中的adonis2函数进行PERMANOVA统计检验。使用RStudio 4.4.3（2025-02-28 ucrt）中的pheatmap包实现样本微生物多样性与样本类型、年份和年龄类别的关系的热图和聚类分析。
结果
受影响天鹅微生物组的分类组成
在属水平上的分类组成分析显示数据集中特定细菌分类单元的明显主导地位（图1）。弯曲杆菌在泄殖腔和气管样本中均成为压倒性的主要属，其次是梭杆菌作为第二多的分类群（补充表S1）。其他普遍存在的一致性细菌包括链杆菌和拟杆菌，这些通常与肠道和粘膜微生物群有关。这种主导模式在所有十六个检查样本中保持一致，表明这些细菌在整个感染天鹅的呼吸和消化系统中具有系统性影响。
图1
图1. 属水平的相对丰度。最丰富的属出现在棕绿色。其他显着的属包括绿色、粉色和蓝色，但比例较低。n = 16个样本（9个泄殖腔，7个气管；11个成年，5个幼年）。
通过堆积条形图可视化相对丰度确认了这一分类特征，弯曲杆菌（表现为芥末黄色）在所有样本类型中构成大多数细菌群落，而其他属的比例则低得多。这种跨样本类型的持续主导代表了一个重要发现，因为它表明H5N1感染可能在宿主体内的不同生理环境中促进类似的微生物失调模式。
H5N1感染天鹅中的微生物多样性模式
α多样性指标的分析揭示了受H5N1感染影响的天鹅微生物群落中的独特模式。Shannon和Simpson多样性指数始终显示，泄殖腔样本比气管样本拥有更多样化的微生物群落。Shannon指数考虑了分类群的丰富度和平等性，无论天鹅的年龄类别如何，泄殖腔样本的值都较高。同样，Simpson多样性值大多接近1，这表示尽管被少数关键分类群主导，但社区相对平衡。
年龄相关的差异在多样性指标中显而易见，幼年天鹅表现出比成年鸟更广泛的多样性值范围。这种变异性表明年轻天鹅可能寄生更多异质的微生物群落，这可以归因于免疫系统发育差异或感染前的环境暴露。有趣的是，比较2023年和2024年收集的样本时未出现明显的年份聚类，表明尽管可能存在环境或病毒株变异，这两年间的微生物多样性模式相对稳定（图2）。
图2
图2. 不同因素下的α多样性指标（Shannon和Simpson指数）：拭子类型（泄殖腔与气管）。年龄（成年与幼年）。年份（2023 vs. 2024）。1. Shannon多样性（左面板）——泄殖腔样本的Shannon多样性略高于气管样本。幼年样本（蓝色）通常显示出比成年样本（红色）更广泛的多样性。2024年的样本（三角形）比2023年的样本（圆点）更具可变性。n = 16个样本（9个泄殖腔，7个气管；11个成年，5个幼年）。
群落组成和β多样性分析
基于Bray-Curtis相异性矩阵的主坐标分析（PCoA）揭示了各类别样本中群落结构的显著模式。可视化显示泄殖腔和气管样本之间有中度分离，表明采样位点是H5N1感染天鹅微生物群落差异的主要驱动因素。这种解剖差异比任何基于年龄类别的聚类更为显著，因为幼年和成年样本在排序空间中有相当大的重叠（图3）。
图3
图3. H5N1感染天鹅的α和β多样性分析。拭子类型效应——泄殖腔拭子的Shannon和Simpson多样性通常略高于气管拭子。年龄效应——幼年（蓝色）往往比成年（红色）有更广泛的多样性值。年份效应——形状差异表明数据来自多年（2023：圆圈，2024：三角形）。没有强烈的年份聚类证据。n = 16个样本（9个泄殖腔，7个气管；11个成年，5个幼年）。
PERMANOVA测试提供了这些观察模式的统计确认。分析显示拭子类型确实是一个重要的因素（F = 2.337，R2=0.143，p = 0.01），解释了大约14.3%的样本间微生物组成变化。令人惊讶的是，年龄并未显著影响微生物组成（F = 0.6495，R2=0.044，p = 0.865），而收集年份仅显示出边际效应（F = 1.5349，R2=0.099，p = 0.098）。总体上，测试的因素（拭子类型、年龄和年份）解释了约29.67%的微生物群落结构总变异（F = 1.6877，R2=0.29673，p = 0.008），表明额外的未探索因素也可能贡献于这些H5N1感染鸟类中观察到的微生物多样性。
微生物丰度的热图可视化
通过热图可视化的层次聚类分析进一步说明了样本间的微生物分布模式（图4）。颜色梯度从红色（最高丰度）到黄色（中等丰度）再到蓝色（低丰度），有效展示了弯曲杆菌和梭杆菌属在大多数样本中保持高丰度，而其他细菌则表现出更多变量或样本特异性的模式。丰度值的Log10转换标准化了数据，并突出了数据集中的相对丰度差异。热图聚类表明，虽然解剖采样位点（泄殖腔与气管）影响整体群落结构，但某些细菌特征与H5N1感染一致关联，而不受其他变量影响。这一观察支持了禽流感感染可能驱动鸟类微生物组可预测变化的假设，可能有助于疾病发病机制。此热图成功突出了样本间微生物组组成的差异。
图4
图4. 多个天鹅样本属水平微生物组组成的热图可视化。对行（属）和列（样本）应用层次聚类，将相似模式分组。Log10转换帮助标准化数据并突出相对丰度差异。颜色解释——颜色梯度表示转换后的丰度值：红色——最高丰度。黄色——中等高丰度，蓝色——低丰度，白色——很低或接近零丰度。n = 16个样本（9个泄殖腔，7个气管；11个成年，5个幼年）。
讨论
在H5N1感染天鹅中占主导地位的细菌属
本研究最显著的发现是在因H5N1感染死亡的天鹅微生物组中弯曲杆菌的压倒性主导地位，其次是梭杆菌。在所有检查样本中，弯曲杆菌和梭杆菌成为主导属，表明它们在整个鸟体内的系统性传播。它们在所有样本中的显著存在引发了关于其在H5N1感染后组织损伤中的潜在参与的问题。假设天鹅样本中弯曲杆菌和梭杆菌的高丰度是失调的结果，而不是其致病性的增加。弯曲杆菌物种通常栖息在鸟类肠道中，常常作为共生菌，但在健康鸟类的正常肠道微生物组中通常只占很小一部分。这些细菌被认为是重要的人畜共患病原体，野生鸟类是能引起人类胃肠炎的物种的天然储存库。在家禽和水禽中，弯曲杆菌通常在其肠道中定植而不引起临床症状。例外情况如C. hepaticus和C. bilis可导致蛋鸡的“斑点肝病”，但这些是特殊情况。
梭杆菌是鉴定出的第二大丰富属，包含厌氧细菌，通常是鸟类肠道微生物组的次要成分，但在一些野生鸟类种类的微生物组中，它可以是常见物种之一。因此，需要进一步研究以证实这些细菌在感染高致病性H5N1流感病毒的天鹅中的显著增加。
链杆菌和拟杆菌也被一致检测到，但丰度较低。链杆菌在禽类微生物组研究中较少报道，而拟杆菌物种是许多脊椎动物（包括鸟类）健康肠道群落的典型成员，它们在碳水化合物代谢中发挥重要作用。
社区模式的统计确认
PERMANOVA分析提供了微生物群落结构观察模式的强有力统计确认。拭子类型成为一个重要因素（F = 2.337，R2=0.143，p = 0.01），解释了样本间微生物组成约14.3%的变化。这一发现表明，尽管某些属在不同样本类型中保持一致的优势，但在H5N1感染天鹅的呼吸系统和消化系统中仍存在显著的解剖差异。有趣的是，年龄并未显著影响微生物组成（F = 0.6495，R2=0.044，p = 0.865），这表明H5N1感染可能掩盖了健康鸟类中通常观察到的与年龄相关的微生物组差异。收集年份仅显示出边际效应（F = 1.5349，R2=0.099，p = 0.098），表明两年疫情期间的微生物模式相对稳定。综合来看，测试的因素解释了微生物群落结构总变异的大约29.67%，表明未在此研究中捕捉到的其他因素（如病毒载量、个体差异或环境条件）也对观察到的模式有所贡献。
与先前关于H5N1感染天鹅及其他禽类微生物组研究的比较
我们的发现与Zhao等人报告的结果显著不同，他们调查了H5N1病毒感染对迁徙中的大天鹅粪便微生物组的影响。虽然他们观察到H5N1感染后微生物群落的变化，但没有报告我们识别出的弯曲杆菌的压倒性优势。相反，Zhao等人发现H5N1感染显著增加了气单胞菌的相对丰度，同时减少了肠道微生物组中的乳酸杆菌。我们结果与Zhao等人的差异可能反映了样本采集时机（活鸟与刚死鸟）、影响基线微生物组组成的地理变量或病毒株及其对宿主-微生物相互作用影响的差异。此外，Zhao等人专注于粪便样本，而我们的研究纳入了泄殖腔和气管样本，提供了在致命H5N1感染后整个鸟类体内微生物变化的更全面视角。
禽流感病毒破坏肠道完整性，扰乱微生物平衡，并在肠粘膜中引发炎症。在家禽中，即使是低致病性禽流感病毒（H9N2）也会导致肠道失调，表现为感染急性期微生物α多样性减少以及微生物平衡恢复延迟。在流感-细菌共感染中观察到的严重疾病主要是由于抗菌免疫反应受损和病原体之间的协同作用所致。
与正常禽类微生物组的比较
我们在H5N1感染天鹅中观察到的微生物组组成与典型的禽类肠道微生物组有很大偏差。健康鸟类胃肠道通常由厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门成员主导，且在物种、饮食和栖息地方面存在很大差异。相比之下，我们的研究结果显示特定属（尤其是弯曲杆菌和梭杆菌）的极端主导地位，这些细菌在健康鸟类中通常以更低的丰度存在。这种模式表明与H5N1感染相关的严重失调。这些潜在致病菌在呼吸和消化道中的一致存在表明多个身体系统的正常微生物组受到深度破坏。改变的微生物组可能通过直接致病作用或通过损害依赖于健康微生物群落的正常生理功能（如营养吸收、屏障保护和免疫调节）来促成疾病的发病机制。
发现的意义
据我们所知，这项研究首次全面描述了因H5N1感染而死亡的天鹅的微生物组。我们的研究结果揭示了一种一致的微生物失调模式，其特征是不同解剖部位中弯曲杆菌和梭杆菌属的主导地位。这些结果提供了关于高致病性禽流感如何与宿主微生物组相互作用的重要见解，可能有助于疾病严重程度和死亡率。识别与致命H5N1感染相关联的特定细菌特征可能作为疾病进展的标记或受感染鸟类不良预后的指标。此外，我们的研究结果表明，考虑细菌共感染或继发性细菌过度生长可能对理解H5N1感染在野生鸟类群体中的全部病理学很重要。在不同年份（2023年12月和2024年12月）收集的样本中观察到的这些微生物模式的一致性表明一种稳定的宿主-病原体-微生物组相互作用，这可能是里海地区天鹅种群H5N1疫情的特征。
局限性
本研究的一个显著局限性在于样本是从死亡天鹅中收集的，这可能会影响微生物组组成，由于死后变化。然而，几个因素减轻了这一担忧。样本是在寒冷的十二月条件下（0-2°C）收集的，这将显著减缓细菌过度生长和死后分解过程。此外，我们特别选择了刚刚死亡的天鹅，其中一些样本是从当天死亡或正在死亡的鸟类中采集的。尸体检视评估为“非常新鲜”，进一步最小化了潜在的死后改变。样本在-195°C液氮中立即存储，有效地停止了收集后的任何进一步微生物变化。尽管承认这一限制，我们认为在多个样本中观察到的一致模式和特定分类群的极端优势表明了真实的感染相关失调，而非死后伪影。一个值得注意的限制是没有健康的对照组，这阻止了得出观察到的微生物组变化完全由H5N1感染引起且不受其他因素影响的明确结论。未来的研究包括健康天鹅和处于不同感染阶段的鸟类样本将进一步验证这些发现。
结论
这项研究提供了关于里海地区野生天鹅致命H5N1感染相关微生物组变化的新见解。不同采样位点中弯曲杆菌和梭杆菌的一致主导地位表明病毒性感染对禽类微生物组的深远和系统性影响。这些发现扩展了我们对高致病性禽流感如何影响野生鸟类宿主-微生物相互作用的理解，可能识别影响这些脆弱种群疾病严重程度和死亡率的新因素。进一步研究H5N1感染驱动这些微生物组变化的具体机制以及这些变化如何促成疾病发病机制将有助于扩大我们对禽流感生态学的知识，并可能为未来的野生动物疾病管理提供信息。
(全文结束)
