摘要
四种新型取代咪唑衍生物—5a (Kim-161)、5b (Kim-111)、5c (Kim-261)和5d (Kim-231)被评估了对尿路上皮癌的抗增殖活性。其中，Kim-161 (5a)和Kim-111 (5b)两种衍生物对T24移行细胞癌细胞系表现出显著的细胞毒性，通过MTT比色法测定的IC50值分别为56.11 μM和67.29 μM。进一步的机制研究表明，这些化合物调节了癌症进展中的关键通路，包括细胞周期调控(p53)、致癌信号传导(Kras)、细胞凋亡(BAX和caspase 3)、炎症反应(白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和核因子κB(NF-κB))、自噬调控(磷脂酰肌醇3-激酶信号通路(PIK3CA)及其靶点蛋白激酶Akt和雷帕霉素靶蛋白(mTOR))以及转移(基质金属蛋白酶-9(MMP-9))。针对关键癌症靶点PTK6、FLT3和BCL-2的分子对接和动态模拟显示这些化合物具有优异的结合亲和力和稳定的蛋白-配体复合物。此外，这些化合物表现出良好的类药性质，包括最佳的理化和药代动力学特征。这种结合体外验证和计算建模的综合方法，使Kim-161和Kim-111成为靶向尿路上皮癌治疗的有希望的先导化合物。研究结果强调了双重激酶/微管抑制在对抗侵袭性恶性肿瘤中的治疗潜力，为后续临床前开发提供了坚实基础。
引言
膀胱癌(BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在男性中排名第六位。从组织学角度看，尿路上皮癌占诊断病例的大多数，性别差异显著：男性每10万人中有9.5例，而女性每10万人中仅有2.4例。每年报告超过43万例新病例，突显出对有效疗法的迫切需求。该疾病主要表现为两种形式：非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC，占病例的75%)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)，后者预后较差，75%的MIBC患者会发生转移，生存率急剧下降。
目前的治疗策略严重依赖手术和化疗，杂环化合物如喹唑啉、喹喔啉和酞嗪发挥着关键作用。然而，一线治疗方案——吉西他滨和顺铂——成本高昂且副作用严重，使患者迫切需要更安全、更经济的替代方案。
新型抗癌剂的开发不仅是治疗优先事项，也是科学必然要求。现有药物的局限性、毒性、耐药性和高昂成本凸显了药物设计中创新方法的迫切需求。
在先前的研究中，我们设计并合成了八种受FDA批准的双抑制剂Tirbanibulin(KX2-391)启发的取代咪唑衍生物，该抑制剂可抑制微管聚合(IC50 = 250 nM)和SRC激酶(IC50 = 25 nM)。Tirbanibulin最初是为日光性角化病开发的，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均具有广谱抗癌活性。开发新型抗癌分子以超越Tirbanibulin的理由在于克服其局限性，同时提高疗效、安全性和适用性。尽管Tirbanibulin已获FDA批准用于日光性角化病，但其在更广泛的抗癌治疗中的应用受到潜在耐药性、肿瘤渗透有限和副作用的限制。下一代分子可以设计为提高靶点特异性、生物利用度和多通路抑制，降低耐药风险。在合成的衍生物中，四种在包括MCF7(乳腺)、HCT116(结肠)、PC3(前列腺)和HL60(白血病)在内的多种癌细胞系上表现出显著的细胞毒性，IC50值范围为0.2至74.16 μM。最有希望的候选物5a (Kim-161)、5b (Kim-111)、5c (Kim-261)和5d (Kim-231)被选中进一步研究尿路上皮癌。它们的设计利用了两种关键策略：
- 等排替换：在保持生物活性的同时交换原子或基团，以增强药代动力学特性。
- 疏水性取代：微调分子特性以改善类药性。
本研究通过以下方式推进膀胱癌治疗：
- 扩展化学空间：引入基于咪唑的支架作为抗癌药物开发的多功能平台。
- 双靶向能力：基于Tirbanibulin的成功，抑制酪氨酸激酶和微管聚合，从而克服耐药机制。
如图1所示，结构蓝图涉及用芳香环替换Tirbanibulin的吡啶环，用功能化咪唑环替换其取代的芳香部分。这种基于分子建模和喹啉/喹唑啉抗癌剂结构类似物的合理设计，产生了具有固定苄基-苯甲酰胺核心和可变取代咪唑部分的化合物(图2)。
Tirbanibulin含有吡啶环，而我们的目标化合物含有咪唑环，因为咪唑环具有相似的电子和空间特性，但由于氢键能力(咪唑具有NH基团，允许与微管形成额外相互作用)可能提供改进的相互作用。咪唑衍生物由于其良好的溶解度和生物利用度而显示出增强的药代动力学特性。此外，它们具有潜在的改善选择性和降低毒性的优势，因为咪唑的NH基团可能与微管形成独特的氢键，可能增强对癌细胞的选择性而非正常细胞，并具有更广泛的构效关系(SAR)。
这些发现突显了基于咪唑的治疗剂作为下一代治疗药物的前景，效力更强、毒性更低且经济可行。通过整合计算建模和生物验证，这项工作展示了肿瘤学未来研究的多学科方法基准。
有几个标志物在尿路上皮细胞衰老中起着至关重要的作用，其中同时激活KRAS和失活p53已被报道可诱导膀胱尿路上皮增生。由于致癌p53/KRAS在DNA损伤后调控细胞周期停滞，该通路的突变谱现在成为膀胱癌监测的有希望的生物标志物。p53/KRAS信号还影响膀胱癌患者的放射敏感性结果。
凋亡标志物BAX和caspase-3介导细胞死亡并调节凋亡，先前的研究指出BAX的缺失会损害体内衰老相关分泌表型(SASP)表达，并且调节膀胱癌细胞中BAX介导的凋亡可恢复对衰老通路的控制。
炎症细胞因子白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及其转录因子核因子κB(NF-κB)被认为是SASP中最保守的核心成分，可强化衰老并促进膀胱癌微环境重塑。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)是一种控制细胞生长和自噬的细胞内信号转导通路。鉴于其在尿路上皮癌微环境中调控细胞存活和血管生成的额外作用，该通路的成分已成为膀胱癌药物干预的有希望的靶点。PI3K/Akt/mTOR通路的激活也与尿路上皮癌患者的肿瘤进展和生存率降低相关。
基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是最广泛研究的MMP之一，是一种参与细胞外基质降解的重要蛋白酶。MMP-9表达升高与膀胱癌发病机制相关，在膀胱癌微环境中MMP-9的上调与不良预后和肿瘤进展相关，通过增强肿瘤生长、侵袭和转移。因此，MMP-9现在被认为是膀胱癌的关键血清标志物。
本研究调查了基于咪唑的药物对膀胱癌细胞系的疗效和治疗潜力，并提供机制洞察，为将这些发现转化为临床应用提供了全面的路线图。
结果与讨论
化学合成
化合物按照已报道的程序合成。(Z)−4-芳亚基-2-取代氧唑-5(4H)-酮中间体(3)通过Erlenmeyer方法制备，该方法是N-乙酰甘氨酸(1)或马尿酸与适当的醛(2)在乙酸酐和乙酸钠中反应得到。Kim化合物(5a-d)通过(Z)−4-芳亚基-2-取代氧唑-5(4H)-酮中间体(3)与4-氨基-N-苄基苯基乙酰胺(4)在干燥吡啶中的环缩合反应制备。这四种化合物均为Z型，包括5a (KIM-161)：(Z)-N-苄基-2-(4-(4-(4-甲氧基亚苄基)−2-甲基-5-氧代-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)苯基)乙酰胺，5b (KIM-111)：(Z)-N-苄基-2-(4-(4-亚苄基-2-甲基-5-氧代-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)苯基)乙酰胺，5c(KIM-261)：(Z)-N-苄基-2-(4-(4-(4-甲氧基亚苄基)−5-氧代-2-苯基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)苯基)乙酰胺，5d (KIM-231)：(Z)-N-苄基-2-(4-(4-(4-羟基-3-甲氧基亚苄基)−5-氧代-2-苯基-4,5-二氢-1H-咪唑-1-基)苯基)乙酰胺。
所有目标化合物均通过不同的分析技术确认，包括核磁共振(NMR)光谱分析，并通过高分辨质谱(HRMS)检测分子式。通过液相色谱/质谱(LC/MS)确认所有化合物的纯度高于95%。方案1显示了目标化合物(5a-d)及其项目代码的合成方法。所有化合物的合成程序和详细表征已在我们早期工作中全面描述。
理化性质
理化特性解释了分子量、分子式、重原子数量、芳香重原子数量、Csp3比例、可旋转键数量、氢键数量、摩尔折射率、拓扑极性表面积以及其他理化特征，如表1所示。它们还显示了这些化合物的高亲脂特性，负责高胃肠道吸收和血脑屏障渗透，特别是在Kim-161和Kim-111两种化合物中。它们还具有中等水溶性、良好的生物利用度评分、中等合成可及性，并遵循Lipinski规则，这意味着这些化合物适合生产为药物。另一方面，Kim-231和Kim-261两种化合物水溶性差、生物利用度评分良好、合成可及性中等，并且Lipinski规则有两个违反项，这意味着这些化合物不具备作为药物生产的最佳特性。表1显示了使用SwissADME计算的目标化合物的理化特性。
生物筛选
MTT比色法
通过MTT比色法对Kim-111、Kim-161、Kim-231和Kim-261分子在T24癌细胞系上的增殖抑制进行比较研究，结果显示Kim-111和Kim-161两种药物对细胞表现出细胞毒性，与Kim-231和Kim-261相比，在当前设置中测试的浓度下没有表现出抑制作用，如图3所示。Kim-111的IC50 = 67.29 μM，Kim-161的IC50 = 56.11 μM。与对照组相比，抑制影响随着浓度的增加而显著增加。
Kim 111和Kim 161化合物对T24尿路上皮癌细胞衰老和凋亡的影响
测试了一组建议的抗癌通路，以评估Kim 111和Kim 161处理对负责细胞衰老、凋亡、炎症和转移的基因表达的影响(表2)。
评估了负责细胞衰老的标志物(p53)、致癌(Kras)和细胞凋亡(BAX和caspase 3)，以检测Kim处理组与未处理的T24膀胱癌细胞之间的差异。
负责细胞衰老的p53基因，Kim 111处理与未处理的T24细胞相比表现出统计学上较低的表达，但相比之下，Kim 161处理的细胞与未处理的细胞相比表现出显著较高的表达。同样，Kim 111处理显著降低了Kras致癌基因的表达，但Kim 161与未处理的细胞相比表现出统计学上较高的表达。为评估测试化合物对细胞凋亡的影响，研究了T24细胞处理后建议调节凋亡过程的基因，即BAX和caspase 3。数据显示，Kim 111和161处理的细胞表现出较高的表达，与两组处理组之间以及与未处理细胞相比具有统计学显著差异(图4)。
Kim 111和Kim 161化合物对T24尿路上皮癌细胞炎症标志物的影响
关于炎症基因，与未处理细胞相比，Kim 111处理的细胞中IL6表现出统计学上较低的表达，但相比之下，Kim 161处理的细胞与未处理细胞相比表现出统计学上较高的表达。TNFα和NF-κB1基因表达在Kim 111和Kim116处理后增加，与两组处理组之间以及与未处理细胞相比具有统计学显著差异(图5)。
Kim 111和Kim 161化合物对T24尿路上皮癌细胞自噬和转移标志物的影响
本研究评估了Kim 111和Kim 161通过评估磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3CA)及其靶基因Akt和mTOR在调控细胞增殖和存活中的作用。Kim 111和Kim 161处理组与未处理组相比，PIK3CA和mTOR表达均显著降低。Kim 111处理的细胞与Kim 161处理的细胞之间PIK3CA和mTOR基因表达没有统计学显著差异。相比之下，Akt基因表达与两组处理组之间以及与未处理细胞相比表现出较高的表达，具有统计学显著差异。关于转移基因基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，与未处理细胞相比，两组处理组均表现出统计学上较低的表达，Kim 111和Kim 161处理的细胞之间没有显著差异(图6)。
上述数据证明了新型咪唑衍生物Kim-161和Kim-111作为尿路上皮癌(T24细胞)有希望的抗癌剂的潜力。如果正在进行的试验确认增强的BCL-2抑制、改善的安全性或在耐药癌症中的疗效，临床医生可能会考虑使用Kim-161替代Venetoclax。我们希望其优化的结构能提供更好的药代动力学、降低的毒性或更广泛的抗肿瘤活性，解决Venetoclax的局限性。然而，需要进一步研究来验证这些潜在优势。
计算建模
对接和结合构象
鉴定的前三个靶点(PTK6、FLT3和BCL-2)分别对应晶体结构6CZ4、4XUF和6O0K。选择靶点PTK6(6CZ4)、FLT3(4XUF)和BCL-2(6O0K)是由于它们在尿路上皮癌(UC)进展中的关键作用。PTK6促进细胞增殖和存活，是关键的致癌激酶。FLT3主要与白血病相关，通过异常信号通路与UC相关。BCL-2是一种抗凋亡蛋白，通常在UC中过表达，导致化疗耐药。晶体结构6CZ4、4XUF和6O0K为对接研究提供了高分辨率模板，能够评估新型衍生物作为潜在抑制剂。靶向这些蛋白质可能会破坏增殖和存活机制，为UC治疗提供战略方法。Kim-111和Kim-161在这些位点的Glide XP对接评分总结在表3中，与原生共晶配体的评分一起。总体而言，Kim-111在两种激酶PTK6和FLT3上表现出非常有利的对接(XP GScore ≈ -11.3和-11.6 kcal/mol)，基本上与原生抑制剂的结合评分相匹配(PTK6配体FKY为-14.76，FLT3的Quizartinib为-11.75)。Kim-161同样在这些位点上对接良好(≈ -11.6 kcal/mol)。在BCL-2中，Kim-111和Kim-161的对接评分较为温和(约-7.4至-7.9 kcal/mol)，反映出比原生BCL-2抑制剂Venetoclax(对接评分-10.94 kcal/mol)预测的结合较弱。值得注意的是，Kim-161在BCL-2中的构象与Venetoclax的位置大量重叠，表明Kim-161可以适应容纳促凋亡蛋白BH3结构域的相同疏水口袋。
诱导契合对接(IFD)结果显示这些构象的进一步优化。允许侧链灵活性导致Kim化合物的对接评分略有改善(表3)。例如，在FLT3中，Kim-111的IFD优化构象达到了-14.29 kcal/mol的对接评分(从-11.58改善)，超过了原生配体的重新对接评分。这种改善表明Kim-111可以诱导FLT3结合位点的轻微构象调整，以增强互补性。在BCL-2中，Kim-161的IFD优化允许Tyr108和Arg146侧链移动并形成上述氢键，获得更有利的评分(-8.84 vs. 初始-7.89)。总体而言，IFD证实Kim-111和Kim-161能够在仅有轻微局部受体调整的情况下结合到这些靶点的活性位点中，无需主要的主链运动即可容纳它们。
分子力学广义玻恩表面积(MM-GBSA)用于估计结合自由能，因为它被认为是高通量筛选的理想工具，用于确定结构稳定性并预测结合亲和力。作为一种更快、更便宜的计算工具，它成为更复杂自由能计算和经验评分函数的有希望的替代方案。
表3显示了Kim-161和Kim-111在顶级靶点中的对接评分(Glide XP)和(MM-GBSA)结合能，与原生配体相比。
对接评分(单位为kcal/mol)来自Glide XP(负值表示预测的亲和力更好)。ΔGbind是来自Prime MM-GBSA的结合自由能(更负=更有利)。PTK6原生配体指PDB 6CZ4的抑制剂(FKY)；FLT3原生配体是4XUF中的Quizartinib；BCL-2原生配体是6O0K中的Venetoclax。
如表3所示，MM-GBSA计算遵循对接评分的趋势。Kim-111和Kim-161被预测与FLT3和PTK6结合最强(ΔGbind ~ -69至-75 kcal/mol)，而它们与BCL-2的结合相对较弱(ΔGbind ~ -66 kcal/mol)。重要的是，所有ΔGbind值都显著为负，表明两种化合物都能在水环境中与每个靶点形成稳定的复合物。原生配体作为高亲和力抑制剂，具有明显更有利的ΔGbind(例如，Venetoclax与BCL-2的-122.5 kcal/mol)，这是预期的，因为它们针对这些靶点进行了优化。
分子动力学稳定性
100 ns分子动力学(MD)模拟提供了对接构象的动态验证。在所有情况下，蛋白-配体复合物在整个模拟过程中保持完整，未观察到解离事件。图11显示了代表性复合物的RMSD分布图，所有模拟的定量稳定性指标总结在表3中。总体而言，FLT3复合物是最稳定的：Kim-111结合到FLT3中，蛋白主链RMSD在约1.8 Å处趋于平稳，配体RMSD在近100 ns内保持在1.5 Å以下(图11)。Kim-161在FLT3中显示出类似较低的配体RMSD(~1.0 Å平均值)，表明两种化合物都紧密占据FLT3激酶位点，没有显著位移。PTK6模拟显示出略高的主链RMSD(~2.5 Å)，但仍然合理的稳定性。值得注意的是，Kim-111在PTK6中保持较低的配体RMSD(~2 Å)，而Kim-161在PTK6中波动较大(配体RMSD暂时上升至~4 Å)，表明Kim-161在PTK6中的拟合不如Kim-111优化或稳定。
在BCL-2模拟中，两种化合物的行为有所不同。Kim-161与BCL-2形成了非常稳定的复合物：在初始调整后(配体RMSD < 2 Å在前5 ns内)，Kim-161保持在其对接位置附近(平均配体RMSD ~1.8 Å)用于其余轨迹。相比之下，Kim-111在BCL-2中表现出更多的运动——其配体RMSD在2至4 Å之间波动，尽管保持在口袋中。这与Kim-111对BCL-2较弱的对接评分和MM-GBSA能量一致，表明Kim-111与BCL-2的结合不如Kim-161牢固。BCL-2蛋白本身在任一配体结合时保持稳定(主链RMSD ~1.5 Å)，与Venetoclax的对照模拟相当(显示主链RMSD ~1.3 Å和配体RMSD ~1 Å，符合紧密结合物的预期)。
MD分析还检查了残基灵活性和相互作用。RMSF图显示结合位点外围的环区域有轻微波动(高达3 Å)，但在每个配体存在下，关键结合位点残基保持相对刚性(RMSF < 1 Å)。在FLT3中，两种Kim-111和Kim-161都稳定了激活环和铰链(与抑制剂相互作用)中的残基，类似于原生抑制剂。在BCL-2中，Kim-161的存在使结合槽残基(如Tyr108、Phe104、Arg146)有序，而Kim-111存在时，含有Arg146的环有轻微波动，与Kim-111在那里的一致性较低相互作用相关。
关键的是，MD轨迹证实了对接中识别的关键蛋白-配体相互作用随时间持续存在。例如，在BCL-2-Kim-161模拟中，Kim-161的酰胺羰基与Asn143侧链之间的氢键保持~66%的时间，Kim-161的仲胺与Tyr108主链羰基之间形成稳定的氢键(83%占据率)。这些相互作用密切反映了Venetoclax在BCL-2中形成的相互作用，增加了对Kim-161确实以功能相关方式与BCL-2口袋相互作用的信心。Kim-111也保留了与Tyr108的氢键，但频率较低(~40%的帧)，解释了其较弱的结合。在FLT3中，Kim-111一致地与激酶铰链区域形成两个氢键(与主链羰基和铰链残基的侧链)，在MD期间保持>70%的占据率。Kim-161在FLT3中也维持铰链区域氢键，尽管一个相互作用是间歇性的(约30%占据率)，与其略低的亲和力预测一致。疏水接触大部分得以保留，例如，Kim-111通过π堆积和范德华接触保持与FLT3看门残基和Phe830(在激活环中)的紧密接触，Kim-161在>80%的模拟帧中保持与BCL-2疏水槽残基Phe104和Val130的接触。
总之，MD结果通过证明Kim-111和Kim-161在显式溶剂环境中与所有三个假设靶点形成稳定复合物，支持了对接发现。MD的稳定性排序(FLT3中最稳定，其次是PTK6，然后是Kim-111的BCL-2；Kim-161的FLT3 ≈ BCL-2 > PTK6)与结合亲和力预测一致。稳定性方面的微小差异(例如，Kim-161在BCL-2中优于Kim-111，而Kim-111在PTK6中略稳定)被观察到，突显了这两种化合物在靶向不同蛋白质方面的互补性质。关键氢键的持久性和低配体RMSD，特别是强调了Kim-111非常适合靶向FLT3/PTK6，而Kim-161特别适合与BCL-2结合。
计算建模为Kim-111和Kim-161的生物活性提供了机制原理。对接和MD模拟确定了这些化合物的多个潜在靶点，表明多药理模式(即命中多个靶点)。两个致癌激酶(PTK6和FLT3)和抗凋亡蛋白BCL-2成为顶级结合靶点。这与实验观察很好地吻合，Kim-111和Kim-161在膀胱癌细胞中表现出有效的抗癌作用，可能通过促凋亡和抗增殖机制的组合。
作为凋亡相关靶点的BCL-2：Kim-161与BCL-2的强结合尤其值得注意。BCL-2是细胞死亡的关键调节剂；抑制BCL-2释放促凋亡因子如BAX/BAK以触发线粒体凋亡。我们的模拟显示，Kim-161占据了与已知BCL-2抑制剂Venetoclax相同的位点，甚至形成类似相互作用(Tyr108和Asn143氢键，与Phe104的疏水接触)。虽然Kim-161的计算亲和力低于Venetoclax，但它仍然显著，MD数据确认复合物保持稳定。这为处理细胞中观察到的凋亡诱导提供了分子基础——如果Kim-161与BCL-2结合，它将中和BCL-2的抗凋亡功能，导致凋亡增加。事实上，在我们的生物测定中，两种化合物都增加了膀胱癌细胞中促凋亡基因(BAX、Caspase 3)和细胞死亡标志物的表达，与BCL-2抑制缓解凋亡抑制一致。有趣的是，与Kim-111相比，Kim-161对这些凋亡标志物的影响更大(例如，Kim-161处理细胞中BAX、caspase-3和p53表达更高，相对于Kim-111)，这与Kim-161在计算机中对BCL-2的较强结合相关。因此，我们提出Kim-161作为靶向BCL-2的BH3模拟剂，在癌细胞中触发内在凋亡通路。
激酶抑制和抗增殖效果：Kim-111和Kim-161均对PTK6(蛋白酪氨酸激酶6)和FLT3(Fms样酪氨酸激酶3)表现出高对接亲和力。这些激酶参与肿瘤细胞增殖和存活信号。PTK6，例如，在某些癌症中过表达并可促进迁移和生长，而FLT3在白血病和可能的其他环境中激活PI3K/Akt和Ras/MAPK等通路。我们发现Kim-111非常稳定地结合FLT3(在ATP结合位点中具有低RMSD和持久氢键)表明Kim-111可能是一种有效的FLT3抑制剂。Kim-161也很好地结合FLT3，尽管略紧。在生物数据中，我们观察到用任一化合物处理的细胞中PI3K(PIK3CA基因)和mTOR表达下调，以及Akt和KRAS表达的变化。这些可能是激酶抑制的下游后果：如果Kim-111和Kim-161抑制FLT3或PTK6，它们将减弱PI3K/Akt和RAS信号，导致增殖减少并可能诱导衰老。值得注意的是，与对照相比，Kim-111处理的细胞p53和KRAS表达较低(表明类似衰老的细胞周期停滞)，而Kim-161处理的细胞对这些基因表现出相反的趋势。这种差异可能通过其靶点谱得到解释：Kim-111，具有更强的激酶(FLT3/PTK6)抑制，可能在不严重应激凋亡通路的情况下强制细胞周期停滞(因此p53在反馈循环中较低)，而Kim-161通过强烈打击BCL-2，推动细胞进入凋亡(这可能提高p53作为DNA损伤反应)。本质上，Kim-111可能更多地作为多激酶抑制剂，减缓增殖，而Kim-161具有双重作用：适度激酶抑制加上通过BCL-2的强效凋亡诱导。这种多靶向激酶抑制剂在肿瘤学中很常见(例如，许多TKI命中多个激酶)，并且可以通过阻断冗余存活通路而具有优势。
靶点选择性和协同作用：不同的靶点结合也为Kim-111和Kim-161的治疗用途提供了见解。Kim-111对FLT3的高亲和力表明其在FLT3重要的恶性肿瘤(例如白血病)中或在FLT3或PTK6促进生长的实体瘤中具有潜力。同时，Kim-161对BCL-2的靶向表明它可以敏化癌细胞凋亡，甚至可以与其他疗法联合使用。在膀胱癌中，BCL-2是化疗耐药的一种机制；因此Kim-161可能通过禁用肿瘤细胞存活程序来增强化疗的疗效。两种化合物都能参与多个靶点(激酶和BCL-2)的事实是很有希望的，因为癌细胞通常依赖网络冗余。通过同时攻击存活信号和抗凋亡防御，Kim-111和Kim-161可能实现一石二鸟：强制细胞周期退出然后驱动程序性细胞死亡。这一假设得到了基因表达中看到的全面变化的支持(衰老标志物、凋亡标志物和炎症通路都发生了改变)。我们的计算数据通过分子水平的具体结合相互作用支持了这种广泛的作用。
考虑到Kim-111和Kim-161都是设计为对多种激酶具有活性的取代咪唑衍生物，考虑它们可能的脱靶效应至关重要，这些效应可能来自与非靶点激酶或细胞蛋白的意外相互作用。这些效应引发了对这些化合物的治疗效果、安全性和特异性的担忧。
由于激酶抑制剂通常共享保守的ATP结合位点，因此可能存在与非靶点激酶的交叉反应和/或相互作用。例如，KIM-161已被报道下调几种其他激酶，如ERK1/2、GSK-3α/β、HSP27和JAK/STAT2信号，这可能导致意外的免疫调节。
此外，咪唑衍生物已知与细胞色素P450酶相互作用，可能影响药物药代动力学和代谢。这些衍生物的氢键结合潜力是另一个因素，增加了与离子通道或G蛋白偶联受体(GPCRs)结合的可能性，这可能表现为神经、内分泌或胃肠道紊乱。
因此，未来研究应纳入体内毒性测定、选择性测试和广泛的分子对接分析，以预测任何系统风险并减轻任何副作用，确保这些化合物的治疗效果和安全性。
本研究的计算机发现还应跟随有针对性的实验验证。例如，下拉或SPR测定可以确认Kim-161与BCL-2的直接结合，激酶抑制测定(或细胞磷底物读数)可以验证FLT3或PTK6活性是否被Kim-111抑制。Kim-161与BCL-2的共结晶或冷冻电镜将明确显示它是否如预测的那样结合在Venetoclax口袋中。同样，与FLT3或PTK6的共晶结构将指导支架的优化以实现更紧密的结合，因为我们的建模表明，例如，添加与PTK6的Asp164(铰链区域)相互作用的功能可能提高Kim-161对PTK6的亲和力。药物化学优化可以对两种化合物不同地进行：对于Kim-161，增加对BCL-2的亲和力(也许通过像Venetoclax的氯苯基基团那样延伸到P2口袋)可以产生有效的凋亡剂，而对于Kim-111，维持广泛的激酶覆盖但改善BCL-2活性可能会创造一种平衡的双靶向药物。鉴于计算洞察表明每种化合物在不同靶点上表现出色，设计结合两者有利特征的类似物(Kim-111的激酶抑制与Kim-161的BCL-2抑制)是一种有趣的策略。
总之，我们的计算建模研究提供了Kim-111和Kim-161如何在分子水平上与癌症相关蛋白相互作用的详细图景。数据显示Kim-161直接拮抗BCL-2，释放凋亡，而Kim-111有效抑制FLT3/PTK6等致癌激酶，阻碍存活信号，两种化合物在这些靶点上表现出重叠的活性。这种双重模式与在膀胱癌细胞中观察到的抗增殖和促凋亡效果高度一致。最突出的目标是BCL-2，鉴于其在凋亡中的关键作用和Kim-161结合的有力证据；靶向BCL-2与实验中看到的显著细胞死亡(以及凋亡标志物的上调)一致。PTK6和FLT3作为可能通过减少细胞活力和侵袭性(例如，PTK6与迁移相关，其抑制可能降低转移潜力)对化合物功效有贡献的额外靶点出现。通过将计算机预测与体外观察相关联，我们为Kim-111和Kim-161的多方面抗癌作用建立了连贯的原理。这些见解不仅验证了化合物的机制，还指导了未来的发展，表明进一步的目标验证(特别是BCL-2)和基于结构的优化最终可能导致膀胱癌及其他癌症的新治疗候选物。这里应用的计算方法，整合对接、诱导契合优化、MM-GBSA评分和长时间尺度MD，说明了计算机建模如何在没有详尽的实验结构生物学的情况下深刻地告知和加速药物发现工作，以识别和表征药物-靶点相互作用。
材料与方法
化学
目标化合物根据已报道的程序制备。
理化特性
目标化合物(5a-d)的理化特性使用可用的在线软件SwissADME确定。
计算建模
所有计算建模研究均使用Schrödinger Suite 2021(Schrödinger, LLC, New York, NY)进行。Kim-161和Kim-111的化学结构使用LigPrep(Schrödinger)绘制和准备，使用OPLS4力场。在pH 7.4 ± 0.2下使用Epik生成电离状态，确保化合物处于生理条件下可能的质子化形式。保留低能量构象用于对接。
蛋白质准备
从蛋白质数据库(PDB)中检索了三个候选靶蛋白的晶体结构：PTK6激酶结构域(PDB ID 6CZ4)、FLT3酪氨酸激酶结构域(PDB ID 4XUF)和BCL-2蛋白(PDB ID 6O0K)。选择这些结构是基于初步虚拟筛选，表明Kim-111和Kim-161具有有利的结合。使用Protein Preparation Wizard(Maestro, Schrödinger)对每个结构进行准备，包括添加氢、分配部分电荷和封端末端。调整了键序，并使用Prime重建了缺失的侧链或环(如果有的话)。移除了晶体学水分子，除非它们介导配体相互作用。使用OPLS4力场最小化蛋白质，将重原子约束在实验位置。
受体网格生成
对于每个准备好的蛋白质，结合位点定义为中心位于共晶配体(原生抑制剂)位置。在Glide(Glide, Schrödinger Release 2021-3)中生成受体网格，框包含配体10 Å范围内的残基。这确保对接搜索空间覆盖已知活性位点。应用范德华半径缩放(受体1.0，配体0.8)以在初始对接期间软化非极性接触。
分子对接(Glide XP)
首先使用Glide在超精确(XP)模式下将Kim-161和Kim-111化合物对接到每个靶点的活性位点中。Glide XP对接使用配体构象和方向的彻底采样，具有用于准确姿态排序的增强评分功能。保留排名靠前的姿态进行分析。对接评分(GlideScore，单位为kcal/mol)用于估计结合亲和力：更负的评分表示预测的结合更紧密。为验证，将每种蛋白质的原生配体(来自晶体结构)在相同设置下重新对接，以将评分和姿态与实验参考进行比较。
诱导契合对接(IFD)
为考虑受体灵活性，对顶级靶点执行了诱导契合对接。IFD协议(Prime 5.8/Glide 8.8, Schrödinger)迭代优化配体姿态和附近受体残基。首先，使用软化受体势(半径缩放0.5)运行Glide XP对接以生成初步姿态。对于每个顶级姿态，将配体5 Å范围内的蛋白质侧链修剪，然后使用Prime(在内部坐标最小化中)松弛。将配体重新对接到诱导契合受体结构中，并使用Glide XP进行评分。这产生了优化的姿态和IFD对接评分(结合配体应变和对接评分)。将IFD程序应用于6CZ4、4XUF和6O0K，以查看允许侧链移动是否会改善Kim-111和Kim-161的结合方向。为后续研究选择最佳诱导契合姿态。
MM-GBSA结合能计算
对于每个蛋白-配体复合物(原生配体和Kim-111/161的顶级姿态)，使用Prime MM-GBSA(Schrödinger)在VSGB 2.0溶剂模型中估计结合自由能(ΔGbind)。Prime MM-GBSA工作流程最小化配体、受体和复合物，并计算近似ΔGbind = Ecomplex – (Ereceptor + Eligand)，考虑分子力学能量和隐式溶剂(水)效应。能量评估使用OPLS4力场。这些计算提供了溶液中结合自由能的比较排名，补充了对接评分(这是气相和几何近似)。更负的MM-GBSA能量表示更有利的结合。结果记录在每个靶点中Kim-111和161的每个配体表3中。
分子动力学模拟
为评估对接复合物的稳定性，使用Desmond 6.6(D. E. Shaw Research)进行分子动力学(MD)模拟。每个靶点中Kim-161和Kim-111的最高评分复合物以及具有其原生配体的蛋白质用作起始结构。将每个复合物嵌入至少从蛋白质延伸10 Å的正交SPC水盒中，并用0.15 M NaCl中和(添加反离子以中和电荷)。系统通常包含约50,000个原子，包括溶剂。对蛋白质和配体应用OPLS4力场，TIP3P水用作溶剂模型。构建后，每个系统最小化2000步以去除不良接触，然后在20 ps内缓慢加热至300 K。在NPT系综中于300 K和1 atm进行生产MD，使用Langevin恒温器和压控器。使用周期性边界条件和粒子-网格埃瓦尔德求和进行长程静电。使用2-fs积分时间步长，约束氢的键。每个模拟进行100 ns，每100 ps保存坐标进行分析(总共1000帧)。
轨迹分析
使用Maestro中的Simulation Event Analysis模块分析MD轨迹。计算蛋白质Cα原子和配体重原子的均方根偏差(RMSD)(以蛋白质主链作为对齐参考)以评估结构稳定性。计算蛋白质Cα的每个残基均方根波动(RMSF)以识别柔性区域。监测配体和蛋白质之间的氢键数量，如果供体-受体距离≤ 3.5 Å且角度≥ 120°，则计算氢键。使用Desmond交互分析工具确定关键蛋白-配体接触(氢键、疏水相互作用、π-π堆积等)及其占据率(模拟时间的%)。在Maestro和LigPlot+中可视化结合姿态和相互作用。所有图形图(RMSD、RMSF)在Excel/Matplotlib中准备，2D交互图由Schrödinger的simulation interaction diagram panel生成。
细胞系和MTT比色法
人尿路上皮癌细胞(移行细胞癌)(T24)从埃及曼苏拉大学医学院医学实验研究中心(MERC)获得。对T-24进行MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四唑溴化物)比色法，以研究化合物的抗增殖活性。细胞以5–7 × 10³细胞/孔的密度接种。甲臜晶体用DMSO溶解，并使用微孔板读数仪测量570 nm处的吸光度。使用GraphPad Prism 8.0计算IC50(半最大抑制浓度)值。
通过实时PCR(qRT-PCR)对研究基因的mRNA定量
计算IC50值后，重复实验收集来自T24尿路上皮癌细胞系的未处理细胞、用Kim 111的IC50处理的细胞和用Kim 161的IC50处理的细胞的百万个细胞的三个重复。根据制造商的说明使用QIAzol试剂(Qiagen, Germany)提取总细胞RNA，相对基因表达水平按先前描述表示。qRT-PCR分析中使用的基因引物序列如表4所示。
统计分析
使用IBM-SPSS软件(IBM Corp. Released 2017. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 23.0. Armonk, NY: IBM Corp.)分析数据。使用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验比较三组研究组之间的数据。如果p值≤ 0.05，则认为结果具有统计学显著性。
结论
本研究证明了新型咪唑衍生物Kim-161和Kim-111作为尿路上皮癌(T24细胞)有希望的抗癌剂的潜力。通过体外和计算机方法的结合，这些化合物表现出显著的细胞毒性活性，通过上调BAX和Caspase 3诱导凋亡。分子对接和动力学模拟揭示了与关键靶点(PTK6、FLT3和BCL-2)的强结合亲和力，表明涉及激酶抑制和凋亡诱导的双重作用机制。此外，理化和药代动力学分析表明Kim-161和Kim-111具有良好的类药性质，使它们成为进一步临床前开发的可行候选物。未来研究应侧重于体内验证、结构优化和机制研究，以将这些化合物推进到膀胱癌治疗的临床应用中。
【全文结束】
