摘要
致癌性BRAF(V600E)突变可激活ERK1/2通路，在10%的人类结直肠癌（CRC）中存在，与预后不良相关。BRAF抑制剂单药治疗因固有耐药性仅表现出有限疗效。本研究在携带不同BRAF(V600E)等位基因数量的同基因RKO细胞及HCT-116细胞中评估CDK2/CDK9抑制剂fadraciclib与BRAF抑制剂恩科拉非尼的联合作用。研究发现fadraciclib通过抑制MCL-1和磷酸化MCL-1（Ser64）诱导Bax依赖性凋亡，并呈BRAF基因剂量依赖性抑制集落形成。该药物通过降低RNA聚合酶II磷酸化抑制转录，其与恩科拉非尼联用显示协同抗肿瘤效应。在斑马鱼移植模型中，联合治疗显著缩小肿瘤体积并激活caspase-3。TCGA数据分析表明CDK2过表达与BRAF突变相关，而CDK9过表达与患者生存期缩短相关。研究证实fadraciclib通过耗竭MCL-1增强凋亡敏感性，联合恩科拉非尼可协同抑制*BRAF(V600E)*突变CRC细胞生长。
引言
结直肠癌（CRC）是第三大常见癌症，其在50岁以下患者中发病率快速上升。携带*BRAF(V600E)*突变的CRC患者（占8-12%）具有MAPK通路持续激活、化疗耐药及总体生存期缩短等特点。本研究团队发现BRAF抑制剂单药治疗响应率仅0-5%，而联合恩科拉非尼与西妥昔单抗虽获批用于转移性CRC，但仅延长3个月生存期。通过高通量筛选发现CDK2和CDK9是潜在治疗靶点，fadraciclib作为高度选择性CDK2/CDK9抑制剂，可调控细胞周期、转录和DNA修复。
材料与方法
细胞模型与药物处理
使用RKO（BRAF(V600E)/V600E/WT）、A19（BRAF(V600E)/-/ -）、T29（BRAF WT/-/-）及HCT-116细胞系，通过免疫印迹、克隆形成实验、流式细胞术等技术评估药物作用机制。斑马鱼移植模型用于验证体内抗肿瘤效果，TCGA数据库分析CDK2/9表达与预后相关性。
结果
CDK2/9抑制诱导凋亡与细胞周期阻滞
fadraciclib单药或联合恩科拉非尼治疗可呈BRAF基因剂量依赖性诱导RKO细胞凋亡（图1B），抑制PARP和caspase-3裂解（图1C）。联合用药组的组合指数（CI<1）显示协同效应，且在*RKO+/+*细胞中效果最显著（图3B）。机制研究显示该药通过抑制RNA聚合酶II磷酸化（Ser2/Ser5）、降低p-Rb（Ser780）水平及激活p53诱导DNA损伤反应（图1D）。
MCL-1调控与协同作用机制
fadraciclib显著降低MCL-1及其磷酸化（Ser64），促进Bak释放和PARP裂解（图1E）。泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK可逆转caspase-3/7裂解及PARP降解（图1F）。在HCT-116*Bax-/-*细胞中，Bax缺失导致对药物显著耐药（图2A,D）。
体内验证与临床相关性
斑马鱼模型显示fadraciclib+恩科拉非尼组的肿瘤体积缩小47%（图6B），caspase-3激活率增加3.2倍（图6A）。TCGA数据分析表明BRAF突变CRC中CDK2高表达（p<0.001），而CDK9高表达与较差总生存期相关（图6D）。
讨论
本研究首次揭示fadraciclib通过双重抑制CDK2/9可有效克服*BRAF(V600E)*突变CRC的固有耐药性。其作用机制包括：
- MCL-1调控：通过抑制转录（CDK9）和磷酸化（CDK2）双重途径降低MCL-1稳定性
- 细胞周期阻滞：抑制p-Rb磷酸化导致G0/G1期阻滞（图5A）
- DNA损伤增强：pH2AX（Ser139）激活和p53介导的凋亡信号增强（图4C）
值得注意的是，fadraciclib的1μM有效浓度在体内可维持（参考文献78），且口服制剂已进入临床试验（参考文献79）。本研究结果为携带*BRAF(V600E)*突变的难治性CRC患者提供了新的治疗策略。
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