工程化外泌体递送KrasG12D特异性siRNA治疗胰腺癌：一项带有免疫相关性的I期临床研究

Engineered exosomes with KrasG12D specific siRNA in pancreatic cancer: a phase I study with immunological correlates | Nature Communications

致癌基因KRAS是胰腺导管腺癌(PDAC)发生和维持的关键遗传驱动因素之一。本研究表明，工程化外泌体递送KrasG12D特异性siRNA(iExoKrasG12D)在小鼠和恒河猴的临床前研究中显示出胰腺靶向分布且毒性可忽略。在iEXPLORE（iExoKrasG12D治疗胰腺癌）I期研究中，临床测试采用了非随机单臂经典3+3剂量递增设计（Ia期），随后是加速滴定设计（Ib期）(NCT03608631)。主要终点包括安全性、耐受性和靶点结合，次要终点旨在评估疾病控制情况。在多种治疗方案失败后，招募了晚期转移性疾病患者。iExoKrasG12D治疗耐受性良好：主要终点达成，iExoKrasG12D未显示剂量限制性毒性，即使在最高剂量下也未达到最大耐受剂量。在某些情况下，iExoKrasG12D治疗与疾病稳定反应相关（次要终点）。治疗后，观察到KRASG12D DNA下调和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制，同时肿瘤内CD8+ T细胞增加。iExoKrasG12D对CD8+ T细胞的募集作用提示了免疫检查点治疗的潜在疗效，并在临床前PDAC模型中进行了验证测试。iExoKrasG12D与抗CTLA-4抗体（而非抗PD1）的联合治疗通过FAS介导的CD8+ T细胞抗肿瘤活性展现出强大的临床前抗肿瘤效果。这项首次人体、精准医学临床试验及支持性的临床前功能研究为PDAC患者未来的机会性联合治疗提供了关于通过致癌性Kras抑制剂启动免疫治疗的新见解。

胰腺导管腺癌(PDAC)的诊断几乎总是致命的，中位生存期不到12个月，尽管已有联合化疗方案可用。PDAC中关键的驱动致癌事件是突变型KRAS，在>90%的肿瘤中都有发现，其中KRASG12D占PDAC病例中突变KRAS的一半。模拟PDAC的基因工程小鼠(GEM)研究表明，突变型Kras对PDAC的起始是必需的，以及突变型Kras对癌症维持和消退具有惊人的依赖性。在小鼠PDAC的晚期阶段，突变型Kras的基因消退可以消除肿瘤并使小鼠免于PDAC致死。研究团队最近报道了在PDAC GEM中，癌细胞表达FAS死亡受体以及FASL+CD8+ T细胞介导的抗肿瘤反应与Kras消退相关。具体而言，PDAC GEM中致癌Kras的抑制缓解了癌细胞上FAS死亡受体的表观遗传抑制，促进了CD8+ T细胞通过FASL-FAS介导的癌细胞清除。此外，使用等位基因特异性小分子抑制剂(MRTX1133)对KrasG12D的药理学抑制也在GEM和患者来源的类器官中启用了重新表达FAS的癌细胞的CD8+ T细胞靶向。MRTX113和CTLA-4抗体的联合治疗与对照组相比显示出显著的生存优势，支持致癌Kras靶向与免疫检查点阻断(ICB)治疗的协同抗肿瘤效果。研究团队和其他人还报道了致癌Kras在塑造PDAC的抑制性代谢和免疫肿瘤微环境中的作用，为免疫疗法提供了可能的协同机会假设。总体而言，这些研究为ICB在PDAC患者中失败的原因提供了见解——PDAC患者中观察到的ICB临床疗效不佳可能归因于内在和微环境障碍，需要特定的联合治疗来使PDAC对ICB的治疗影响敏感。克服ICB无效性的关键方面将包括持续和特异性抑制致癌Kras表达的策略，以产生与ICB同时发生的持久影响，同时避免脱靶的副作用。

考虑到靶向致癌Kras的众多挑战，研究团队设计了一种替代策略，使用外泌体作为siRNA递送载体。外泌体或小细胞外囊泡(sEVs)是天然产生的脂质双层囊泡，具有其起源细胞的拓扑结构，大小在40-200纳米之间。外泌体是全身循环的组成部分，已被证明可能在细胞间通信中发挥作用。所使用的siRNA序列先前已被报道靶向致癌Kras而非野生型Kras。这一努力的动机是观察到在小鼠中外源施用的外泌体在胰腺中积累，当含有KrasG12D siRNA有效载荷时，显著抑制Kras信号传导，导致具有KrasG12D突变的PDAC GEM生存期增加。研究团队将这些治疗性外泌体称为"iExoKrasG12D"。研究进一步证明，iExoKrasG12D在小鼠中的抗肿瘤功效依赖于外泌体生物学的多个方面，包括它们通过巨胞饮作用在表达致癌Kras的细胞中的优先摄取。研究还发现，iExoKrasG12D上的CD47"不要吃我"信号与合成颗粒相比具有更长的系统半衰期。研究团队报告了用于人体测试的iExoKrasG12D GMP生产的可行性，这导致了首次人体临床测试的批准。

在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中测试了iExoKrasG12D的安全性，并描述了在晚期PDAC中进行的iExoKrasG12D单药治疗I期试验的结果。研究设计了一项3+3临床试验，对标准治疗失败的转移性PDAC使用递增剂量的iExoKrasG12D（Ia期）。无剂量限制性毒性(DLT)信息指导了后续加速给药策略，再次未显示可测量的毒性（Ib期）。研究还报告了患者来源的活检研究，这些研究为iExoKrasG12D与免疫检查点阻断（特别是抗CTLA-4）的潜在协同组合提供了依据，以及随后验证这种协同方法的鼠类研究，用于II期试验设计。

研究结果表明，GMP级外泌体用于siRNA递送在临床前研究中显示无毒性。研究设计的靶向致癌Kras方法使用了从健康供体骨髓来源的基质细胞培养上清液中纯化的外泌体。纯化的外泌体经过电穿孔以掺入靶向KRASG12D的siRNA序列。在健康成年小鼠中评估了静脉内给药的iExoKrasG12D治疗三个周期，每个周期3剂，共6周内9剂。任何剂量水平均未显示体重变化，肝脏和肾脏重量保持不变。全面的化学和血液学分析显示无超出生理范围的变化。在NHP中也进行了类似评估，三只恒河猴在6周内接受了9剂GMP iExoKrasG12D。体重测量保持不变，器官重量、化学和血液学研究最小或不显著改变。肉眼检查无异常，详细的解剖病理学评估未发现病变或组织病理学变化。此外，研究还调查了外源施用的GMP iExoKrasG12D在恒河猴中的生物分布，结果显示iExoKrasG12D在胰腺和肝脏中积累。

在Ia/b期临床试验中，iExoKrasG12D耐受性良好，未报告与治疗相关的不良事件，最高耐受剂量未达到，从而显示出良好的安全性。测试的最高剂量水平为每剂量4.8毫克含有4.8毫克siRNA的iExoKrasG12D，6次连续剂量总计12周内28.8毫克iExoKrasG12D。

研究还发现，系统性iExoKrasG12D治疗显示靶点结合并重塑肿瘤免疫微环境。在I期试验中接受iExoKrasG12D治疗的患者中，几位患者的循环KRASG12D突变等位基因分数降低。在加速滴定Ib期试验中捕获的治疗前后的组织活检显示，治疗后样本中磷酸化ERK下调，伴随着PanCK+癌细胞数量减少，以及αSMA+基质细胞的稳定或相对增加。T细胞浸润分析显示，与治疗前相比，治疗后肿瘤内CD8+ T细胞、CD4+ Foxp3+ Tregs和CD4+ Foxp3− T细胞增加。这些结果突显了iExoKrasG12D在人类PDAC中的一致靶点结合，伴随着肿瘤免疫微环境的重塑。

研究进一步测试了iExoKrasG12D治疗与免疫检查点阻断联合使用以增强抗肿瘤反应的功效。结果表明，iExoKrasG12D与抗CTLA-4抗体（而非抗PD1）的联合治疗展现出强大的临床前抗肿瘤效果。研究发现，CD8+ T细胞对KrasG12D抑制介导的PDAC控制至关重要，而CD4+ T细胞/T regs的耗竭使KrasG12D抑制敏感。KrasG12D抑制后胰腺癌细胞中Fas的表达使它们能够与表达FasL的CD8+ T细胞相互作用并产生抗肿瘤反应。iExoKrasG12D治疗缓解了胰腺癌细胞中KrasG12D介导的Fas表观遗传抑制，使免疫肿瘤微环境能够通过CD8+ T细胞FASL-FAS介导的癌细胞清除产生抗肿瘤反应。

研究团队表明，iExoKrasG12D作为个性化医学在晚期PDAC患者中的安全性良好。据研究团队所知，这是首次在个性化医学环境中使用来自同种异体骨髓来源的间充质基质细胞的外泌体，这些外泌体被工程化以包裹siRNA治疗有效载荷的人体研究。在此，研究团队报告了iExoKrasG12D在小鼠、非人灵长类动物和PDAC患者中无不良事件或毒性。研究还证明了外源施用的外泌体在非人灵长类动物的肝脏和胰腺中的定位，以及iExoKrasG12D在人类PDAC中的靶点结合。

在此Ia/b期临床试验中增加系统性iExoKrasG12D的剂量未导致任何不良事件，最高耐受剂量未达到，表明iExoKrasG12D剂量可能进一步增加以在计划的II期研究中达到临床疗效。iExoKrasG12D的安全性使其适合与化疗和免疫疗法联合测试。

研究团队证明了在人类活检中iExoKrasG12D治疗后肿瘤内CD8+ T细胞的流入。数据不仅支持iExoKrasG12D的靶点结合，还支持临床和临床前研究中免疫TME的生物反应和重塑。iExoKrasG12D与抗CTLA-4联合治疗导致三级淋巴结构(TLS)的出现，这是对免疫检查点抑制剂治疗抗肿瘤反应的阳性预后标志。利用来自此临床试验的信息，临床前研究为iExoKrasG12D与伊匹单抗(ipilimumab)联合的II期试验设计提供了见解。

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