摘要
目的：本研究旨在探讨硒-L-蛋氨酸（SLM）通过上皮-间质转化（EMT）相关转录因子ZEB1和ZEB2对结肠直肠癌（CRC）细胞的治疗作用。
材料与方法：使用不同浓度SLM（15.6-250 nmol/L）处理人结肠癌细胞系Caco-2 24小时，通过MTT法评估细胞活力，Calcein-AM/碘化丙啶染色检测活死细胞比例及形态学变化，qRT-PCR分析ZEB1和ZEB2基因表达。
结果：SLM呈剂量依赖性降低细胞活力（IC50：31.25 nmol/L）。活死染色显示SLM处理组非活细胞显著增加，但未观察到典型凋亡形态学特征。qRT-PCR结果显示ZEB2显著下调，ZEB1表达略有减少。
结论：SLM表现出细胞毒性作用并调节EMT相关基因表达，提示其在CRC治疗中的潜在应用价值。
引言
结肠直肠癌是全球第三大癌症发病率和第二大癌症致死率的恶性肿瘤。尽管治疗手段不断进步，晚期患者的预后仍不理想，亟需创新疗法。EMT过程与肿瘤进展、转移和治疗耐药性相关，其关键转录因子ZEB1和ZEB2可抑制上皮基因并激活间质基因，促进EMT。ZEB1/2高表达与CRC患者预后不良和转移潜能增加相关。
材料与方法
实验材料
SLM购自Sigma Chemical，活死细胞检测试剂盒来自AAT Bioquest®。人结肠腺癌Caco-2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂环境中培养。
细胞活力检测
采用MTT法测定SLM对细胞活力的影响。将细胞接种于96孔板（1.5×10⁴细胞/孔），24小时后加入不同浓度SLM处理24小时。每孔加入MTT溶液（5mg/mL储备液10μL+培养基90μL），避光孵育2小时后，DMSO溶解甲臜结晶，酶标仪570nm读取OD值。
荧光活死染色
Caco-2细胞接种于6孔板（4×10⁵细胞/孔），24小时后用IC50浓度（31.25 nmol/L）SLM处理24小时。PBS洗涤后加入2μM Calcein-AM和4μM碘化丙啶避光孵育20-30分钟，荧光显微镜（FITC/Texas Red滤光片）观察并统计活（绿色）与死（红色）细胞比例。
qRT-PCR分析
使用miRNeasy试剂盒提取总RNA，NanoDrop测定浓度后，RT²第一链试剂盒合成cDNA。采用RT² SYBR Green qPCR Mastermix在Rotor Gene Q仪器上扩增，引物序列如下：
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 | 退火温度(℃) | 产物长度(bp) |
|---|---|---|---|---|
| GAPDH | GCACAAGAGGAAGAGAGAGACC | AGGGGAGATTCAGTGTGGTG | 56.7 | 78 |
| ZEB1 | TGAGTGCAGTCTTCTGAACCA | GAGGCTGATCATTGTTCTTGG | 52.4 | 76 |
| ZEB2 | CAAGAGGCGCAAACAAGCC | GGTTGGCAATACCGCATCC | 59.0 | 128 |
采用2⁻ΔΔCt法计算基因表达量，GAPDH作为内参。
结果
SLM的细胞毒性作用
MTT结果显示SLM对Caco-2细胞活力呈浓度依赖性抑制（图1）。在3.9和7.8 nmol/L浓度下，细胞活力分别增加至对照组的102.1%和108.5%（p<0.05），提示可能存在应激适应现象。15.6 nmol/L时活力降至87.6%（p<0.05），31.25 nmol/L时活力骤降至50.2%（p<0.0001），IC50值为31.25 nmol/L。
图1 SLM对Caco-2细胞活力的影响
图1. MTT法测定SLM对Caco-2细胞活力的影响。结果以对照组百分比表示，数据为三次实验均值±标准差。统计学显著性：p<0.05，**p<0.01，*p<0.001，**p<0.0001*
形态学观察
倒置显微镜观察显示31.25 nmol/L SLM处理组细胞形态无显著变化（图2）。与对照组相比，细胞结构包括胞浆和核形态均保持完整，未观察到明显的相衬变化。
活死染色分析
Calcein-AM/PI染色显示对照组细胞以绿色（活细胞）为主（84.7±5.2%），SLM处理组红色荧光细胞显著增加至40.7±7.8%（p<0.05）。部分处理细胞出现核固缩或膜不规则等特征，但未呈现广泛的典型凋亡形态学改变。
EMT相关基因表达
qRT-PCR分析表明SLM处理后ZEB2表达显著下调至对照组的0.45倍（p<0.05），而ZEB1表达略有减少但未达显著水平（图5）。
图5 SLM对Caco-2细胞EMT相关基因表达的影响
图5. qRT-PCR检测SLM处理后ZEB1和ZEB2表达。数据为三次实验均值±标准差。p<0.05；ns=无显著差异*
讨论
本研究首次系统性揭示SLM通过调控EMT相关基因抑制CRC细胞活力的机制。31.25 nmol/L SLM表现出显著的细胞毒性作用，且ZEB2表达下调提示其可能抑制EMT过程。虽然未观察到典型凋亡特征，但活死染色和MTT结果一致显示细胞活力显著降低。
与其他研究一致，SLM在15.6 nmol/L以上浓度表现出抗增殖效应。值得注意的是，低浓度（3.9-7.8 nmol/L）出现的促增殖效应可能反映细胞适应性应激机制，这为阐明SLM双重剂量效应提供了新线索。ZEB2作为EMT关键调控因子，其下调可能通过抑制细胞迁移和侵袭发挥抗癌作用。
研究局限性在于仅采用单一CRC细胞系，未来需验证其他细胞系（如HT-29、HCT116）的普适性。此外，需通过Western blot等验证ZEB2蛋白表达变化，并结合功能实验（如划痕实验、侵袭实验）确证EMT调控。
结论
本研究表明SLM可通过下调ZEB2显著抑制CRC细胞活力，为开发基于硒的靶向治疗策略提供了理论依据。未来研究需深入探索SLM在动物模型中的疗效及其与标准化疗药物的协同作用机制。
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