复合治疗中干扰素-α对乳腺癌患者血清血管内皮生长因子水平的抑制影响ИНГИБИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА НА УРОВЕНЬ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ – Oncology

研究发现，在89名乳腺癌患者的综合治疗方案中加入重组干扰素α-2b（IFN）可显著降低（p<0.05）36个月随访期内疾病进展的频率（根据区域淋巴结（RLN）转移程度N0-N2，降低36.4-27.2%）。乳腺癌患者血清中血管内皮生长因子（VEGF）的初始水平显著高于健康女性（50 ng/ml），范围在264.7±4.5-438.2±6.8 ng/ml之间。VEGF水平与区域淋巴结受累程度呈正相关（p<0.001）。放疗和手术后，患者血清VEGF水平显著升高（p<0.001）。按照开发的方案进行新辅助和辅助模式的长期IFN治疗，可显著降低（p<0.001）VEGF水平；而在对照组中，其水平在整个随访期内仍保持高位。回顾性分析显示，乳腺癌患者血清VEGF水平与其临床状况相关。

关键词：

血管生成、干扰素α-2b、综合治疗、淋巴转移、乳腺癌、血管内皮生长因子（VEGF）

有关肿瘤周围存在血管生成（AngG）激活的信息早在约100年前就已出现；1968年提出了一个假设，认为肿瘤产生一种扩散性"血管生成"物质；1971年J. Folkman提出假设，认为肿瘤生长和转移是血管生成依赖性过程，因此阻断血管生成可被视为抑制肿瘤生长的策略[1]。后来研究表明，细胞获得刺激血管生成的能力是其恶性转化的关键事件之一，只有在此条件下才能形成原发性恶性生长病灶[1,2]。目前这一概念已被用于恶性肿瘤治疗策略的制定及预防复发和转移；它促进了寻找促血管生成和抗血管生成分子及复合物的广泛研究。

目前，肿瘤学家关注研究众多启动或阻断血管生成的因子和信号。根据现代观点，肿瘤相关血管生成的主要调节因子，即肿瘤生长及其转移的促进因子，是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor—VEGF）[3]。干扰素（IFN）作为细胞因子家族中研究最深入且在肿瘤临床广泛应用的代表，具有多效性作用，近年来因其抗血管生成活性而被视为最重要的天然抗肿瘤和抗转移保护成分之一。IFN的这一特性基于其直接抑制VEGF基因转录和该因子及其他促血管生成因子的产生，抑制基质金属蛋白酶和IL-8的产生。IFN的抗血管生成作用在治疗人神经系统和内分泌系统的高血管化肿瘤以及血管瘤时表现尤为明显：已知通过12个月皮下注射IFN-α单药治疗可完全治愈累及皮肤、肝脏和心脏的严重血管瘤病。与经典血管生成抑制剂—血管抑素和内皮抑素相比，IFN-α是更有效的抑制剂；研究表明，它能引起内皮细胞的凋亡性死亡和肿瘤血管毛细血管的破坏，特别是脑肿瘤，导致其体积急剧减少。联合应用每日注射小剂量IFN和抗血管生成因子吉西他滨尤其有效—这两种药物的联合使用抑制了转移并使植入无胸腺小鼠的胰腺癌质量减少了近90%[4]。在我们的研究中，IFN在卡波西肉瘤治疗中不仅表现为抗肿瘤因子，更表现为抗血管生成因子[5]。重要的是，IFN不仅抑制肿瘤中的血管生成，还能抑制周围肿瘤的健康组织中血管生成因子的产生和新生血管形成。

通过电穿孔将IFN基因引入肿瘤细胞的最近实验获得了IFN在确保机体整个抗肿瘤反应谱（包括抗血管生成）方面作用的直接证据。该程序导致一半动物的肿瘤完全消退。随后的基因分析显示，这种效应是由肿瘤中特异性抑制血管生成和肿瘤生长、增加其他肿瘤抑制基因表达并导致肿瘤细胞死亡的细胞基因激活所决定的[6]。本研究的目的是研究不同治疗方案下乳腺癌（BC）患者血清中VEGF的积累特征，以及IFN纳入综合治疗方案时对VEGF水平的影响。

研究对象与方法

研究纳入89名T1-2N0-2M0期乳腺癌患者，术前接受大分割远距离伽马射线治疗（TGT）（肿瘤剂量30 Gy），并在放疗结束24-48小时后进行根治性手术。辅助治疗阶段，所有患者均接受AC或CMF方案的化疗。所有患者分为2组：对照组（I）和实验组（II），每组根据区域淋巴结（RLN）受累程度分为3个亚组：无淋巴结转移定义为N0，1-3个淋巴结受累定义为N1，4-9个淋巴结受累定义为N2。研究过程中还考虑了原发肿瘤的大小及其组织学结构特点。两组患者根据疾病分期、肿瘤组织学结构和治疗特点（化疗、放疗、激素治疗）进行随机化。实验组患者的上述传统治疗方案辅以IFN治疗课程（本研究使用重组α-2b IFN制剂）。细胞因子在照射前30分钟瘤周注射，剂量为600万国际单位（IU），连续5天；术后第5-6天，IFN以1200-1500万IU剂量通过引流管注入伤口；通过肌肉注射使IFN总剂量达到3000万IU。后续IFN治疗课程与化疗同时进行，肌肉注射IFN，剂量为300万IU，每天一次，持续10天（1个疗程）；疗程间歇期为20天。整个治疗期间IFN总剂量为1.8-2.4亿IU。

在开始治疗前、放疗结束、术后第14天以及整个治疗过程（6-7个月）中收集肿瘤患者的血清，并在使用前保存在-20°C。对照为临床健康女性的血清。采用免疫酶法测定血清中VEGF水平。测定方案的主要成分是多克隆抗体与纯化肿瘤血管生成因子的过氧化物酶结合物，使用周期酸盐方法制备。通过使用与纯化VEGF在相同条件下滴定获得的校准曲线确定ng/ml单位的VEGF浓度[12]。

通过观察36个月患者疾病进展频率和相关死亡率来评估IFN应用的有效性。

采用Student's t检验和相关系数进行统计分析。

结果与讨论

研究发现，在乳腺癌患者综合治疗方案中加入重组α-2b IFN可显著降低疾病进展频率（36个月随访期内降低36.4-27.2%）。IFN的有效性在很大程度上取决于RLN的转移性受累程度。从所展示数据（表）可以看出，应用IFN可防止所有N0患者的肿瘤复发和转移过程，在N1-2患者中显著抑制该过程。IFN应用有效性的相关系数为0.90。

表

IFN对不同区域淋巴结受累程度（N0, N1, N2）乳腺癌患者综合治疗效果的影响，3年随访

对乳腺癌患者血清VEGF含量的监测显示，初始（治疗前）水平显著（p<0.00001）高于健康女性。VEGF水平与肿瘤过程对RLN的扩散程度直接相关—受累淋巴结数量的增加伴随着VEGF积累的显著（p<0.001）增加（图1）。比较分析未发现肿瘤大小、其组织学结构与VEGF水平之间的关联。

图1. 乳腺癌患者血清VEGF水平与区域淋巴结转移程度的关系

对治疗过程中患者血清VEGF水平动态的研究（图2）显示，在第6天（放疗结束后）实验组患者的这一指标显著（p<0.05）降低。随后（放疗开始后第20天和术后第14天），对照组患者的VEGF水平急剧升高。这种升高的程度并不直接取决于RLN受累程度，但N1-2期患者的VEGF水平比N0期患者高42-49%（见图2）。这种VEGF水平的升高最可能由对手术干预的生理反应引起。这种升高对N1-2期患者的影响可能极为负面，因为VEGF水平与疾病扩散程度明确相关[7]。IFN的应用防止了VEGF的急剧升高：对照组中VEGF水平平均升高35.2±4.8%，而实验组仅升高8.2±2.4%（p<0.01），即低4倍。随后（60-180天）观察到VEGF"术后"水平的逐渐降低，这种降低的特征明显取决于RLN的转移性受累程度（见图2）。N0期时，对照组VEGF水平降至初始水平，实验组则比初始水平低22.6%（p<0.01）。N1-2期时，对照组患者的VEGF水平未降至初始水平；而在实验组中，VEGF含量在第60天已降至初始水平，并持续至IFN治疗结束。在治疗的最后阶段（第180天），N1-2期对照组患者的VEGF水平显著高于（p<0.001）接受IFN治疗的相应亚组患者。值得注意的是，无论RLN是否受累，实验组患者的血清VEGF水平均降至比治疗前低20-29%（p<0.01）。

图2. 乳腺癌患者治疗过程中血清VEGF水平变化的动态

因此，研究表明，在乳腺癌综合治疗方案中加入IFN可显著降低患者血清VEGF水平，这证明了该细胞因子的抗血管生成作用。统计处理材料使我们有90%的把握断言，VEGF水平指标与所进行治疗的有效性相关。

将乳腺癌患者综合治疗过程中血清VEGF水平的监测结果与临床治疗效果进行比较时，应指出它们与我们先前发现宫颈癌患者血清VEGF水平与肿瘤过程扩散程度相关的研究结果明显一致[7]。

本研究中未发现血清VEGF水平与肿瘤大小或其组织学类型之间的关联，但发现了VEGF水平与RLN受累程度之间的明确关联。考虑到RLN在肿瘤过程中的受累程度具有重要的预后价值，以及乳腺癌腋窝收集器肿瘤受累诊断存在某些问题[8]，可以得出结论：确定乳腺癌患者VEGF水平很重要，这可以作为腋窝收集器受累的附加指标，并为改变治疗策略提供依据。

我们发现的RLN受累程度与VEGF水平之间的关联也可能表明后者对评估淋巴转移本身的信息价值。值得注意的是，近年来对肿瘤淋巴毛细血管网络中肿瘤过程扩散的关注增加，因此对肿瘤淋巴管生成的关注也增加[9-11]。目前，肿瘤和邻近组织中淋巴网络的密度已被明确证实是疾病扩散和RLN受累的重要预后因素。近年来的发现[9-13]使我们能够识别出确保肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的具体配体和受体（VEGF-C/D和VEGF-R3受体），并分离出纯的淋巴内皮细胞群，识别出在肿瘤中区分淋巴毛细血管与血管的标志物（lymphatic vessel hyaluronan receptor-1—LYVE-1；PROX-1和podoplanin）[14]。近年来，淋巴管生成作为抗肿瘤和抗转移治疗靶点的问题日益受到关注[9,15]。实验研究表明，抑制VEGF-C/VEGF-R3复合物的活性可显著抑制淋巴管生成和淋巴转移[15-18]。

我们认为IFN在乳腺癌患者治疗中的有效性也与其作为淋巴管生成抑制剂的活性相关。这种观点除了上述内容外，还得到了显示IFN抑制淋巴毛细血管内皮细胞的增殖和迁移并引起其凋亡性死亡的研究结果的支持[19]。此外，IFN抑制所有VEGF亚型及其受体的表达[20-22]。IFN对肿瘤淋巴管生成的高活性的另一个证据是众多关于IFN治疗各种严重淋巴管瘤病形式有效的临床观察—即使在单药治疗IFN的情况下也能实现完全治愈[23-25]。

我们认为，治疗结果的提高还与应用新辅助瘤周注射IFN有关。这种方法使IFN能够直接作用于肿瘤细胞，抑制其增殖和移动性，抑制其中的缺氧诱导因子和血管生成因子表达[26]，提高其对放疗的敏感性，增强其表面多种抗原的表达，改善免疫识别等。以这种方式应用IFN时，当然仍保持其系统作用，确保激活机体多种特异性和非特异性抗肿瘤反应。然而，首先，所用方法产生了抗转移效果，其机制我们认为在于IFN对肿瘤微环境的局部作用。这种作用的特点是多方面的：首先是强烈抑制肿瘤相关巨噬细胞产生蛋白酶和内皮生长因子，尤其是淋巴趋向性VEGF-C[22,26-28]。瘤周注射IFN以及术后伤口用IFN冲洗，可通过淋巴毛细血管网络防止肿瘤的淋巴扩散：直接作用于淋巴毛细血管和RLN中的肿瘤细胞，抑制术后血管生成，特别是淋巴管生成。文献中有一些报告表明，肿瘤的放射照射可能增强转移[29,30]，因此与放疗同时局部应用IFN可防止其可能的负面后果。

关于手术后患者血清VEGF水平显著升高的数据值得单独讨论。这种升高可能是由于术后炎症和组织再生而产生的正常生理反应。然而，当存在肿瘤过程（以"休眠"转移形式）时，这种反应极为不利。一段时间内，关于手术切除原发肿瘤后转移激活现象可能机制的讨论持续进行，这一现象在实验模型和临床实践中均有观察。目前大量关于细胞因子生理学的信息使我们得出结论，正是血管生成因子（可能是整个谱系）参与了转移激活过程。它们既可以作为刺激肿瘤细胞增殖的阳性生长因子发挥作用，也可以作为纯粹的血管生成和淋巴管生成因子，刺激毛细血管生长，为转移灶中增加的代谢提供支持。最近关于转移这些方面的研究表明，在手术切除原发肿瘤后，微转移中的血管生成和代谢受到刺激，以及其中凋亡与增殖的平衡向后者的偏移[31-33]。我们在新辅助和辅助治疗阶段按照本工作中描述的方案应用IFN，成功消除了手术干预在增强转移方面的许多负面后果。此前，我们已在实验中首次证明了IFN的这一效果[34]。

上述事实证明，监测肿瘤患者血液中血管生成因子的水平以及将抗血管生成治疗作为乳腺癌患者综合治疗的必要组成部分具有重要意义。

结论

1. 在新辅助和辅助治疗阶段将IFN纳入乳腺癌患者综合治疗方案，可显著降低36个月内疾病进展频率（27.2-36.4%）；IFN治疗效果取决于RLN受累程度（N0-N2）。
2. 乳腺癌患者血清VEGF初始水平显著（p<0.00001）高于健康女性，与RLN转移程度直接相关，但与肿瘤大小和组织学类型无关。
3. 手术干预伴随着对照组（未接受IFN）乳腺癌患者血清VEGF水平的显著（p<0.001）升高。
4. 新辅助治疗阶段应用IFN降低了乳腺癌患者放疗过程中的血清VEGF水平，并防止了其术后升高。
5. 辅助治疗阶段长期（6-7个月）应用IFN可使乳腺癌患者血清VEGF水平持续显著降低，而对照组中VEGF水平在整个观察期内仍保持高位。
6. 接受IFN治疗的患者血清VEGF水平降低与其临床状况相关。

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