作者概述了与仿制药申请（ANDA）相关的强制降解研究应考虑的科学方面。
强制降解等同于应力测试和有意降解。有意降解可作为预测原料药或制剂稳定性的有用工具，影响纯度、效价和安全性。了解原料药在各种应力条件下的杂质谱和行为至关重要。在质量源于设计（QbD）理念下，强制降解还在分析方法开发、质量标准制定和制剂设计中发挥重要作用。应力测试的性质取决于特定的原料药和所涉及的制剂类型（例如，口服固体剂型、冻干粉和液体制剂）(1)。
国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q1B指南为光稳定性应力测试提供了指导；然而，ICH稳定性或验证指南中未提供其他应力研究建议(2)。关于氧化和水解研究的细节信息也较为有限。《药物原料与辅料分析谱》中的原料药专论提供了不同原料药在各种应力条件下的部分信息(3)。
仿制药申请（ANDA）申报中提供的强制降解信息通常不完整，在此类情况下会引用缺陷项。化学、制造和控制（CMC）部分中常见缺陷的概述已有发表(4–6)。与强制降解研究相关的常见缺陷示例包括：
- 您的原料药在任何应力条件下均未显示降解。请重复应力研究以获得充分降解。若无法实现降解，请提供理由说明。
- 请注意，您用于应力研究的条件过于严苛，导致大部分原料药已降解。请使用更温和的条件或缩短暴露时间重复应力研究，以生成相关降解产物。
- 需注意，您已根据含量测定方法条件分析了应力样品。为使有关物质方法具有稳定性指示性，应力样品应使用有关物质方法条件进行分析。
- 请说明您已采取哪些措施确保分析方法能捕获未应力和应力样品中的所有杂质（包括降解产物）。
- 请提供清单，汇总应力样品中降解产物（已知和未知）的含量。
- 请核实软件对峰纯度测定的峰高要求。
- 请解释应力样品的质量不平衡现象。
- 请识别因药物-辅料相互作用形成的降解产物。
- 您的光稳定性研究显示该制剂对光极为敏感。请说明这如何反映在分析方法、生产工艺、产品处理等方面。
为尽量减少ANDA申报中的缺陷，本文提供了一些通用建议：如何开展强制降解研究、在申报中报告相关信息，以及如何利用强制降解知识开发具有稳定性指示性的分析方法、优化生产工艺、产品处理和储存方案。
应力条件
典型应力测试包括四种主要降解机制：热降解、水解降解、氧化降解和光解降解。选择合适的试剂（如酸、碱或氧化剂的浓度）并调整条件（例如温度）和暴露时长，可达到理想的降解水平。过度应力可能导致形成在正式货架期稳定性研究中不会出现的次级降解物，而应力不足则无法实现应力测试目的。因此，需将降解控制在目标水平。已有研究提出通用应力测试方法，以实现可预测长期和加速储存条件的有意降解(7)。通常建议的降解范围在5%-20%之间(7–10)。此范围覆盖小分子药品制剂通常允许的10%降解限度（稳定性限度为标签声称含量的90%-110%）。尽管文献中提到更宽的推荐范围（例如10%-30%），但更极端的应力条件常产生受次级降解物干扰的数据。
光稳定性。光稳定性测试应作为应力测试的组成部分，尤其是对光敏性化合物。ICH Q1B《新原料药和制剂光稳定性测试》中描述了部分推荐测试条件(2)。原料药样品及固/液体制剂样品应暴露于至少120万勒克斯·小时和200瓦·小时/平方米的光照下。同一样品需同时暴露于白光和紫外光下。为减少暴露期间温度变化的影响，可能需要温度控制。光照暴露样品应分析物理特性变化（如外观、澄清度、溶液颜色）以及含量和降解物。ICH Q1B中的决策树可用于确定制剂的光稳定性测试条件。产品标签应反映适当的储存条件。还需注意，仿制药产品的标签应与参比制剂（RLD）及《美国药典》（USP）专论建议保持一致（如适用）。
热应力。热应力测试（例如干热和湿热）应比推荐的ICH Q1A加速测试条件更严格。固态原料药和制剂样品应暴露于干热和湿热环境，而液体制剂可仅暴露于干热。建议以10°C为增量研究温度影响（高于常规加速测试温度），湿度控制在75%相对湿度或更高(1)。可在更短时间使用更高温度进行测试(10)。多时间点测试可提供降解速率及初级与次级降解产物的信息。若应力条件因药物分子稳定性而产生极少或无降解，应在终止应力研究前确保所施应力已超过加速条件（40°C放置6个月）的能量水平。
酸碱水解。酸碱水解应力测试可在室温或升温条件下对溶液中的原料药和制剂进行。酸或碱的类型和浓度选择取决于原料药的稳定性。生成相关应力样品的水解策略是将原料药溶液置于不同pH值（例如2、7、10–12）下室温放置两周或直至降解达15%上限(7)。建议使用0.1 M至1 M盐酸或硫酸进行酸水解，0.1 M至1 M氢氧化钠或氢氧化钾进行碱水解(10)。对于亲脂性药物，可使用惰性共溶剂溶解原料药。选择共溶剂时需注意药物分子中的功能基团。化合物的先验知识有助于选择应力条件。例如，若化合物含酯键且极易发生碱水解，可使用低浓度碱。在不同时间点分析样品可监测降解进程，并区分初级与次级降解物。
氧化。氧化降解可能较为复杂。尽管过氧化氢因能模拟辅料中可能存在的过氧化物而被广泛使用，但其他氧化剂如金属离子、氧气和自由基引发剂（例如偶氮二异丁腈AIBN）也可选用。氧化剂的选择、浓度及条件取决于原料药。原料药溶液及固/液体制剂可进行氧化降解测试。据报道，在中性pH和室温下将溶液暴露于0.1%-3%过氧化氢中七天或直至降解达20%上限，可能生成相关降解产物(10)。可在不同时间间隔分析样品以确定目标降解水平。
不同应力条件可能生成相同或不同的降解物。降解类型和程度取决于药物分子的功能基团及应力条件。
分析方法
稳定性指示性含量测定的首选分析方法是反相高效液相色谱法（HPLC）。反相HPLC因兼容水溶液和有机溶液、高精密度、高灵敏度及检测极性化合物的能力而被优先选用。通过选择合适的色谱柱类型、柱温及调整流动相pH值可实现峰分离。 poorly-retained（保留差）的高极性杂质应与溶剂前沿分离。作为方法开发的一部分，可采用梯度洗脱法（流动相组成从极低有机相比例至高有机相比例变化）捕获早期洗脱的高极性化合物和高度保留的非极性化合物。应力样品也可用梯度法筛查以评估潜在洗脱模式。样品溶剂和流动相应选择为与原料药、潜在杂质及降解物相容。应力样品制备应尽可能模拟分析程序中规定的样品制备步骤。酸碱水解样品可能需要中和或稀释。应力样品的色谱图应与相关空白（不含活性成分）和未应力样品进行比较，以确定峰的来源。空白峰应排除在计算外。应在每种应力条件下提供杂质（已知和未知）含量，并附上空白、未应力及应力样品的色谱图（全量程及显示所有峰的放大图）。此外，手性药物应采用手性方法分析，以确定立体化学纯度和稳定性(11, 12)。
所选分析方法应足够灵敏以检测低水平杂质（即目标分析物的0.05%或更低），且峰响应应在检测器线性范围内。分析方法应能捕获正式稳定性研究中形成的所有杂质，达到或低于ICH阈值限度(13, 14)。降解产物的鉴定和表征应依据ICH要求，基于正式稳定性结果进行。传统方法（例如柱色谱）或联用技术（例如LC–MS、LC–NMR）可用于降解产物的鉴定和表征。使用这些技术可更深入了解杂质结构，有助于识别潜在的基因毒性结构警示并制定更严格的杂质控制限度(12–17)。需注意，对于在正式货架期稳定性研究中形成且超过鉴定阈值限度的杂质，必须进行结构表征(13)。
可使用多种检测类型（例如紫外和质谱）分析应力样品。检测器应具备三维数据功能（如二极管阵列检测器或质谱仪），以检测光谱非均一性。二极管阵列检测还可检查分析物峰和杂质或降解物峰在多波长下的峰形。当紫外光谱相似且系统噪声较高时，二极管阵列的局限性显现，可能掩盖共洗脱杂质或降解物。具有相似分子量和功能基团的化合物（如非对映异构体）可能表现出相似的紫外光谱。此时必须尝试修改色谱参数以实现必要分离。应选择最佳波长以检测和定量所有潜在杂质和降解物。若分析物与杂质或降解物峰的紫外光谱无重叠，可能需要使用多个波长。方法开发中的有效工具是叠加不同波长的分离信号以发现峰形差异。
峰纯度分析。峰纯度用于辅助开发具有稳定性指示性的方法。当存在共洗脱化合物时，化合物的光谱独特性可用于建立峰纯度。
应使用二极管阵列检测器的光谱信息建立未应力和应力样品中目标峰的峰纯度或峰均一性。当使用仪器软件确定峰的光谱纯度时，相关参数应按制造商指南设置。需注意建立光谱纯度的峰高要求。紫外检测在高吸光度值时呈非线性。应设置阈值以检测共洗脱峰。还应选择最佳参考光谱位置。应确认软件能否自动校正梯度分离中连续变化的溶剂背景。
建立峰纯度并非峰纯净且无共洗脱的绝对证据。当共洗脱峰光谱相似、低于检测限、无发色团或完全未分离时，峰纯度存在局限性。
质量平衡。质量平衡虽非在所有情况下均可实现，但用于验证稳定性指示方法的充分性。通过将含量值与杂质和降解物含量相加，评估其与初始值（未应力含量值）接近100%的程度，并考虑分析误差范围(1)。
应对所有应力样品尝试建立质量平衡。应探究质量不平衡现象并提供解释。由于紫外吸收差异导致的分析物与杂质峰响应差异，可通过外标法进行检验。应考察潜在挥发性杂质损失、非紫外吸收化合物形成、早期洗脱物产生及化合物在色谱柱中滞留等因素。可采用替代检测技术（如示差折光检测LC/MS）来量化非紫外吸收降解物。
终止研究
在确保应力条件充分暴露后，可终止应力测试。原料药分子的典型活化能范围为12–24 kcal/mol(18)。化合物未必在每种应力条件下均发生降解，相关暴露限度的通用指南已在综述文章中引用(10)。对于某些在所有应力条件下均不显示降解的稳定药物，可通过向原料药或安慰剂中添加已知杂质并建立充分分离，来验证分析方法的专属性。
其他考量
对于采用药典方法且在USP <621>规定限度内使用的原料药和制剂，可能无需进行应力测试。若仿制药产品使用与参比制剂（RLD）不同的多晶型，原料药应接受应力测试以评估多晶型的物理化学变化，因为不同多晶型可能表现出不同的稳定性特征。
质量源于设计理念中的强制降解
为满足关键质量属性（CQA）的预设目标而系统制造优质药品的过程，需要利用强制降解研究中获得的知识。
在质量源于设计（QbD）理念中，设计良好的强制降解研究对分析方法开发至关重要。它有助于建立稳定性指示方法的专属性，并预测正式稳定性研究中可能形成的潜在降解产物。将所有潜在杂质纳入分析方法并建立目标峰的峰纯度，有助于避免不必要的方法重新开发和再验证。
了解原料药在各种应力条件下的化学行为，还可为制剂开发中的辅料选择提供有用信息。辅料相容性是理解产品开发过程中潜在制剂相互作用的组成部分，也是产品认知的关键环节。通过分别对原料药、制剂和安慰剂样品进行应力处理并比较杂质谱，可考察因药物-辅料相互作用或复方制剂中药物-药物相互作用导致的降解产物。关于药物相关峰和非药物相关峰的信息可用于选择和开发更稳定的制剂。例如，若原料药易氧化，可考虑在制剂中添加抗氧化剂。对于在酸性介质中易水解或发生立体化学转化的原料药，可能需要缓释制剂。酸碱水解测试还可为液体或混悬型制剂的配方提供有益见解。
强制降解研究中获得的知识可促进生产工艺的改进。若光稳定性研究显示原料药具有光敏性，则在制剂生产过程中应谨慎操作。通过原料药和制剂的热应力测试，可获取有关工艺开发（例如湿法与干法加工、温度选择）的有用信息。
此外，对降解产物和机制的科学理解加深，有助于确定可能导致稳定性失败的因素（如环境温度、湿度和光照），从而适当选择包装材料以抵御这些因素。
结论
设计恰当的应力研究与制药行业当前推广的质量源于设计（QbD）方法高度契合。设计良好的应力研究可在深入制剂开发研究前，为拟定产品选择合适配方提供见解。对降解的全面认知（包括潜在降解途径的机理理解）是分析方法开发QbD方法的基础，对设定货架期监测的可接受标准至关重要。应力测试可为选择物理形态、原料药立体化学稳定性、包装和储存条件提供有益见解。由于仿制药在配方上与参比制剂（RLD）存在允许的定性和定量差异，以及生产工艺、加工参数和包装材料的选择，对仿制药进行应力测试尤为重要。
致谢
作者谨感谢Bob Iser、Naiqi Ya、Dave Skanchy、Bing Wu和Ashley Jung提供的科学意见和支持。
Ragine Maheswaran博士 是美国食品药品监督管理局（FDA）药品评价与研究中心下属药品科学办公室仿制药办公室的CMC审评员，Ragine.Maheswaran@fda.hhs.gov
免责声明：本文观点仅代表作者个人，不一定反映美国食品药品监督管理局的观点或政策。
参考文献
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