替代RNA剪接是基因表达中的关键基础过程，通过该过程前体mRNA被转化为成熟的mRNA，进而翻译成蛋白质。替代RNA剪接的失调在多种人类疾病中广泛存在，包括神经退行性疾病、自身免疫疾病、病毒复制和癌症。值得注意的是，癌症通常表现出显著的替代RNA剪接失调，这促进了疾病进展。在过去的几十年中，基因组DNA和RNA测序技术的进步揭示了RNA剪接在癌症中病理性中断的多种机制。这些机制包括肿瘤抑制基因调控序列的突变、编码核心剪接体蛋白和调控组分基因的反复体细胞突变，以及特定RNA剪接因子表达的肿瘤特异性变化。在潜在的治疗靶点中，Cdc2样激酶（CLKs）由于其在调控替代RNA剪接中的关键作用，已成为有前景的靶点。
CLK家族属于62种激酶的CMGC组，包括周期蛋白依赖性激酶、丝裂原活化蛋白激酶、糖原合成酶激酶、丝氨酸-精氨酸蛋白激酶（SRPKs）和双特异性酪氨酸调节激酶（DYRKs）。在这些激酶中，CLKs与DYRK家族在生物学功能、蛋白质序列同一性和相似性方面关系密切。CLK家族包含四个同源成员CLK1、CLK2、CLK3和CLK4，这些双特异性蛋白激酶在真核生物中进化保守。CLKs磷酸化富含丝氨酸和精氨酸（SR）的蛋白，也称为SR剪接因子（SRSF1-12），触发SR蛋白从核斑点重新定位到剪接体，促进剪接体分子机制中的外显子识别。
过去十年中，描述CLKs作为治疗靶点的出版物显著增加，同时发现了新的CLK抑制剂，如TG-003、CC-671和SM08502。本研究团队此前已引入了一系列小分子化合物，命名为Cpd-1至-3、T3和T-025。这些化合物具有不同的化学结构，对SRPK和DYRK家族展现出不同的激酶选择性。重要的是，对这些化合物进行的一系列体外和体内实验证实了CLK抑制对靶向癌症治疗的治疗影响。基于这些认识，研究团队以T-025为化学起点，致力于开发临床药物候选物。
在之前的研究中，T-025被确定为一种通过针对CLK2效力的化学探索而发现的强效CLK抑制剂，IC50值为1.0 nM。该化合物具有U形化学结构，包含基于吡唑并嘧啶的铰链结合基团和独特的喹啉部分。X射线共晶结构分析揭示了T-025与CLK2蛋白之间的几个关键相互作用：与CLK2铰链区域的Glu244、Leu245和Leu246氨基酸残基形成三个分子间氢键；喹啉部分与Lys193形成分子间氢键；以及嘧啶部分在疏水口袋中的适当空间占据（PDB代码：5UNP）。
除了T-025的化学类型系列表现出不利的ADME-Tox特征（如低代谢稳定性、CYP抑制和次优药代动力学）外，研究团队还采用了基于结构的药物发现（SBDD）方法，从T-025进行骨架跃迁，生成替代化学类型。如图1B和1C所示，概念设计旨在用多功能的[6,5]元杂环作为新骨架替代喹啉环。这个新骨架需要满足两个要求：(1) 它应具有能与Lys193形成极性相互作用的N原子；(2) 它应提供访问疏水口袋的新轨迹。基于这些标准，设计了3H-咪唑并[4,5-b]吡啶和1H-咪唑并[4,5-b]吡啶两种新骨架，选择依据是它们的化学可行性和亲脂性。随后，将这些骨架连接到简化的吡咯并嘧啶铰链结合基团和亚甲基连接的间氟苯基单元上（取代T-025中的嘧啶）。这两种修饰根据T-025系列的构效关系（SAR）被认为是可接受的。
化合物2和3对体外酶促CLK2抑制、HCT-116人结肠癌细胞生长抑制、实验logD值和pH 6.8下的溶解度进行了评估。两种化合物均表现出CLK2抑制活性，IC50值分别为1.6 nM（化合物2）和0.4 nM（化合物3）。特别是具有1H-咪唑并[4,5-b]吡啶骨架的化合物3，由于其与原始化合物T-025相当或更优的特性，被视为有希望的起点。因此，化合物3被选为后续化学优化的先导化合物。
接下来，研究了各种铰链结合基团以扩展化学空间。主要焦点是修饰吡咯并嘧啶3中的NH基团，该基团充当氢键供体。这种氢键可以通过与铰链区域的极性相互作用增强CLK2效力。然而，初步数据显示它也可能带来不利的ADME-Tox特征，这在基于吡咯并嘧啶的激酶药物发现中普遍存在。因此，最初设计了7位分别安装OMe、NH和Cl基团的N原子交换吡咯并嘧啶4-6。这些取代基于T-025的SAR指导，效力顺序与SAR一致[OMe > NH > Cl (>H)]。因此，OMe被选为该位置的最佳取代基。铰链结合基团的进一步探索突显了非NH型铰链结合基团的多功能性，如化合物7-9所示。这些化合物表现出非常强的酶促CLK2和细胞生长抑制活性，其中化合物9显示出显著的效力：酶促CLK2 IC50为0.24 nM，HCT-116生长IC50为4.2 nM。
作为先导优化的最后一步，研究团队修饰了间氟苯基环。此时，化合物9是一种略微疏水的分子，logD值为2.78，在小鼠肝微粒体（MLM）中的清除率：15.3%/min/mg蛋白。因此，设计了各种杂芳环以降低这些化合物的亲脂性。合成了含有嘧啶（10）、吡唑（11和12）、噁唑（13和14）和噁二唑（15）的化合物，它们均表现出适中的效力和降低的logD值。值得注意的是，与母体化合物9相比，这些化合物的溶解度大大提高。此外，小鼠代谢稳定性得到增强，MLM清除率：1.9-3.3%/min/mg蛋白。然而，这些化合物表现出CL > 1000 mL/h/kg，因此在使用ICR小鼠进行的小鼠组合药代动力学评估中，系统暴露AUC最多为306.9 ng*h/mL。
通过平行和广泛的每个杂芳环的化学修饰，研究团队确定取代的噁二唑是增强体外小鼠代谢稳定性和改善小鼠药代动力学特征的有希望候选物。化合物16（母体化合物15的乙基衍生物）效力降低，CLK2 IC50为10 nM。然而，进一步的衍生物化，特别是氟原子的引入，成功恢复了效力并改善了代谢稳定性。值得注意的是，二氟甲基衍生物17表现出显著的10倍效力提升，CLK2 IC50为0.56 nM，同时降低了MLM清除率（0.3%/min/mg蛋白）和体内清除值（CL 995 mL/h/kg）与母体化合物15相比。随后，合成了化合物18和外消旋体19作为母体乙基化合物16的氟化衍生物。这一努力导致发现了化合物18，其特点是效力、理化特性、小鼠代谢稳定性和小鼠药代动力学特征的平衡。值得注意的是，单氟乙基衍生物外消旋体19也表现出与化合物18相当的优异体外特性，并显示出更好的溶解度。研究团队进一步对外消旋体19进行了手性分离，得到两个对映体(R)-19和(S)-19，通过(R)-19的单晶X射线晶体结构分析确认了它们的立体化学。有趣的是，这两个对映体在效力、ADME-Tox和体内小鼠研究方面没有显著差异。尽管两种化合物都有资格入选，(R)-19在体外HCT116细胞生长抑制方面表现出轻微优势，并在小鼠中表现出更好的系统暴露。因此，(R)-19（CTX-712）被选为后续开发的候选物。
CTX-712的详细特性如表5所示。通过测量每种蛋白的酶抑制，确定了CTX-712在CLK和DYRK家族内的激酶抑制特征。数据显示，CTX-712是一种强效CLK抑制剂，对CLK2和CLK1表现出最大效力（CLK1、2、3和4的IC50值分别为0.69、0.46、3.4和8.1 nM），同时抑制DYRK家族（DYRK1A和1B的IC50值分别为1.1和1.3 nM）。在Eurofins Discovery对468种激酶的单浓度（100 nM）测试中，只有10种激酶（包括主要靶点CLK1-4和DYRK1A和1B）表现出>65%的抑制。此外，CTX-712不是CYP3A4或hERG钾通道的抑制剂。CTX-712在小鼠、大鼠和人类中表现出高肝微粒体稳定性，表明在动物中具有良好的药代动力学特征，这通过小鼠组合药代动力学研究得到证实。
为检验CTX-712的细胞效力和靶点参与，研究团队分析了小细胞肺癌细胞系NCI-H1048中底物SR蛋白的磷酸化水平。使用抗泛磷酸化SR抗体，该抗体识别SR蛋白家族的多个经典成员。研究发现，CTX-712以浓度依赖性方式显著降低了SR蛋白的磷酸化水平。具体而言，在此Western blot分析中作为主要底物的p-SRSF4（SRp75）和p-SRSF6（SRp55）的IC50值分别为45.5和116.1 nM。这些磷酸化的抑制伴随着迁移率变化，与先前观察结果一致。重要的是，这些数据与NCI-H1048细胞中的GI50值75 nM相关。随后，CTX-712在NCI-H1048异种移植模型中进行了评估。在此功效研究中，化合物以25、37.5或50 mg/kg的剂量口服给药，每周两次，每天两次（BIW，BID），持续14天。值得注意的是，CTX-712表现出显著的剂量依赖性抗肿瘤效果，在50 mg/kg时效果最佳，第14天的T/C值为6.2%。此外，在整个研究过程中未观察到严重的体重减轻。这些结果表明，CLK抑制剂CTX-712有望成为抗癌药物，特别是在具有剪接因子突变的患者中。由于其良好的药理学和安全性特征，CTX-712被选为开发候选物，并已进入日本（jRCT2080224127）和美国（NCT05732103）的I期临床试验。
总之，研究团队通过SBDD指导的新型化学类型生成，随后进行先导优化，发现了一种强效且生物可利用的CLK抑制剂CTX-712，该抑制剂已被指定国际非专利名称Rogocekib。CTX-712有效抑制了CLKs和SR蛋白的磷酸化，导致显著的体外和体内抗增殖效应。这一发现强调了CTX-712作为针对具有RNA剪接改变（如剪接因子突变）的恶性肿瘤的靶向治疗的潜力。
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