摘要
腹膜癌病是胃食管癌常见的转移性疾病，预后较差且治疗选择有限。在此研究中，我们建立了临床相关的腹膜癌病小鼠模型，以评估第二代间皮素靶向嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的疗效。我们的模型重现了关键的临床特征，包括腹水、肠梗阻以及以肿瘤细胞程序性死亡配体1表达和腹水中转化生长因子-β（TGF-β）水平升高为特征的免疫抑制性肿瘤微环境。为克服T细胞耗竭，我们设计了一种CAR T细胞构建体（M28z1XXPD1DNR），该构建体包含缺乏细胞内信号域的程序性细胞死亡蛋白-1诱饵受体，可增强功能性持久性。我们证明，与静脉（系统性）给药相比，低剂量腹腔内（区域性）给药的CAR T细胞取得了更优越的抗肿瘤效果、更长的生存期和更持久的功能性。值得注意的是，腹腔内治疗对远处病灶也表现出效力。这些发现为临床转化提供了强有力的依据；目前我们正在进行一项临床试验（NCT06623396），以评估M28z1XXPD1DNR CAR T细胞腹腔内给药治疗胃食管癌腹膜癌病患者的疗效。
背景
腹膜癌病在三分之一的转移性胃食管腺癌患者中出现，对化疗和免疫治疗具有抵抗性，中位生存期仅为3-5个月。胃食管腺癌腹膜转移的免疫微环境特征为M2巨噬细胞、抑制性细胞因子和低水平的肿瘤浸润淋巴细胞，这阻碍了对免疫治疗的反应。为使免疫环境有利于效应反应，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已被用于增加这些抵抗性肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞数量。CAR是合成受体，已被设计用来引导T细胞靶向癌症相关抗原，如间皮素（MSLN），其在胃食管腺癌细胞上过表达，且与肿瘤侵袭性相关。为克服过继转移的免疫效应细胞难以浸润实体瘤的挑战，我们研究了CAR T细胞的胸膜内（区域性）递送，在临床前研究中与静脉（系统性）给药相比，即使在低30倍的剂量下也能实现更优越的疗效，并增强CD4 CAR T细胞的辅助功能，从而维持更多的CD8 CAR T细胞。间皮素靶向CAR T细胞的胸膜内递送已转化为I期临床试验（n=27名患者），并证明安全有效；迄今为止，在I/II期研究中已治疗41名患者，单次胸膜内输注后100多天仍可检测到系统循环的CAR T细胞。
患有胃食管腺癌腹膜癌病的患者通常伴有腹膜外转移灶；因此，我们在同时存在腹膜和远处病灶的小鼠模型中研究了腹腔内CAR T细胞疗法的疗效。
方法
肿瘤细胞
KYAE-1和SK-GT-4胃食管腺癌细胞购自Sigma-Aldrich公司。由于培养的癌细胞中间皮素表达具有变异性，我们将人源间皮素变异体1（从人卵巢癌细胞OVCAR-3分离）亚克隆到SFG逆转录病毒载体中，生成过表达间皮素的肿瘤细胞（KYAE1-M和SKGT4-M）。细胞通过逆转录病毒转导表达绿色荧光蛋白（GFP）-萤光素酶融合蛋白（KYAE1-GM、SKGT4-GM），以便进行体内生物发光成像（BLI）。所有使用的细胞系均定期在纪念斯隆-凯特琳癌症中心抗体和生物资源核心设施通过短串联重复序列分析进行鉴定。此外，所有细胞系均常规进行支原体污染检测，以确保整个研究过程中细胞系身份和培养完整性。
γ-逆转录病毒载体构建和病毒生产
通过将特异性针对人间皮素的单链可变片段与CD28/CD3ζ信号域连接，生成了间皮素特异性CAR。通过将PD-1受体的胞外部分与M28z载体序列连接，生成程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）显性负受体（DNR）。CD3ζ域被修饰以包含单个功能性基于免疫受体酪氨酸的激活基序，称为1XX，从而形成M28z1XXPD1DNR CAR构建体。每个CAR序列均插入SFG γ-逆转录病毒载体（由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的I Riviere提供），并与Myc标签序列连接。然后将CAR编码质粒转染到293T H29和293VecRD114包装细胞中以产生逆转录病毒。本研究中使用的28z间皮素CAR、PD-1 DNR和1XX CAR构建体的序列可在以下专利申请中查阅：WO2015188141A9、WO2017040945A1和EP3732191A2。
T细胞分离和基因转移
在纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构审查委员会批准的方案下，从健康志愿者供体的血液中分离外周血白细胞。通过Lymphoprep（STEMCELL Technologies）低密度离心分离外周血单核细胞（PBMCs），并用植物血凝素（2 ug/mL；Remel）激活2天。分离后2天，用293VecRD114产生的编码CARs和PD-1 DNR的逆转录病毒颗粒转导PBMCs，并在涂有retronectin（15 µg/mL；r-Fibronectin，Takara Bio）的平板上以1800 g离心1小时。转导的PBMCs在白细胞介素-2（IL-2）（20 UI/mL；Novartis）中维持。未转导的和靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）的CAR T细胞均用作对照。我们先前报道，靶向PSMA的28z CAR（在此背景下为无关抗原）在间皮素肿瘤模型中没有显示出疗效，与未转导的T细胞相当，背景活性最小。
CAR T细胞细胞毒性测定
使用标准51Cr释放测定法确定CAR T细胞的细胞毒性。M28z1XXPD1DNR CAR T细胞和对照未转导T细胞与过表达间皮素的靶细胞（KYAE1-M、SKGT4-M）在效应细胞与靶细胞（E:T）比率为1:4至64:1的范围内共培养。孵育18小时后确定细胞毒性。数据报告为三重复测量平均值±标准误，并使用Microsoft Excel（Microsoft）或GraphPad Prism（GraphPad Software）进行分析。
体外CAR T细胞增殖和积累测定
根据制造商说明（Thermo Fisher Scientific），使用1 µM工作溶液的CellTrace Violet细胞增殖染色剂对CAR T细胞进行染色。M28z1XXPD1DNR CAR T细胞（180×10³ CAR T细胞/24孔板）和过表达间皮素的肿瘤细胞（60×10³肿瘤细胞/24孔板；KYAE1-M、SKGT4-M）以3:1的E:T比率在三重复中接种。孵育4天和7天后，收集T细胞，使用血细胞计数器计数T细胞数量，并使用流式细胞术评估CAR T细胞的CAR+百分比和CellTrace Violet荧光强度。绘制的CAR T细胞积累数量根据CAR+百分比进行了调整。
体外CAR T细胞重复抗原刺激测定
为评估重复抗原刺激后的积累情况，将过表达间皮素的肿瘤细胞（KYAE1-M、SKGT4-M）照射后以每平方厘米30×10³个肿瘤细胞的密度在6孔板中三重复接种。肿瘤细胞接种后24小时，以2:1的E:T比率接种M28z1XXPD1DNR CAR T细胞。孵育2天后，收集T细胞，使用血细胞计数器计数，并评估CAR+百分比。绘制的CAR T细胞积累数量根据CAR+百分比进行了调整。然后在相同条件下重新刺激T细胞，共进行三次抗原刺激。
体外细胞因子释放测定
M28z1XXPD1DNR CAR T细胞（180×10³ CAR T细胞/24孔板）和过表达间皮素的肿瘤细胞（60×10³肿瘤细胞/24孔板；KYAE1-M、SKGT4-M）以3:1的E:T比率在三重复中接种。孵育20小时后，收集细胞培养上清液。使用Luminex测定法（Thermo Fisher Scientific）定量人干扰素-γ、IL-2和肿瘤坏死因子-α。
流式细胞术和T细胞增殖标记
使用荧光染料偶联抗体检测间皮素（抗间皮素PE偶联大鼠IgG2A FAB32652P；R&D Systems）、CD45、CD3（PE/Cy7抗人CD3克隆HI3A，300316；BioLegend）、CD4（APC小鼠抗人CD4，55349；BD Pharmingen）、CD8（FITC小鼠抗人CD8，561948；BD Pharmingen）、程序性死亡配体1（PD-L1）、PD-1和Myc标签（PE小鼠抗人Myc，9B11；Cell Signaling Technology）。所有流式细胞分析均在BD FACSCalibur或LSR II（BD Biosciences）流式细胞仪上进行；数据使用FCS Express软件（V.7）分析。体内异种移植肿瘤样本的流式细胞术在40 µm过滤器过滤和用抗小鼠Fc阻断剂阻断后进行。
胃食管癌腹膜癌病小鼠模型
用于动物研究的实验程序已获得纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会的批准。NSG小鼠（Jackson Laboratory）通过腹腔注射5×10⁶个表达间皮素和GFP-萤光素酶的KYAE1-GM或SKGT4-GM胃食管腺癌细胞（200 µL无血清培养基）。M28z1XXPD1DNR CAR T细胞或对照（未转导）T细胞在200 µL无血清培养基中通过腹腔或静脉注射，每只小鼠剂量为1×10⁵、2×10⁵或5×10⁵个细胞。通过注射5×10⁶个KYAE1-M或KYAE肿瘤细胞到无血清培养基中建立皮下肿瘤。皮下肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm³）= [宽度（mm）]² × [长度（mm）]/2。在小鼠安乐死后，从腹腔获取腹水，并使用Luminex测定法（Thermo Fisher Scientific）测定TGF-β1浓度。
成像
通过腹腔注射D-萤光素监测肿瘤生长。获得腹侧图像（0.5秒曝光）后量化腹膜BLI信号。小鼠安乐死后，使用Zeiss Lumar version 12立体显微镜（6.4倍放大）对具有KYAE1-GM腹膜肿瘤负担的小鼠腹部进行成像。将异硫氰酸荧光素通道图像（代表GFP标记的肿瘤细胞）叠加在明场图像上。使用Vevo 2100成像平台（VisualSonics）和40-MHz探头获取小鼠腹膜肿瘤的超声图像。
统计分析
使用GraphPad Prism软件（V.6.0）分析数据，并根据图例中所述，以平均值±平均值标准误表示。使用非配对Student's t检验（双尾）分析结果。使用log-rank检验分析生存曲线。统计显著性定义为p<0.05。
结果
我们首先使用表达间皮素和GFP-萤光素酶的胃食管腺癌细胞（KYAE-1和SK-GT-4）在NSG小鼠中建立了临床相关的腹膜癌病小鼠模型（便于通过BLI监测肿瘤负担）；这些模型显示腹水中TGF-β水平高（中位腹水TGF-β1水平为1,800-6,000 pg/mL）并伴有肠梗阻。我们还建立了一个具有腹膜癌病和远端抗原表达左皮下肿瘤及非抗原表达右皮下肿瘤的模型，以研究腹腔内与静脉治疗后原发腹膜部位和远端转移部位对治疗的反应。我们基因工程设计了一种间皮素靶向CAR（M28z1XXPD1DNR），表达包含单个功能性基于免疫受体酪氨酸的激活基序（称为1XX，可增加持久性）的CD3ζ域、CD28共刺激和PD-1 DNR；DNR作为诱饵受体，缺乏抑制性细胞内信号域，从而减少T细胞耗竭。当与M281XXPD1DNR CAR T细胞共培养时，表达可变间皮素和PD-L1的胃食管腺癌细胞表现出抗原强度依赖性细胞毒性、CAR T细胞积累和效应细胞因子分泌。即使在低五倍的剂量下，M28z1XXPD1DNR CAR T细胞的腹腔内给药也比静脉给药取得了更好的抗肿瘤效果。在SKGT-4细胞的另一模型中也观察到类似结果。
为研究腹腔内M28z1XXPD1DNR CAR T细胞的"功能性持久性"，我们将肿瘤负担已被清除且在注射1×10⁵个CAR T细胞后长期生存超过84天的小鼠，用重复腹腔内注射肿瘤细胞进行再挑战。我们观察到CAR T细胞的功能性持久性，在再挑战后第5天，BLI降至背景水平。PD-1 DNR构建体可能通过防止PD-1信号传导并在肿瘤微环境中支持持久性，为长期研究中观察到的持续CAR T细胞活性做出贡献。在先前的不同肿瘤模型中也报告了PD-1 DNR的类似益处，其中表达PD-1 DNR的CAR T细胞表现优于缺乏PD-1 DNR构建体的细胞。
22-78%的转移性胃食管腺癌患者伴有多个转移灶。为解决这一问题，在NSG小鼠中建立了一个综合肿瘤模型，包括抗原表达的左皮下肿瘤、非抗原表达的右皮下肿瘤和抗原表达的GFP-萤光素酶+腹膜肿瘤。在建立皮下和腹膜肿瘤后，小鼠通过腹腔或静脉递送接受2×10⁵个PSMA M28z1XXPD1DNR CAR T细胞治疗。所有接受腹腔CAR T细胞的小鼠（n=7）在第11天表现出远端抗原阳性皮下肿瘤体积减少，并在第7天清除了腹膜肿瘤。接受静脉CAR T细胞的小鼠皮下肿瘤负担减少较慢（第17天）。中位生存期在任一组均未达到，但所有接受腹腔CAR T细胞的小鼠在30天时仍存活；相比之下，七名接受静脉CAR T细胞的小鼠中有三名因肿瘤负担在第11至12天被实施安乐死。
我们进一步研究了腹腔CAR T细胞给药后在远端部位的优越抗肿瘤效果是否归因于单纯的抗原驱动增殖（体内剂量扩增）或额外的远端肿瘤浸润改善。为此，我们设计了实验，将具有或不具有腹膜抗原表达肿瘤的小鼠队列（n=7）与MSLN表达的左皮下肿瘤和抗原阴性右皮下肿瘤一起使用。体外抗原激活的CAR T细胞的静脉给药导致大多数小鼠出现肺毒性（抗原激活的CAR T细胞更大且呈颗粒状，肺毛细血管截留更高，且它们分泌细胞因子）。体外抗原激活的腹腔给药CAR T细胞浸润皮下肿瘤的水平与通过腹膜MSLN表达肿瘤激活的CAR T细胞相似，而未进行体外抗原激活的腹腔给药CAR T细胞和针对抗原阴性腹膜肿瘤给药的CAR T细胞浸润较弱。为评估CAR T细胞特异性，我们分析了所有治疗组的对侧MSLN−肿瘤。如补充图1D所示，无论给药途径如何，所有条件下MSLN−肿瘤中的CAR T细胞积累和CD8+ T细胞频率均保持较低。这些发现证实了对抗原阴性部位的浸润最小，并支持该模型中CAR T细胞的抗原依赖性活性。通过安乐死后收获的皮下肿瘤的免疫组织化学确认了左皮下肿瘤中的抗原表达和右皮下肿瘤中无抗原表达。
讨论
在具有腹水、肠梗阻以及以高水平TGF-β和肿瘤细胞PD-L1表达为特征的免疫抑制性微环境的胃食管腺癌腹膜癌病临床相关小鼠模型中，针对肿瘤免疫微环境进行基因调控的腹腔给药间皮素靶向CAR T细胞在腹膜内和远端部位均有效。腹腔给药的CAR T细胞表现出功能性持久性，并与更长的生存期相关；类似的结果已在针对脑肿瘤的早期临床试验中通过脑室内和瘤内给药得到证实。与静脉给药或体外激活的细胞相比，腹腔给药的CAR T细胞富含CD8+细胞，HLA-DR激活水平更高。此外，与体外激活相比，腹膜内原位抗原激活与更好的CAR T细胞扩增和向皮下肿瘤浸润相关。
基于这些观察结果，一项针对间皮素阳性腹膜癌病的食管胃腺癌腹腔内间皮素靶向CAR T细胞治疗的I期试验已经启动，已获得新药研究申请、机构审查委员会和美国食品药品监督管理局的批准，并正在积极招募受试者（ClinicalTrials.gov编号：NCT06623396）。参与者将接受环磷酰胺静脉淋巴清除，随后接受单次腹腔输注递增剂量的M28z1XXPD1DNR CAR T细胞。
该I期试验研究设计包括：符合条件的患者进行白细胞分离以制造CAR T细胞（约3-4周）。在CAR T细胞产品可用前可给予桥接治疗。给予静脉氟达拉滨或环磷酰胺进行预处理。食管胃腺癌患者在第0天通过腹腔输注接受五种CAR T细胞剂量之一。输注后，患者在门诊诊所监测4周。每8周进行一次影像学检查，持续6个月，然后每8-12周一次，长达2年。研究队列设计采用剂量递增策略，最少4名最多18名患者将接受递增剂量的CAR T细胞。患者将按照研究设计入组队列，初始剂量水平（剂量水平2）要求前两名患者之间有14天的间隔。从第0天到第30天监测剂量限制性毒性。在推进下一队列之前，队列中的所有患者必须完成30天的剂量限制性毒性观察期。修改的连续再评估方法将指导剂量递增，患者以每队列2名的方式入组。只有符合条件且可评估的患者将被考虑用于剂量确定。
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