摘要
衰老是急性呼吸道病毒感染后发病率和死亡率增加的主要风险因素。为了阐明衰老肺脏中病毒致病机制和延迟修复的免疫决定因素，我们开展了一项全面的时间序列研究。我们利用单细胞RNA测序和高维流式细胞术比较了感染甲型流感病毒的年轻和老年小鼠的肺脏。老年宿主在感染后表现出肺泡巨噬细胞和树突状细胞减少，但单核细胞来源的巨噬细胞和间质巨噬细胞增加。此外，在记忆期观察到适应性免疫细胞的累积增加，包括CD4+组织驻留辅助T细胞、CD8+组织驻留记忆T细胞，以及一个类似年龄相关B细胞的B细胞亚群。通路分析揭示，升高的Ⅰ型和Ⅱ型干扰素信号，尤其是在单核/间质巨噬细胞亚群中，是老年宿主区别于年轻宿主的关键特征。在病毒清除后抑制干扰素α/γ信号通路改善了老年小鼠的长期呼吸结局，并减少了间质巨噬细胞和组织驻留辅助T细胞的数量。这些发现强调了干扰素α/γ信号（可能在单核/间质巨噬细胞亚群内）在驱动急性病毒感染后老年肺脏中适应性免疫细胞的过度持续存在和慢性免疫病理学中的关键作用。
引言
衰老是急性呼吸道感染后严重发病率和死亡率的主要风险因素之一。疫苗效力下降和免疫失调进一步增加了老年人对流感病毒等病原体的易感性。65岁以上个体在感染流感病毒后，住院率、重症监护病房入住率和死亡率均升高。除急性期外，持续的肺部病理，包括慢性炎症、纤维化和肺功能受损，也造成了巨大的急性期后健康负担。最近对住院的COVID-19和季节性流感患者的研究表明，约50%的呼吸道并发症（咳嗽、低氧血症、间质性肺病和呼吸急促）在急性期后（入院后≥30天）出现或持续存在。一致地，在小鼠模型中，这些长期后遗症表现为恢复延迟、过度胶原沉积和持续性肺部炎症。
虽然免疫反应对病毒清除至关重要，但适应不良的炎症和失调的免疫重建是导致年龄相关发病率和死亡率的主要驱动因素。多层面免疫因素导致老年宿主表现出的抗病毒防御和组织损伤缺陷。相关方面包括肺泡巨噬细胞的数量和功能缺陷、过度的先天炎症、T细胞受体库多样性减少，以及T细胞和B细胞启动受损。在恢复期，持续的炎症和功能失调的促修复反应加剧了慢性病理。内在因素（细胞固有衰老）和外在因素（衰老的组织环境）都可能导致延续肺部后遗症的独特免疫表型。
间质巨噬细胞存在于肺实质中，与肺泡巨噬细胞不同，其发育或存活依赖于CSF1。它们在肺稳态、组织修复和疾病发展中的作用尚不明确。然而，最近的研究表明，间质巨噬细胞可能充当病毒抗原的储存库，介导纤维化，并清除凋亡的肺泡上皮细胞。某些间质巨噬细胞亚群也被认为与诱导性支气管相关淋巴组织的形成有关，提示间质巨噬细胞可能协调局部免疫的“枢纽”。
为了剖析流感诱导的老年宿主慢性肺部病理的细胞和分子机制，我们对年轻和老年小鼠在感染后约60天内的肺脏进行了时间序列单细胞RNA测序分析。对主要免疫细胞群进行了基于知识的精细细胞类型注释，并利用高维流式细胞术进行了验证。观察到持续的炎症和异常的巨噬细胞动态。在记忆期，老年肺脏表现出适应性免疫细胞的累积增加，包括组织驻留辅助CD4 T细胞、CD8组织驻留记忆T细胞，以及一个类似“年龄相关B细胞”的B细胞亚群。间质巨噬细胞与这些适应性细胞数量之间的密切关联暗示间质巨噬细胞在驱动其招募和/或维持中可能发挥作用。基因集富集分析进一步发现老年宿主中升高的干扰素信号主要存在于肺单核/间质巨噬细胞亚群中。重要的是，在病毒清除后治疗性阻断干扰素α/γ信号通路可改善慢性肺部病理并减少间质巨噬细胞和组织驻留辅助T细胞的累积。这些发现支持了一个新机制，即过度的干扰素信号调节间质巨噬细胞以促进适应不良的免疫微环境，为减轻老年人长期肺部后遗症提供了一个有前景的治疗途径。
结果
衰老改变免疫动力学并促进流感感染后持续性肺部炎症
衰老是人类和小鼠流感病毒感染诱导发病率和死亡率的重要风险因素。它也影响感染后肺脏细胞和分子变化的动态和规模。这在老年宿主身上表现得很明显，如初始体重减轻的时间延迟，以及H&E染色的肺组织组织学检查所示。老年宿主还经历了持续的肺部炎症和病理变化。研究这些年龄相关改变的细胞和分子机制需要在多个关键时间点捕获数据。虽然以前的研究提供了急性期免疫反应的详细特征，但老年宿主在流感病毒感染恢复期和慢性期的这些改变对于理解老年人观察到的“长流感”的发病机制至关重要。
为了解决这个问题，我们进行了流感病毒感染后年轻和老年小鼠细胞和分子图谱的时间序列单细胞RNA测序评估。以未感染小鼠作为对照，在感染后第2、9、14、30和61天收集样本。为了尽量减少生物变量（如批次小鼠或病毒）引入的潜在偏差，年轻和老年雌性小鼠同时感染相同剂量的PR8病毒。在组织收获前，通过血管内注射抗CD45抗体标记循环和血管相关免疫细胞。然后收集肺组织用于组织学分析和制备单细胞悬液。每组所有小鼠肺匀浆的单细胞悬液在单细胞RNA测序文库制备前混合，以确保组间代表性。此外，采用高维流式细胞术更深入地了解每个肺脏的免疫细胞组成。
使用Seurat对文库进行整合和聚类，并根据其区分特征确定聚类身份。以clusterProfiler为锚点，使用基因集富集分析进行通路分析，揭示了每个时间点年轻和老年宿主之间的差异。计算“模块分数”以评估通过基因集富集分析确定的一般趋势和关键信号通路，并按样本和细胞类型进行可视化。
作为概念验证，使用公开的基因集评估了细胞衰老。尽管这些数据集突出了不同的细胞区室，但老年宿主一致地表现出增强的细胞衰老相关特征。老年肺脏也表现出再生能力降低，表现为转录谱显示细胞周期进展和上皮发育受损，尤其是在修复期和慢性期。此外，老年肺脏表现出增强的促炎通路，尽管TCR和BCR信号通路没有显著改变。Hedgehog信号（据报道具有抗纤维化作用）在老年宿主的修复期和慢性期也减少。总之，这些发现强调了流感病毒感染后老年肺脏中再生能力降低、炎症增强和易感纤维化的转录特征。
通过协同分析单细胞RNA测序和流式细胞术结果，实现了年轻和老年宿主免疫细胞动态的定量。在每个单细胞RNA测序文库中，计算不同细胞类型相对于通过质控的总细胞数的比例。使用光谱流式细胞术验证先天性和适应性免疫细胞区室的动态。与通路分析一致，衰老与增强的促炎特征相关。尽管我们的时间点对于捕获先天免疫反应峰值而言并非最佳，尤其是在年轻小鼠中，但老年宿主表现出炎症细胞的增强和持续性升高。这反映在Ly6C高表达单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的累积上。老年宿主还表现出其他T细胞（包括自然杀伤T细胞和γδ T细胞）的累积增加。有趣的是，这些伴随着嗜酸性粒细胞的缺陷。在老年宿主的主要适应性免疫群体中也观察到了动态改变。CD4 T细胞和CD8 T细胞在老年肺脏中都表现出延迟但增强的累积。总之，这些发现表明流感病毒感染后老年肺脏中存在不协调的免疫反应。
在记忆期老年肺脏中CD8 T细胞累积增加并带有Taa样特征
T细胞在流感病毒感染后的宿主抗病毒反应中起着关键作用，但它们在呼吸道感染的急性和慢性期也可能导致严重的肺部免疫病理学。为了研究流感感染后年轻和老年宿主中T细胞反应的动态，我们对T细胞进行了亚群分析并进行了进一步表征。根据细胞周期分析，聚类12和22被鉴定为增殖的T细胞。尽管在慢性期有驻留CD4和CD8 T细胞的累积，但老年肺脏中增殖的αβ T细胞比例降低。
在捕获的CD8 T细胞中，聚类1和2被鉴定为循环CD8 T细胞。这些簇表达归巢受体，以及中央记忆相关标志物的mRNA。聚类2很可能是活化的并正在经历组织招募。这一观点得到了其富含TCR信号下游转录因子、细胞毒功能相关分子和趋化因子受体的支持。尽管缺乏初始循环CD8 T细胞，但在早期时间点，年轻和老年小鼠中招募的CD8 T细胞比例相似。
年龄相关T细胞，以其表达颗粒酶K为特征，据报道在生理衰老过程中存在于老年宿主的淋巴和非淋巴器官中。发现五个簇含有表达Gzmk的CD8 αβ T细胞。聚类9、11和13很可能是效应CD8 T细胞，因为其分子谱代表细胞毒性T细胞。值得注意的是，聚类9表现出Zeb2的高表达，这是一种对CD8 T细胞终末分化至关重要的转录因子，并且在LCMV感染期间对细胞毒性淋巴细胞命运决定至关重要。相比之下，聚类11和13主要表达Zeb1，一种与T记忆细胞形成相关的转录因子。聚类11和13显示出富集的干扰素诱导的转录组，并表达Zbp1，一种与细胞死亡有关的分子。一致地，这两个簇随时间逐渐减少。相反，聚类9中的细胞经历了收缩，但在年轻和老年小鼠中持续存在至第60天。
在表达Gzmk的簇中，聚类3显示出最高水平的Gzmk，其分子谱与先前描述的“Taa”群体非常相似。该簇中的细胞表现出明显的耗竭相关转录组，包括共抑制受体和耗竭相关转录因子。它们还表现出低表达的Tbx21、Gzma、Gzmb、Prf1和效应细胞因子。值得注意的是，即使处于稳态，老年肺脏也含有更多数量的这些Taa样细胞。这种累积在记忆期进一步增强。这些发现通过光谱流式细胞术得到了进一步验证。鉴定出3个不同的Cd44阳性Sell阴性簇（聚类3、5和9）在记忆期累积。在CD69阳性CD103阴性群体中，聚类9细胞主要表现出CD69阳性PD-1低表型，而聚类3细胞主要是CD69阳性PD-1高表型。一致地，我们在记忆期观察到老年宿主中血管内阴性CD69阳性CD103阴性PD-1高表达CD8 T细胞的数量增加。这些结果可能表明，带有Taa样特征的Gzmk阳性CD8 T细胞可能是导致老年宿主慢性肺部疾病的致病性CD8 T细胞的主要候选者。
聚类5类似于传统的组织驻留记忆T细胞，证据是其表达Cd69和Itgae。尽管这些细胞也表达几种抑制性受体，但它们并未显示出升高的耗竭相关转录因子水平。虽然簇3和簇5相对于簇9都具有降低的细胞毒性相关特征，但簇5保持了相对更强的细胞毒性特征。为了进一步了解老年宿主中这些细胞的特征，我们使用基因集富集分析进行了通路分析。与簇3相比，簇5细胞富集了细胞粘附和MHC-I依赖性TCR激活通路，并且它们还显示出增强的记忆形成特征。在年轻小鼠中，簇5细胞的数量在感染后约14天达到峰值，随后进入收缩期，并在约60天时维持在相对较低的水平。相比之下，在老年小鼠中，簇5细胞的比例在感染后约30天达到峰值。
总之，流感病毒感染导致老年肺脏中常规的组织驻留记忆T细胞和Taa样细胞水平增加，可能导致了先前报道的慢性肺部后遗症。使用H2Db-NP和H2Db-PA四聚体对流感特异性肺组织驻留记忆T细胞进行的流式细胞术分析显示，在记忆期，老年肺脏中流感特异性CD8组织驻留记忆T细胞的频率高于年轻肺脏，表明病毒抗原和/或衰老环境（如TGF-β水平升高等）在其累积中可能发挥作用。
老年肺脏中的CD4 T细胞表现出改变动态，Treg和TRH细胞增加
在同一分析中，CD4 T细胞群体由来自聚类4、11、6、8、17和19的细胞组成。由于在UMAP空间中与循环CD8 T细胞接近，聚类4被鉴定为初始循环CD4 T细胞。这些细胞富含Klf2及其靶基因S1pr1，同时尚未上调Maf或Nfatc1。与先前的报道一致，我们的单细胞RNA测序分析显示初始CD4 T细胞数量减少。相比之下，其余五个CD4 T细胞簇表现出抗原经历细胞的谱，其特征是Sell低表达和Cd44、Nfatc1和Pdcd1高水平表达。值得注意的是，簇8具有与簇4相似的转录组，表明它同样代表循环CD4 T细胞。然而，簇8中的细胞也显示出增加的Cxcr3表达，这是一种CD4 T细胞组织招募的趋化因子受体。
簇6和簇11都含有表达Tbx21和Ifng的TH1样CD4 T细胞。它们还显示出Ccr7下调和Cxcr6上调，促进其向肺组织归巢。尽管簇6主要由CD4 T细胞组成，但簇11可能同时包含CD4和CD8 T细胞。与簇11相比，簇6细胞表现出增强的Cd40lg表达，使其能够接收来自抗原呈递细胞的共刺激信号。此外，由于簇6中的一些细胞也富含类似于其他辅助细胞亚群的转录因子，我们称此簇为“活化CD4”。
与我们先前的报告一致，在UMAP中代表调节性T细胞和组织驻留辅助T细胞的簇彼此接近。簇17被定义为Treg，因为它表达Foxp3而非Bcl6。该簇在表达关键免疫调节细胞因子如Il10和Tgfb1方面也是独特的。簇19代表先前报道的TRH细胞，其特征是表达Izumo1r、Pdcd1、转录因子如Bcl6和Bhlhe40，以及细胞因子Il21。Treg和TRH细胞在年轻和老年宿主中均随时间逐渐积累。通过光谱流式细胞术验证了我们的单细胞RNA测序结果，将Treg鉴定为FOXP3阳性CD4 T细胞，将TRH鉴定为FOXP3阴性CD44阳性CD62L阴性CD69阳性PD-1高表达CD4 T细胞。与单细胞RNA测序定量结果一致，在记忆期，老年宿主中Treg和TRH细胞的数量相较于年轻宿主有所增加。尽管Treg积累，但先前的研究表明，老年肺脏中的Treg在流感病毒感染后的组织修复中表现出功能失调的表型，并且它们在体外活化后可表现出Th1/Th17样表型。
TCR信号和MHC-II依赖性已被证明对于维持年轻宿主中约60天TCR信号和MHC-II依赖性已被证明对于维持年轻宿主中约60天时的TRH细胞是重要的。然而，当我们使用基于相关基因集的模块分数评估TCR信号时，我们观察到在感染后14天、30天和60天呈下降趋势。为了确保有足够数量的年轻宿主事件进行比较，我们对第30天收集的TRH（簇19）细胞进行了通路分析。与年轻宿主相比，来自老年小鼠的TRH细胞表现出增强的细胞迁移和粘附特征。此外，它们还表现出增加的细胞应激和改变的脂质代谢特征。这些变化在老年宿主中的功能意义以及生理或病理后果仍有待探索。
老年肺脏中存在增强的ABC样B细胞亚群，提示组织体液免疫功能失调
在分离的B细胞簇中识别了差异表达基因，以进行精细整合和聚类。“新招募的”B细胞由簇0、2和3代表。这些细胞表达Cr2和Fcer2a，以及高水平的Ighd。它们表达归巢受体如Sell和Ccr7，但缺乏通常与B细胞活化相关的基因。然而，基于它们的Cd44和Cd38表达，这些细胞不太可能是真正的初始B细胞。在整个感染过程中，老年小鼠表现出这些新招募的B细胞比例降低。簇12似乎代表了从新招募B细胞向活化B细胞过渡的中间阶段。同时，簇4、5和6表现出类别转换重组前的活化B细胞表型。这些簇的特征是Ighd下调和Nfact1、Nr4a1以及AP-1组分上调。它们还表达与B-1 B细胞相关的基因，包括Zbtb32、Spn和Cd5。尽管老年肺脏中新招募的B细胞比例较低，但活化的B细胞比例较高。有趣的是，簇6几乎只在老年宿主中检测到，在感染后约14天达到峰值。
在轨迹的另一条路径上，以簇1（和簇2）为中间体，簇9、10和14表现出生发中心样特征，但没有类别转换重组的证据。虽然缺乏Igha和Ighg1的表达，但这些生发中心样细胞表达Cxcr4、Cd69、Cd40、Il21r、Cxcr5和Bcl6。簇9显示出减少的B细胞相关特征。同时，它们尚未完全上调与浆细胞相关的基因。因此，此簇被称为“前浆细胞”。与簇10相比，簇14富含与BCR信号和干扰素反应相关的基因。与表达抗凋亡基因的簇4和5不同，簇11表达Zbp1，这是一种在干扰素信号下细胞死亡的关键介质。
先前的结果表明，“免疫球蛋白产生”和“免疫球蛋白受体结合”是老年肺脏相比年轻肺脏最富集的模块之一。表达重链基因的簇包括7、8、11、13和15。簇11和15都表现出类似于浆细胞的转录组谱，显示出低水平的B细胞标志物，高水平的浆细胞相关表面标志物和转录因子。这两个簇的组合频率在老年宿主中升高。簇13富含Aicda，这是类别转换重组和体细胞高频突变的关键酶。细胞周期分析显示，该簇中的大多数细胞处于S期或G2/M期，支持它们正在活跃增殖的观点。这些细胞在很大程度上保留了B细胞标志物。有趣的是，虽然年轻宿主维持了该簇的强大群体，但老年宿主从30天到61天其数量有所下降。
簇7和8中的细胞表现出记忆B细胞样特征。簇8细胞表达Ccr6和Cxcr3，类似于先前描述的真实记忆B细胞，这些细胞具有抗原特异性，并在再次攻击时提供保护。这些细胞还表达共刺激分子如Icosl。虽然簇8在年轻和老年宿主中表现出相似的动力学，但簇7细胞在老年宿主中显著富集。除了与细胞招募和细胞应激相关的通路外，簇7还富集了与先天激活相关的通路。与此一致，簇7细胞表达Tbx21、Itgax和Itgam，以及Tlr7和Tlr9，可能使它们能够对先天刺激作出反应。这种特征与先前报道的可能具有自身免疫潜能的“年龄相关B细胞”一致。相反，簇8富集的通路与体细胞高频突变相关。尽管年轻和老年宿主之间的动力学相似，但老年宿主中的簇8细胞在DNA修复方面表现出缺陷，以及细胞粘附和极性减弱。它们还表现出增强的脂质代谢，这可能促进效应功能的增强。
总之，年轻和老年宿主在相似的时间线上产生相当比例的记忆B细胞。然而，老年宿主的肺B细胞区室似乎存在亲和力成熟受损，这可能解释了老年个体疫苗效力降低的原因。此外，老年肺脏在记忆期含有更多数量具有年龄相关表型的类别转换、产生抗体的B细胞。这些细胞可能通过BCR信号而非先天信号激活，通过产生潜在的自体反应性抗体，可能对感染后慢性疾病产生不利影响。
老年小鼠在流感感染时CD11b+PD-L1- DC减少
到目前为止，我们已经证明了在记忆期，TRH、B细胞和CD8 T细胞的年龄相关积累。然而，目前尚不清楚哪些细胞类型协调这些反应。我们的数据集为识别潜在候选者提供了一个平台。作为专业的抗原呈递细胞，单核吞噬细胞是发挥这种协调作用的主要候选者。为了剖析它们的动力学和功能，我们鉴定了包含单核吞噬细胞的簇，并检查了它们在不同时间点的组成和功能状态。由于单细胞RNA测序文库制备过程可能会扭曲细胞比例，我们还设计了一个高维流式细胞术方案，使用单细胞RNA测序分析建议的标志物进行验证。
在单核吞噬细胞中，树突状细胞被鉴定为表达Dpp4但不表达C5ar1的细胞。我们进一步使用转录因子、表面标志物和指示其功能的转录组特征对其进行了描绘。簇10和29被定性为常规树突状细胞类型1，因为它们表达Irf8、Batf3、Xcr1和Itgae。此外，簇29细胞正在增殖，如细胞周期分析及其Mki67表达所示。
五个簇（17、21、27、30和28）被归属于CD11b+树突状细胞。由于在UMAP上彼此接近，簇21和簇17很可能是常规树突状细胞类型2。这些簇富含转录因子如Flt3、Zbtb46和Irf4。值得注意的是，簇17表达Mgl2，它标志着在皮肤中诱导TH-2反应以及雌性生殖道中CD8 TRM的cDC2。这些细胞也表达Ccr5，可能使它们能够响应由MCP-2、MIP-1α或MIP-1β诱导的趋化信号。
与簇17相比，簇21表达Bex6，先前在流感病毒感染期间（年轻小鼠感染后4天）的炎性cDC2中被报道过。然而，该簇中的细胞并不像簇30中的细胞那样表现出完全的炎症特征。簇27可能是簇21和簇30之间的中间阶段。簇30和28可能来源于单核细胞，由其表达Mafb、Ccr2和Csf1r表明。在UMAP上位于单核细胞来源的巨噬细胞附近，簇30细胞表达高水平的Irf7和其他干扰素反应元件。相比之下，簇28缺乏炎症相关特征，但正在活跃增殖。
其余的树突状细胞簇包括簇20和25。簇20表达Flt3和Zbtb46。该簇中的细胞也富含Ly75，这对抗原摄取和处理很重要，以及Ccr7，这对树突状细胞迁移至关重要。这些细胞还产生趋化因子如Ccl17和Ccl22，可能促进其他免疫细胞包括CD4 T细胞、NK细胞和γδ T细胞的招募。尽管检测到有限的Il12a表达水平，但Il12b的富集表明这些树突状细胞可能保留产生IL-12的能力，IL-12是对TH1反应至关重要的细胞因子。在UMAP中与其他树突状细胞簇分开，簇25被鉴定为浆细胞样树突状细胞，因为它表达Siglech、Ly6c2、Ly6d和Tcf4。
使用单细胞RNA测序分析和流式细胞术评估了不同树突状细胞亚群的动力学。总体而言，年轻和老年宿主之间的树突状细胞动力学相似。尽管与年轻对照相比，老年宿主中簇10和29（cDC1亚群）的比例下降，但在感染后30天时在cDC1群体中没有观察到显著差异。使用PD-L1作为表面标志物，我们注意到CD11b+PD-L1-树突状细胞群体减少，该群体主要由cDC2细胞组成。进一步检查单细胞RNA测序数据表明，这种减少主要归因于簇17（Mgl2+ cDC2）的减少。尽管常规树突状细胞在支持T细胞方面起着关键作用，但我们没有发现它们的丰度与适应性免疫细胞之间存在明显的同步性。
间质巨噬细胞作为年龄相关适应性免疫细胞积累的关键潜在介质
为了更深入地了解单核细胞和巨噬细胞，我们对这些细胞进行了重新聚类。肺脏包含两种主要类型的驻留巨噬细胞：肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞。在我们的数据集中，我们使用先前报道的特征和已知对肺泡巨噬细胞身份和增殖重要的转录因子鉴定了肺泡巨噬细胞。由于先前报道的Maf和Mafb在抑制肺泡巨噬细胞中胚胎干细胞样特征方面的功能，我们将其用作排除标准。与先前报道一致，我们使用已知的间质巨噬细胞标志物鉴定了两个主要的间质巨噬细胞簇（13和25）。两个簇都表达Mafb，一种参与间质巨噬细胞命运决定的转录因子。它们还表达共刺激分子如Cd40、Cd80和Cd86，并表达Tgfb1，一种与驻留T细胞建立相关的细胞因子。
观察它们的分子谱，簇13中的细胞显示出更高的MHC II表达，可能为T细胞活化提供强的信号1。这些巨噬细胞还表现出升高的共刺激分子如Icosl。相反，簇25具有相对较低的MHC II表达，并表达Lyve1和Folr2。其转录组类似于“M2样”巨噬细胞，以Cd163、Mrc1、Retnla和Il10为标志。该簇表现出类似于在过敏和细菌感染模型中报道的Pf4+Mrc1hi间质巨噬细胞的特征。此后，我们将簇13称为“IM1”，将簇25称为“IM2”。
在稳态时，我们检测到经典/炎性单核细胞、非经典/巡逻单核细胞以及这两种状态之间的中间体。巡逻单核细胞被鉴定为Spn阳性、Cx3cr1高表达、Ly6c阴性和Ccr2阴性的细胞。它们也表达Nr4a1和Pou2f2。同时，经典/炎性单核细胞表达高水平的Ly6c2，以及归巢受体如Ccr2和Cx3cr1。值得注意的是，它们尚未上调巨噬细胞标志物如MHC II或Mertk。先前的研究表明，Ly6C高表达单核细胞可以分化为间质巨噬细胞和单核细胞来源的肺泡巨噬细胞。因此，我们选择簇8作为轨迹分析的起始群体。
感染后，浸润的单核细胞逐渐分化为单核细胞来源的巨噬细胞，随后定向到各种命运。与单核细胞相比，单核细胞来源的巨噬细胞表达Fcgr1、Mertk和MHC II的mRNA。尽管表达了共刺激分子，但单核细胞来源的巨噬细胞和间质巨噬细胞之间的表达水平模式相当不同。簇9和7显示出升高的干扰素信号和细胞死亡相关组分，而簇7和2表达促愈合标志物如Arg1。这些发现表明，单核细胞来源的巨噬细胞不仅在流感病毒感染期间充当主要的促炎性髓系细胞，而且作为关键节点，通过改变其表型和命运向修复期转变。事实上，使用Ccr2iCreZsGreen小鼠进行的谱系追踪证实，浸润的单核细胞可以产生所有巨噬细胞亚群，并且这些标记的细胞持续存在于肺中直至感染后30天。
为了进一步说明单核细胞和巨噬细胞在流感感染期间的作用，我们使用单细胞RNA测序和光谱流式细胞术定量了它们的动力学。在老年宿主中，我们观察到单核细胞来源的巨噬细胞的持续群体。然而，这并未转化为肺泡巨噬细胞群体的增加。我们发现成熟/稳态肺泡巨噬细胞（鉴定为Siglec F高表达细胞）存在缺陷。在轨迹的另一分支上，间质巨噬细胞在年轻和老年宿主之间表现出不同的动力学。与增强的适应性免疫区室同时，间质巨噬细胞数量在记忆期的老年宿主中升高。由于两个间质巨噬细胞簇显示出不同的特征，因此使用FRβ来区分这些群体。通过流式细胞术，我们可以根据其MHC II表达进一步分离表达FRβ的间质巨噬细胞。衰老与记忆期所有这些间质巨噬细胞群体的累积增加有关。
先前的报告表明，急性期组织损伤增强可导致长期后遗症，即使在年轻宿主中也是如此。由于衰老与抗病毒反应受损有关，我们纳入了一组感染较高剂量PR8的年轻小鼠，以确定巨噬细胞组成差异是否仅仅是由组织损伤增加引起的。在单核细胞来源的巨噬细胞命运决定开始出现的关键时间点，感染高剂量流感病毒的年轻宿主中的巨噬细胞组成表现出中间表型。然而，在慢性期，它们最终表现出与感染低剂量流感病毒的年轻宿主相似的特征。相比之下，老年小鼠始终表现出肺泡巨噬细胞比例降低和间质巨噬细胞群体增加。因此，观察到的改变不太可能仅仅是由于急性期损伤增强所致。
除了数量差异外，衰老还影响间质巨噬细胞的表型。在年轻宿主中，间质巨噬细胞表现出增强的细胞粘附、细胞-细胞相互作用和信号转导。相比之下，老年宿主中的间质巨噬细胞对生长因子的反应受损，效应功能增强。值得注意的是，老年宿主中的间质巨噬细胞2细胞表现出与抗原呈递和适应性免疫反应调节相关的通路富集。总之，老年肺脏中的间质巨噬细胞可能是老年宿主观察到的长期后遗症发病机制的主要贡献者。
过度的干扰素α/γ信号损害老年宿主的肺修复
我们已经证明，老年宿主在流感病毒感染后表现出持续的肺部病理，并伴有先天性和适应性免疫细胞群体的改变。为了确定潜在的治疗靶点，我们对年轻和老年宿主中流感病毒感染激活的分子信号通路进行了比较分析。通过对所有细胞进行基因集富集分析，我们发现干扰素相关通路在多个时间点在老年宿主中持续富集。使用“Hallmark, IFNα response”和“Hallmark, IFNγ response”的基因列表，可以通过对单细胞RNA测序数据进行评分来评估这些信号的概况。值得注意的是，老年宿主表现出延长和增强的干扰素信号。尽管由于信号或测序限制，在感染后61天时未观察到总肺细胞的显著差异。与此同时，先前的Nanostring数据已显示老年宿主在感染后60天时干扰素信号增强。这一发现表明持续的干扰素信号与老年肺脏中观察到的慢性病理之间存在潜在联系。
利用单细胞RNA测序方法，我们检查了干扰素信号的潜在来源和靶点。CD8 T细胞和NKT细胞是Ifng的主要生产者。对于I型干扰素，主要生产者包括单核细胞来源的巨噬细胞/间质巨噬细胞和基质细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。引人注目的是，单核/间质巨噬细胞而非适应性免疫群体是两种干扰素信号的主要接收者。
先前的研究表明，持续的IFNγ信号可以驱动SARS-CoV-2感染后的慢性纤维化病理。基于我们的分析，我们假设IFNα和IFNγ信号可能在促进长期肺损伤中协同作用。为了避免影响病毒清除，从感染后14天开始，每周给予抗IFNγ±抗IFNαR1单克隆抗体治疗。确实，阻断这两种信号通路导致慢性炎症细胞浸润减少和胶原沉积减少。通过FlexiVent对呼吸阻力和肺顺应性的评估证实，阻断IFNγ和IFNα信号后，气道高反应性和肺纤维化改变显著改善。虽然肺泡巨噬细胞群体保持不变，但我们观察到间质巨噬细胞减少，特别是在MHC II低表达亚群中，据报道该亚群位于血管附近。
鉴于TRH细胞在支持肺中CD8 T细胞和B细胞方面的重要作用，我们还检查了相关群体。与单独抗IFNγ治疗相比，联合抗IFNγ + 抗IFNαR1治疗进一步降低了TRH细胞的比例和绝对数量。同时，纵隔淋巴结中的滤泡辅助T细胞不受影响。在T细胞亚群中与TRH细胞共享转录相似性的Treg在肺中也减少，但在纵隔淋巴结中未减少。
有趣的是，潜在的CD4 T细胞前体群体在年轻和老年宿主中表现出相似的动力学，这表明观察到的TRH（以及可能的Treg）细胞减少可能是肺内的局部现象，而不是TFH细胞的产生或招募减少。
总之，我们的发现强调了干扰素信号在驱动流感病毒感染后老年宿主长期病理中的协同作用。我们确定单核/间质巨噬细胞群体和TRH细胞是这一过程中的重要参与者，为治疗干预提供了潜在途径。
分析细胞-细胞相互作用揭示老年宿主慢性后遗症的机制
采用CellChat根据每个单细胞RNA测序文库中不同细胞类型的配体-受体表达推断细胞-细胞相互作用。比较年轻和老年宿主在相应时间点的情况，我们识别出独特的相互作用。例如，分泌球蛋白3A2已被证明可以保护肺组织免受香烟烟雾诱导的损伤。作为概念验证，我们在感染后61天的年轻宿主中特异性地检测到了“UGRP信号”，即Scg3a2与Marco之间的相互作用。同时，IL-17信号仅在感染后14天和30天的老年宿主中出现。值得注意的是，IL-17产生细胞与成纤维细胞之间的Nrxn3-Nlgn2相互作用持续至感染后61天。在表达Rorc的簇中，表达Il17a的簇在记忆期比例增加。这与流式细胞术数据显示老年肺脏中γδ T细胞升高相一致。结合我们的基因集富集分析结果，这些发现表明，与年轻宿主相比，老年宿主在流感病毒感染后发展出TH1/TH17样特征。
进一步的分析阐明了单核/间质巨噬细胞群体与适应性免疫细胞之间的相互作用。尽管一些相互作用在年轻和老年宿主中都存在，但单核/间质巨噬细胞是“CXCL信号”的主要来源。与先前的报道一致根据病毒清除后进行IFNα/γ信号阻断，发现这种治疗能够改善老年小鼠的长期呼吸功能并减少间质巨噬细胞和组织驻留辅助T细胞数量。CellChat分析进一步揭示了单核/间质巨噬细胞与适应性免疫细胞之间通过CXCL和CCL趋化因子信号以及共刺激分子进行交互的潜在机制。总之，该研究确立了干扰素信号驱动的间质巨噬细胞-组织驻留辅助T细胞轴在老年个体急性病毒感染后慢性肺部病理发生中的核心作用。
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