摘要
背景 接触性运动（包括橄榄球）与更高发病率的神经退行性痴呆相关，原因包括阿尔茨海默病（AD）和慢性创伤性脑病（CTE）等多种潜在病理。新型超灵敏多重免疫分析可能阐明重复性头部撞击（RHI）和创伤性脑损伤后的疾病机制，有望有助于风险分层、早期诊断和痴呆治疗。
方法 ABHC队列中的中年参与者接受了血浆生物标志物定量（NULISA - 核酸连接免疫夹心测定法；n=124种标志物）、3T MRI、创伤暴露评估和表型分析。回归分析量化了暴露特异性蛋白表达、与创伤（包括场上位置）的关系以及脑萎缩，使用聚类分析测试创伤性脑病综合征（TES）的相关因素。
结果 评估了197名前精英橄榄球运动员和33名对照者。24名（12.2%）符合TES标准，但无人患有痴呆症。前运动员血浆胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、激肽释放酶-6（KLK6）和突触小泡相关蛋白25（SNAP25）水平降低。前排球员特别显示出β位点淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（BACE1）、淀粉样蛋白β-38（Aβ38）水平降低和磷酸化tau蛋白181（p-tau181）水平升高。后场球员的KLK6水平低于对照组。未发现生物标志物与职业生涯持续时间、脑震荡负荷或区域性脑体积相关，聚类分析也与TES无关。
结论 前运动员显示出独特的血浆生物标志物变化，在前排球员中更为显著，可能反映了更大的重复性头部撞击暴露。血浆KLK6（一种内皮丝氨酸蛋白酶）在前运动员群体中降低，在未来可能具有诊断或预后价值。前排球员中GFAP和SNAP25降低的基础尚不确定，而p-tau181升高较p-tau217更为明显，这指向非阿尔茨海默病tau蛋白病理。我们的研究结果激励进行纵向表征，包括与其他神经退行性疾病进行比较。
引言
橄榄球联盟参与与神经退行性痴呆发病率增加相关。这在前精英男性橄榄球运动员中约高出2.7倍，归因于重复性头部撞击（RHI）和创伤性脑损伤（TBI）暴露。然而，中年参与的相关因素了解甚少，我们也缺乏可靠的工具来分层评估未来痴呆风险。英国高级脑健康诊所队列研究旨在协助早期痴呆诊断、改善预后、降低风险并帮助开发治疗方法。
在前橄榄球运动员的死后系列研究中已报道了神经退行性病理，慢性创伤性脑病（CTE）——一种与创伤相关的tau蛋白病，在多名个体中存在。然而，前运动员中描述了更广泛的神经病理学，包括阿尔茨海默病（AD）、脑淀粉样血管病、TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）、脑血管疾病、皮质基底变性（CBD）和年龄相关tau蛋白星形胶质细胞病，且病理组合很常见。在2023年的一项大型病例系列中，包括31名主要是业余前运动员，CTE存在于68%的病例中，并与更长的职业生涯相关，但与TBI病史无关。
我们先前已报道前精英橄榄球运动员中血浆阿尔茨海默病标志物磷酸化tau217水平升高。RHI/TBI后的广泛病理学促使测量更广泛的参与神经退行性的蛋白质。最近开发的多重面板（n=120种神经系统蛋白质）使用核酸连接免疫夹心测定法（NULISA，Alamar）提供阿摩尔级敏感性，可能提供有用的机制见解，并已在急性TBI后和AD中揭示了广泛的蛋白质组学变化。
在此，我们旨在描述先前精英橄榄球参与的高维血浆蛋白质组学相关因素。我们假设：（i）前橄榄球运动员与对照组相比会显示血浆神经退行性生物标志物的差异表达；（ii）这些差异将与球员位置相关（前排球员比后场球员暴露更多）；这些球员的职业生涯持续时间更长且TBI暴露更多；（iv）差异表达的蛋白质浓度将与区域性脑体积相关；以及（v）前运动员中生物标志物浓度的聚类将反映前运动员中创伤性脑病综合征（TES）的分类，这是CTE的拟议临床对应物。
方法
高级脑健康诊所研究是一项前瞻性队列，针对因脑健康问题自我转诊的退役精英职业接触性运动运动员。这包括年龄匹配的对照组，无精英运动参与、TBI或实质性RHI暴露史。方法在其他地方有描述（参见在线补充文件）。所有参与者均提供了知情同意，Camberwell和St Giles研究伦理委员会批准了该研究（参考编号7/Lo/2066）。该子研究的排除标准为重大无关神经系统/精神疾病。参与者接受了详细评估，包括半结构化访谈以了解职业生涯史、位置、TBI暴露（BRAIN-Q/Ohio State）、血浆采样、身体评估、3T MRI和TES共识分类。
血浆使用Alamar Biosciences设施（加利福尼亚州弗里蒙特）的NULISA CNS疾病面板，按照标准操作程序进行分析，以产生归一化蛋白表达水平（NPX）。队列中已有先前量化的Quanterix Simoa平台生物标志物数据可供比较。使用Siemens Skyra 3T扫描仪获取T1容积成像数据，使用FreeSurfer计算区域性脑体积。
统计分析在R（4.3.1；Rstudio 2023.09.0+463）中进行。变量通过视觉检查正态性。除非正态性假设被违反，否则使用参数方法进行组间比较。缺失数据通过完整案例方法解决。蛋白倍数变化通过归一化蛋白表达值计算，计算公式为：2ˆ(NPX橄榄球−NPX对照)。使用Limma包进行差异表达分析，采用稳健回归。全程进行FDR校正（p=0.05阈值）。回归中包含年龄、性别和BMI作为协变量，脑成像分析中包含估计的总颅内体积。使用两个聚类进行K均值聚类（见在线补充文件）。NULISA-Simoa相关性使用Spearman进行，Simoa标志物进行log2转换。
本研究基础数据可根据合理请求从通讯作者处获取。
结果
评估了197名前运动员，年龄中位数为44岁（IQR 39-51），主要是男性（90%），以及33名对照者。精英职业生涯中位持续时间为10.0年（IQR 8-13），63%为前排球员（见表1）。运动员在评估时平均退役后13.6年（中位数，IQR 11.0）。所有参与者均有NULISA蛋白质组学数据（见在线补充表1）。
差异表达分析显示，与对照组相比，前运动员血浆激肽释放酶-6（KLK6，倍数变化(FC)=0.80（95% CI 0.72至0.88），Padj=0.001）显著降低，这是一种促炎性蛋白酶；星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，FC=0.77（0.67-0.89），Padj=0.020）；以及突触传递调节因子突触小泡相关蛋白25（SNAP25，FC=0.89 0.84-0.95），Padj=0.030）（见图1和在线补充表1和2）。
按球员位置评估蛋白表达，前排球员与对照组相比血浆磷酸化tau蛋白181（p-tau181，FC=1.35（1.13-1.62），Padj=0.023）显著升高，同时β位点淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（BACE1，FC=0.89（0.82-0.95）] Padj=0.023）、淀粉样蛋白β-38（Aβ38，FC=0.77（0.66-0.90），Padj=0.029）、KLK6（FC=0.79（0.71-0.87），Padj=0.002）、GFAP（FC=0.73（0.63-0.84），Padj=0.002）和SNAP25（FC=0.87（0.81-0.93），Padj=0.003）降低。只有KLK6在后场球员与对照组之间差异表达（FC=0.81（0.73-0.90），Padj=0.014），且前排与后场球员之间无差异（见在线补充表1和2）。在多重比较校正后，未发现职业生涯持续时间或脑震荡负荷的显著蛋白质组学相关因素。
研究标准TES符合12名（24%）前运动员。使用NULISA生物标志物谱对前运动员进行无偏K均值聚类（K=2，51.8%，调整兰德指数=−0.001）未产生类似分类。
在196名（99.5%）前运动员和所有对照者中量化了区域性脑体积（见在线补充表3）。在发现分析中确定的蛋白质浓度与总灰质、白质、海马或脑室体积之间无显著关联。
评估了在NULISA和Simoa平台上量化的血浆蛋白质之间的相关性，返回了GFAP（ρ=0.79)和NfL (ρ=0.83）的强关系，以及中等相关性：p-tau217（ρ=0.56）、淀粉样蛋白β42（ρ=0.57）和淀粉样蛋白β40（ρ=0.49）（所有p<0.001）。
讨论
使用高度多重化的中枢神经系统生物标志物面板，我们识别出前精英橄榄球运动员中独特的血浆蛋白异常。前运动员血浆激肽释放酶-6（KLK6）显著降低，这是一种在淀粉样蛋白前体蛋白、tau蛋白、髓鞘碱性蛋白和α-突触核蛋白处理中起作用的丝氨酸蛋白酶。先前研究表明，阿尔茨海默病患者脑组织中KLK6减少，其表达模式值得注意的是定位在脑血管内皮，这对CTE具有空间重要性。
前排球员显示出比后场球员更广泛的蛋白质组学变化，引发了RHI暴露剂量-反应关系的可能性。这些变化包括血浆p-tau181升高以及BACE1、淀粉样蛋白β-38、SNAP25和GFAP降低。然而，虽然球员位置与蛋白表达相关，但我们未观察到与职业生涯持续时间或脑震荡负荷的显著关联。
在NULISA平台上识别出与淀粉样蛋白（如BACE1、Aβ38）和tau蛋白（p-tau181）代谢相关的蛋白变化，扩展了我们在该队列中的先前工作，该工作发现了血浆p-tau217（Simoa平台）升高。我们的NULISA数据显示，前运动员的p-tau181水平高于p-tau217：这种相对差异的原因尚不确定，但在该面板上的AD谱型中通常不是这样，其中比例通常相反。此外，p-tau217通常在AD过程早期比p-tau181更早出现异常。一种可能性是外周来源的磷酸化tau蛋白，如肌肉或神经，正如在肌萎缩侧索硬化症中所假设的那样，其中血浆中p-tau181显著升高，但脑脊液中没有。
聚类分析中的蛋白质组学特征与研究诊断TES分类并不很好地对应。这可能表明当前标准可能不足以捕捉潜在的生物学异质性，或者仅仅表明我们的队列处于早期/无症状阶段。此外，我们不确定前排球员中观察到的血浆GFAP降低的基础，这与急性TBI、慢性TBI和AD中升高形成对比，在AD中被认为反映Aβ但不反映神经原纤维缠结负担。身体习惯可能影响浓度，但在我们的分析中已考虑到这一点。如果这不是生物来源的，另一种可能性是与使用Alamar面板相关的分析变异性，尽管NULISA GFAP值与先前进行的Quanterix Simoa分析高度相关（ρ=0.79）。同样，此处SNAP25浓度降低的意义尚不确定，与AD中因突触变性而升高形成对比。
这项生物标志物发现工作有几个局限性：研究参与者主要是男性；因此，普遍性不确定，对照组相对于前运动员数量较小。这可能降低了对小生物效应的敏感性。这是横断面研究，纵向随访将有助于阐明异常是否随时间演变并与临床表型相关，受益于与典型神经退行性疾病的计划比较。
总之，我们展示了前运动员中独特的血浆生物标志物变化，涉及淀粉样蛋白β处理，对监测接触性运动运动员脑健康具有重要意义，并突显了大规模蛋白质组学面板的效用。纵向研究对于阐明这些变化的意义以及确定这些中年蛋白质组学特征是否预测临床恶化或代表有效的临床试验目标至关重要。
伦理声明
患者同意发表
不适用。
伦理批准
本研究涉及人类参与者，并获得Camberwell和St Giles研究伦理委员会批准（参考编号7/Lo/2066）。参与者在参与研究前给予知情同意。
致谢
作者感谢研究参与者贡献的宝贵时间，特别是PPIE（患者和公众参与和参与）小组共同设计了该研究。
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