背景
尽管新冠主要是一种急性疾病，但也存在持续性感染的病例，主要发生在免疫功能受损的患者中。有假设认为，至少一些关注变异株（VOCs）是在这种持续性感染病例中产生的，病毒在积累体内突变后"溢出"到一般人群中。此外，越来越多的证据表明，至少在某些情况下，胃肠道（GI）可能是长期感染的储存库。
结果
我们报告了2022年10月从一名HIV阳性、疑似长期新冠感染患者获得的高度分化SARS-CoV-2样本的基因组分析。系统发育分析表明，该样本与最近测序的近亲（2020年9月采集，属于B.1.1谱系，到2022年已基本灭绝）相比，自分化以来获得了89个突变。这些突变中，33个是非同义突变，发生在刺突蛋白上。其中17个是某些VOCs中的谱系定义突变，或位于VOCs中具有谱系定义突变的位点，和/或已被证明参与抗体逃逸，和/或已在其他持续性新冠感染病例中检测到；这些包括一些"常见嫌疑突变"，如Spike:L452R、E484Q、K417T、Y453F和N460K。分子钟分析表明，该谱系的突变累积速率与祖先B.1.1毒株相比有所增加。这种增加是由非同义突变的累积驱动的，平均dN/dS值为2.2，表明在患者体内进化过程中存在强烈的正向选择。此外，存在一些在一般人群样本中罕见但在废水样本中常见的突变，表明病毒至少在一段时间内可能在胃肠道中持续存在。
结论
我们的分析增加了越来越多的证据，表明SARS-CoV-2在慢性感染患者体内的进化可能是新型流行病学重要变异株的主要来源，并指出了胃肠道在长期感染中的潜在作用。
引言
尽管新冠通常是一种持续数天或数周的急性疾病，但已知存在罕见的SARS-CoV-2持续性感染病例，这些病例通常与宿主免疫系统受抑制有关（Choi等，2020；Kemp等，2021；Harari等，2022；Wilkinson等，2022；Stanevich等，2023）。在这种感染中，突变累积贯穿整个疾病过程，且往往比人际传播更快（Leung等，2022；Quaranta等，2022；Stanevich等，2023）。人们假设，在免疫压力减弱的情况下，这种长期突变累积有时允许病毒进化出具有免疫逃逸潜力的有益突变组合，这一机制可以解释关注变异株（VOCs）在长系统发育分支上的出现（Rambaut等，2020；Hill等，2022；Viana等，2022；Neverov等，2023）。某些突变在不同长期感染患者中反复出现；其中一些也是关注变异株（VOIs）或VOCs中的谱系定义突变。这些突变的"热点"主要位于刺突基因；Spike:L452R和E484K是突出的例子（Wilkinson等，2022）。此外，在某些长期感染病例中，刺突蛋白中观察到的取代率增加与Omicron变异株出现相关的刺突蛋白中取代率增加相呼应（Ma等，2022），进一步支持了Omicron起源于持续性感染的假设（Du等，2022）。
虽然SARS-CoV-2主要与呼吸道综合征相关，但它已在各种器官中被检测到（Van Cleemput等，2021；Stein等，2022）。早期对免疫抑制患者体内病毒进化的研究检测到器官特异性突变，其中一些在该患者死亡后出现的VOCs中是谱系定义的（Van Cleemput等，2021）。特别是，胃肠道症状现在被认为是常见新冠症状的一部分（CDC，2020）。与此观察一致的是，通过尸检在一些患者的肠道中检测到病毒RNA（Stein等，2022）。有趣的是，废水测序（可能检测通过胃肠道排出的病毒颗粒）以高频率发现了某些突变，而这些突变在与呼吸道传播相关的普通人群测序中通常罕见（Gregory等，2022）。因此，这些突变可能特别适应胃肠道。此外，有证据表明，至少在某些患者中，病毒在口咽部不再检测到后，仍在胃肠道中持续存在（Natarajan等，2022）。这些发现共同表明，胃肠道可能在至少一些长期新冠患者中充当病毒在急性呼吸道阶段后的储存库。
在此，我们描述了一名HIV阳性患者的病例，该患者在2022年10月被鉴定出具有高度分化的SARS-CoV-2基因型，这可能是极长期感染的结果。有趣的是，该患者最初因胃肠道症状入院。与这些症状一致的是，患者谱系特有的众多突变中包括几个在废水测序中特有的突变，为病毒对胃肠道的适应提供了暗示性证据。此外，患者的样本包含许多与免疫逃逸相关和/或在VOCs中谱系定义的突变。这些观察结果共同为进一步支持VOCs可能起源于具有长期感染的免疫抑制患者的假设提供了依据，并且还表明胃肠道有时可能充当此类感染的储存库。
结果
病例描述
该女性患者于2022年9月因肠易激综合征症状（包括腹泻和肠鸣音）入院，地点为俄罗斯卡卢加市。她未接种过新冠疫苗。初始筛查检测显示，通过鼻咽拭子RT-PCR检测SARS-CoV-2阳性，通过抗原/抗体HIV检测HIV阳性。患者（以下简称"K患者"，代表"卡卢加"；此标识符仅限研究组内人员知晓，仅用于本出版物）自称自2005年起HIV阳性，从未接受过高效抗逆转录病毒治疗（HAART）。患者还伴有干咳和疲劳，但无发热。在住院期间，患者又接受了四次SARS-CoV-2 RT-PCR检测（入院后第3、6、9和13天），结果均为阳性。她近期无旅行史。
尽管诊断为新冠，但患者的X光影像未显示肺部损伤迹象，也不需要氧支持。然而，她的全血计数显示白细胞减少（1.6%-2.2%）和低血红蛋白水平（86-108 g/L）。入院第14天，患者拒绝进一步治疗并自行出院。
2023年4月，患者因腹泻、肌痛、肠鸣音和进行性疲劳再次入院。
位于超长分支上的SARS-CoV-2样本
我们对2022年10月2日（入院后第13天）采集的K患者的新冠样本进行了测序，并将其存入全球流感数据共享倡议组织（GISAID），编号为hCoV-19/Russia/KLU-RII-MH107906S/2022。生物信息学分析强烈表明该样本来自持续性感染。具体而言，UShER工具将该样本归类为B.1.1谱系。到2022年底，该谱系已近乎灭绝：除本报告的变异外，2022年9月1日后收集的GISAID序列中仅占0.004%（549/12,648,328），且在当时俄罗斯收集的76,460个序列中仅占0.06%（5/76,460）。为验证该样本在B.1.1分支中的系统发育定位，我们考虑了其他工具：pangoLEARN和NextClade。后者使用与UShER类似的方法，而前者采用完全不同的机器学习方法。两者均同意最可能的定位是B.1.1。
尽管该样本在早期B.1.1分支中定位可靠，但其谱系高度分化，自与其最近共同祖先（LCA）分化以来获得了89个点突变。这个最近的邻居hCoV-19/Russia/MOW-CSP-KOM-0303_S25/2020于2020年9月23日在俄罗斯莫斯科采集。更广泛地说，在14个系统发育邻近样本中，13个于2020年7月16日至2021年6月4日期间在俄罗斯获得，确认该谱系可能起源于估计内部节点时间左右的社区感染。根据贝叶斯估计，K患者分支的中位年龄为2.1年，90%最高后验密度（HPD）为1.8至2.3年。这将其祖先的日期定在2020年8月底，与最近外群序列的定年一致。这些观察结果强烈表明，这确实是一例持续性（长达2年或更久）SARS-CoV-2感染。由于我们仅从K患者处获得一个样本，因此该谱系中一些独特的突变可能发生在先前未测序的宿主中。然而，考虑到长期循环的谱系会被采样，一般人群中累积的突变可能构成了患者K谱系中突变的少数，甚至没有。
长期感染：突变数量的最可能解释
在没有患者的时间序列样本的情况下，我们通过首先证明它不可能是正常进化速率下一系列未检测到的社区感染的结果，并且其次排除可能导致"长分支"观察的另外两种可能性（即污染和重组），来确定长期感染是所观察到的高数量突变的最可能解释。
患者K谱系中观察到的89个突变与一系列社区感染不一致。为证明这一点，我们使用BEAST估算了俄罗斯B.1.1谱系在患者K谱系之外的进化速率。与其他估计一致（Hill等，2022；Markov等，2023），该速率为4.07×10^-4（95% HPD 3.32-4.83×10^-4）个核苷酸每年每核苷酸取代。然而，如果患者K谱系也以该速率进化，这将意味着它在2022年采样前7.36年就已从与其他B.1.1样本的最近共同祖先分化。该定年明显与患者K谱系在2020年起源的B.1.1内的系统发育定位不一致（p < 0.0001），甚至与2019年SARS-CoV-2本身的起源不一致（Pagani等，2023）。这种不一致性表明患者K谱系的主体一直在加速状态下进化，意味着它不能对应一系列社区感染。该谱系起源于慢性感染的假设进一步得到了其升高的取代率的支持。
我们通过观察到该样本没有中间读取频率的变异体过剩来排除污染。特别是，在样本中观察到的104个核苷酸点突变和插入缺失（即>0.5的读取支持它们）中，只有少数具有中间读取频率：只有10个的读取分数<0.8，其中只有2个的读取分数<0.6。
为查看观察到的序列是否可能是重组事件的结果，我们通过sc2rf运行它以查找CoVariants谱系之间重组的证据。作为替代方法，我们使用了RIPPLES。两种方法均未检测到任何重组事件。不同VOCs和非VOC突变的"交错"，以及在VOC定义突变位点处存在非VOC衍生等位基因，也与涉及系统发育距离较远谱系的重组事件导致序列的假设相矛盾。
患者K样本中升高的突变累积率
我们使用TempEst绘制了患者K样本和包含它的UShER选择子树中序列自与武汉祖先序列分化以来累积的突变数量。突变累积率在2022年初"急剧"上升，对应于Omicron变异株起源时不成比例的大量变化（Du等，2022；Ma等，2022）。值得注意的是，患者K样本（红点）落在与同时获得的"BA.2"样本对应的Omicron云的高端，尽管它属于进化慢得多的B.1.1谱系。因此，患者K样本谱系中的突变累积率与Omicron分支起源时的速率相当。值得注意的是，尽管速率相似，但累积突变的特性不同：患者K样本与BA.2共享的突变很少。患者K谱系进化的中位后验速率为15×10^-4（90% HPD 12-18×10^-4）个核苷酸每年每核苷酸取代，是其他B.1.1样本的3.7倍，再次证实该谱系起源于慢性感染。
单核苷酸取代是非同义的（83%），与在免疫功能受损患者样本和VOCs祖先分支中观察到的值相似（Harari等，2022）。为评估患者K样本的快速进化是否由正向选择引起，我们应用了HyPhy中实施的分支-位点不受限制的表型多样化统计测试（BUSTED）方法。我们检测到患者K样本分支上整个串联编码序列（排除具有重叠读码框的核苷酸位置；患者K样本分支的dN/dS=2.2，而B.1.1树的其余部分为0.6，p=0.04）和刺突蛋白（dN/dS=5.7 vs. 0.7，p=0.0034）的正向选择。在患者K分支上观察到的正向选择（dN/dS > 1）与SARS-CoV-2全球进化中观察到的主要负向选择（dN/dS < 0.5）形成对比（Rochman等，2021）。因此，患者K分支上突变累积率的增加可能是由该分支特有的正向选择驱动的，主要作用于刺突蛋白中的突变。
刺突蛋白中的突变是长期感染、免疫逃逸和VOCs的典型特征
在样本的89个特有突变中，33个发生在刺突基因中，另有两个框内缺失。其中包括17个点突变，这些突变已在VOCs中或在VOCs中发现突变的位点中被看到，和/或在免疫功能受损患者中，和/或与免疫逃逸相关。这些突变包括L452R、E484Q、K417T、N460K和Q498H。除刺突蛋白外，该序列还具有几个与超突变、慢性感染序列相关的ORF1a突变，最显著的是T1638I（NSP3:T820I）和K1795Q（NSP3:K977Q）；后者还在纽约市（NYC）废水隐秘谱系中被识别，在其中一些谱系中其比例接近100%（Gregory等，2022）。这些突变可能构成了病毒对宿主免疫系统选择压力的响应。
除点突变外，该样本还在S基因中包含两个缺失：Δ141-144和Δ210。它们发生在McCarthy等（2021）命名法中NTD的四个反复缺失区域（RDRs）中的两个（RDR2和RDR3）中，并映射到不同的抗体表位（Wilkinson等，2022），与VOCs中的缺失重叠或相邻：Alpha（Δ144）和Omicron/BA.1（Δ211）（Mittal等，2022）。
该表列出了在某些VOCs中谱系定义的突变，或在VOCs中谱系定义的位点上的突变，和/或显示参与抗体逃逸的突变，和/或在其他持续性新冠感染病例中检测到的突变，和/或是废水样本的特征（见方法）。对于后三组，表单元格列出了相应的参考文献。
S基因中的其他突变包括H49R、H66Q、G72R、V126A、G181E、F186I、L216F、A222D、Y248H、Q271R、A372T、R765L、V772A、T1006I、A1078S和D1165E。
胃肠道与回归？
患者K序列中刺突受体结合域（RBD）突变的模式与在废水中检测到的"隐秘谱系"中反复发现的突变集合显示出显著重叠（Gregory等，2022），这些谱系被假设为具有胃肠道趋向性的长期慢性感染。其中一些也在VOCs中被发现，例如K417T（Gamma）、K444T（BQ.1）和N460K（BA.2.75、BQ.1、XBB），而其他突变在废水反复出现但在GISAID中罕见。一个例子是Spike:Q498H，它在GISAID中仅在96个序列中被发现（2022年12月22日访问），但在Gregory等（2022）研究的9个下水道系统中的7个中被发现（同一位置的另一种取代Q498R存在于多个Omicron谱系中，因此广泛传播）。这与患者表现出胃肠道症状的事实一致。值得注意的是，在K患者感染前后，K444T、N460K和Q498H在GISAID中的频率非常低（截至2022年3月15日分别为0.0023%、0.0026%和0.0006%），使它们在同一基因组中共存的可能性微乎其微，增加了这些突变构成胃肠道适应的可能性。
此外，Spike中密码子828的双突变（CTT→TTG）特别值得关注。在假定的长期宿主体内进化过程中，序列可能经历了中间状态TTT（Spike:L828F），随后是F828L回复突变为不同的亮氨酸密码子。L828F之所以引人注目，是因为它在废水隐秘谱系中反复出现，而在一般SARS-CoV-2序列（几乎全部从呼吸道采样）中极为罕见（Gregory等，2022）。我们提出L828F可能代表在慢性感染期间对胃肠道的特定适应。基于这一假设的事件链以及上述与废水中反复发现的其他突变的重叠，我们建议在感染的长期过程中，病毒在患者胃肠道内存在并适应了一段时间。然而，最终，828L回复恢复了共识序列，可能更适合鼻咽部定位，病毒最终在鼻咽部被检测到。诚然，这一建议的机制高度推测性：828F变异本身未在患者K样本中观察到，双突变CTT→TTG可能通过同义（L）CTG而不是非同义（F）TTT中间体进行，并且GI适应变异向鼻咽部定位的反向转移途径尚不清楚。尽管如此，这一发现为进一步的间接证据增加了可能性，即某些慢性感染可能是胃肠道的（可能解释隐秘废水谱系）。目前，由于这些谱系传播证据不足，人们认为此类胃肠道慢性感染可能代表进化死胡同。然而，在此序列中，我们发现该病毒已重新适应回呼吸道的初步证据，为这种病毒如何重新进化以通过空气传播提供了潜在机制。
与B.1祖先相比在细胞培养中生长受损
为寻找特定表型适应的标记，我们从患者K拭子标本中分离出病毒（KLU，序列存入GISAID，编号为EPI_ISL_18647516），并比较了KLU病毒和祖先B.1毒株在人肠上皮细胞系Caco-2（ATCC，编号HTB-37）中的生长率。首先，我们检查了三种不同剂量（0.1、0.01和0.001 TCID50/细胞）和两种培养温度（34°C和37°C）。两种病毒的生长率温度依赖性相同，表明KLU病毒对上呼吸道感染部位的适应未丧失。其次，我们检查了培养基的三种不同pH值：中性pH=7.5、酸性pH=6.5和碱性pH=8.5。两种病毒的生长率pH依赖性相同，中性和低pH之间无差异，高pH下生长受损，这与KLU病毒对胃肠道潜在不同环境适应的预期相反。对于两种病毒，在任何时间点均未观察到细胞病变效应。同时，我们发现与B.1毒株相比，KLU病毒在Caco-2模型细胞系中的生长总体显著受损。观察到的差异与早期对Omicron毒株的描述相似，可能与各种机制有关。首先是早期SARS-CoV-2谱系与Omicron相比，TMPRSS2依赖性细胞进入效率更高（Meng等，2022；Willett等，2022）。我们在Calu-3细胞中重复了生长曲线实验，其TMPRSS2表达水平与Caco-2不同（Shuai等，2020）。总体而言，与Caco-2细胞相比，两种病毒株在Calu-3中的生长略有增加；然而，在Calu-3中获得了几乎相同的菌株差异，即KLU毒株与B.1病毒相比生长率降低。KLU毒株劣势的第二个可能解释可能是其由于某些病毒蛋白的突变，对抗人细胞干扰素反应的效果较差（Mautner等，2022）。
讨论
越来越多的证据支持这样一种假设，即至少一些VOCs，如Alpha和Omicron，是在慢性感染患者体内进化并逃逸到一般人群中的（Rambaut等，2020；Hill等，2022；Viana等，2022）。我们描述了一例HIV阳性患者的可能长期感染病例。该样本于2022年采集，最可靠地定位在B.1.1分支中，该分支在当时已基本灭绝。除指示长期感染的长分支外，该样本的显著特征还包括存在定义几个VOC谱系和/或与免疫逃逸相关的突变，以及明显升高的突变累积率。事实上，该速率与Omicron谱系起源时的速率相似，表明塑造其进化的进化过程可能与塑造Omicron变异株进化的过程相似，反之亦然，进一步支持VOCs如Omicron是在慢性感染过程中出现的假设（Moulana等，2022）。
研究表明，VOCs中许多谱系定义突变与抗体逃逸相关（在大流行后期的免疫能力人群中提供选择优势），但其中至少一些降低了RBD对ACE2的亲和力，这种效应在BA.1中通过补偿性突变Q498R和N501Y得到挽救（Moulana等，2022）。我们的样本中未观察到这两种突变，尽管它包含498密码子的另一种突变，即Q498H。Q498H在GISAID中的罕见性表明它可能不负责空气传播，尽管实验已证明它在非N501Y刺突背景下增加了ACE2亲和力。此外，Y453F突变在BA.1和BA.2以及Wuhan Hu-1背景下都大大增加了ACE2亲和力，而R403K在BA.2刺突背景下显著增加了ACE2亲和力，但在BA.1或Wuhan Hu-1刺突背景下没有。由于此样本与BA.1和BA.2共享突变，理论上可能存在增加的传染性。
我们研究的主要局限性是它仅基于从该患者获得的单一样本。因此，无法通过在整个假定感染期间重复阳性PCR测试来验证病毒的持续性。相反，持续感染的证据是间接的，基于患者可能免疫抑制（HIV阳性）状态以及该样本的系统发育定位。
同样，缺乏关于患者新冠感染历史（或缺乏历史）的信息，以及病毒社区传播的最终缺乏证据，限制了我们得出关于其在"野外"逃避免疫反应能力的任何明确结论，超出由存在许多与免疫逃逸相关的突变所暗示的理论可能性。
非同义突变比例的增加表明患者K谱系中存在强烈的正向选择，特别是在刺突蛋白中。采样的病毒基因组的特征是存在先前在持续感染个体中观察到的突变。此外，患者K样本的一个引人注目的特征是存在几个几乎仅在废水谱系中发现的突变。这一观察结果暗示了在胃肠道中持续一段时间的可能性。重要的是，这一建议基于高度间接的证据，并被我们发现缺乏生长率的pH依赖性所反驳，这在胃肠道适应下可能是预期的。无论如何，此样本中观察到的免疫逃避免疫长期感染、胃肠道症状和VOCs出现风险之间的联系，突显了废水监测的必要性。
截至2025年2月18日，hCoV-19/Russia/KLU-RII-MH107906S/2022样本仍然是GISAID中该谱系的唯一代表，尽管GISAID携带92,865个来自俄罗斯的额外样本，包括642个来自卡卢加地区的样本，其中278个采样日期更晚。结合病毒已从长期进化可能来源（HIV阳性患者）采样的事实，这表明该谱系未导致大量后续传播。尽管如此，它表明SARS-CoV-2尚未耗尽进一步适应的机会。
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