摘要
帕金森病(PD)患者胃部的α-突触核蛋白(AS)积累比结肠更为常见，表明其作为病理生物标志物的潜力。本研究旨在评估胃活检组织中实时震荡诱导转化(RT-QuIC)检测对早期PD的诊断效能及其与临床特征的关联。研究前瞻性地收集了22名早期PD患者和17名对照者的胃活检组织。评估了病理AS播种活性，并在调整年龄后分析了运动学参数与临床特征的相关性。在45.5%的PD患者中检测到病理AS播种活性，而对照组中均未检测到。调整年龄后，蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分与阳性重复样本的滞后时间呈正相关(Spearman's ρ = 0.742; p = 0.022)。使用胃组织的AS种子扩增检测可能作为反映PD肠-脑轴疾病病理生理学的生物标志物。
引言
目前帕金森病(PD)的临床诊断主要依赖于医生评估和既定诊断标准的应用。然而，PD的确诊只能通过死后尸检确认¹。因此，长期以来一直需要开发可靠的生物标志物，以帮助确认诊断并监测疾病进展。此外，PD的早期或前驱期诊断对于疾病修饰疗法的开发和有效实施至关重要，这突显了生物学生物标志物日益重要的地位²,³。
PD的特征性病理标志是路易小体和神经突的存在，其主要成分为α-突触核蛋白(AS)的聚集。AS积累也已在包括胃肠道(GI)、皮肤和颌下腺在内的外周组织中被识别⁴，这表明其作为体内病理生物标志物的潜力。然而，通过活检进行病理确认的诊断效用因敏感性低而受限。
实时震荡诱导转化(RT-QuIC)检测是一种通过扩增其播种活性来检测病理蛋白的高敏感性技术⁵。因此，RT-QuIC检测可以提高在外周组织中检测病理AS播种活性的敏感性。迄今为止，RT-QuIC研究已在各种组织类型上进行，包括皮肤⁶⁻¹¹、嗅粘膜¹²,¹³、颌下腺¹⁴和胃肠道¹⁵⁻¹⁷。基于这些结果，皮肤AS RT-QuIC检测已被提议作为PD生物定义的潜在工具之一²,³。
胃肠道不仅是检测外周AS积累的部位，还通过密集的神经连接和通讯在PD病理生理学中发挥重要作用，这种关系通常被称为肠-脑轴¹⁸。肠道微生物组的改变可诱导毒性环境变化，促进肠道壁的炎症状况和随后的AS积累¹⁸。这些病理变化甚至在PD症状明显表现之前就被观察到¹⁹。此外，神经病理学的疾病进展与胃肠道中AS积累的频率相关²⁰。
鉴于此背景，使用RT-QuIC检测测量胃肠道中的AS积累有可能成为疾病进展和病理生理学的生物标志物。然而，胃肠道的RT-QuIC研究报告的病理AS播种活性阳性率各不相同，范围从10%到95.7%¹⁵⁻¹⁷,²¹。此外，尽管有少数研究评估了参与者的临床特征¹⁵,²¹，但均未评估认知功能。
因此，本研究旨在评估使用早期PD患者胃活检的RT-QuIC检测的诊断准确性，并调查其与各种临床特征的关联。
结果
共招募了22名PD患者和17名健康对照者。所有参与者的临床特征总结在表1中。PD患者从运动症状发作到活检的平均时间为2.1±1.1年(均值±标准差)。8名患者(36.4%)为右侧优势，10名患者(45.5%)为左侧优势，3名患者(13.6%)为双侧优势。关于PD亚型，14名患者(63.6%)被归类为运动迟缓-强直型，6名(15.4%)为震颤优势型，1名(4.5%)为混合型。
表1 帕金森病患者与对照组的临床特征
PD患者的MDS-UPDRS III部分运动评分平均为15.6±7.8，所有患者均处于HY 2期或以下(HY 1期：7例[31.8%]；HY 2期：15例[68.2%])。非运动症状评估得分如下：MoCA 25.4±3.8；FAB 15.9±2.1；GDS 10.2±6.1；NMSS 15.5±14.4；嗅觉识别测试(Brief Smell Identification Test)5.6±2.3；RBDSQ 3.0±2.9。在PD患者中，4例(18.2%)被诊断为快速眼动睡眠行为障碍(RBD)，6例(27.3%)出现直立性低血压。PD患者的左旋多巴等效日剂量(LEDD)为352.3±193.2 mg。根据这些评估，2名患者符合PD轻度认知障碍(PD-MCI)的一级诊断标准²²。
PD患者和对照者胃活检中的病理AS播种活性
使用RT-QuIC检测评估的病理AS播种活性总结在图1、图2和补充表1中。在10名PD患者(45.5%)中检测到AS播种活性，而在健康对照者中均未检测到(0%；p=0.001)。一名PD组患者仅在一个孔中呈阳性，被归类为病理AS播种活性阴性。因此，RT-QuIC检测的敏感性和特异性分别为45.5%和100%。在PD+AS组中，平均滞后时间为36.0±5.4小时，平均蛋白聚集率(PAR)为0.0287±0.0042(图2A、B)。
图1：PD患者和对照者胃活检中的病理AS播种活性
病理AS播种活性在10名(45.5%)PD患者中呈阳性(A)，但在对照者中均呈阴性(B)。该图显示了每位参与者四个孔的平均荧光值，这些值可能低于已确认阳性病例中具有病理AS播种活性的孔的实际值。由于各分析板使用的阳性阈值不同([板1：26,168]、[板2：25,680]、[板3：28,837])，图中未标记阳性阈值。AS：α-突触核蛋白；RT-QuIC：实时震荡诱导转化；PD：帕金森病。
图2：PD患者RT-QuIC检测的动力学参数特征
PD患者四个孔的AS播种检测的平均(A)滞后时间和(B)PAR在PD患者和对照者之间存在显著差异。详细代表性值见补充表1。在PD+AS组中，MoCA评分与(C)滞后中位数1(Lagmed1)和(D)滞后中位数2(Lagmed2)均呈正相关，且在调整活检时年龄后仍显著。**p值<0.01。AS：α-突触核蛋白；RT-QuIC：实时震荡诱导转化；PAR：蛋白聚集率；PD：帕金森病；MoCA：蒙特利尔认知评估量表；Lagmed1：每个阳性重复的滞后时间中位数；Lagmed2：每个阳性检测中达到阈值的前两个重复的中位数。
PD+AS组与PD-AS组的临床差异
PD+AS组(10名患者)与PD-AS组(12名患者)之间临床特征的差异总结在表2中。两组在人口统计学特征、运动症状优势侧、PD亚型或运动和非运动症状评估得分方面均无显著差异。NMSS域得分的详细比较(补充表2)显示，PD-AS组的NMSS域6：胃肠道评分(0.6±0.8)略高于PD+AS组(0.1±0.3)，但这种差异未达到统计学意义(p=0.072)。在2名PD-MCI患者中，1名被归类到PD+AS组，另1名被归类到PD-AS组。
表2 PD+AS组与PD-AS组临床特征比较
PD+AS组中动力学参数与临床特征的相关性
PD+AS组内的相关性分析(表3)显示，MoCA评分与Lagmed1(Spearman's ρ=0.742；p=0.014)和Lagmed2(Spearman's ρ=0.762；p=0.010)呈正相关(表3，图2C、D)。调整活检时年龄后，偏Spearman相关分析显示MoCA评分与Lagmed1(偏Spearman's ρ=0.738；p=0.023)和Lagmed2(偏Spearman's ρ=0.742；p=0.022)存在统计学上显著的正相关。NMSS域6：注意力/记忆也与Lagmed1相关(Spearman's ρ=-0.647；p=0.043)，但在年龄调整后不显著(偏Spearman's ρ=-0.616；p=0.078)。
表3 PD+AS组(n=10)动力学参数与临床特征的相关矩阵
讨论
本研究中，45.5%(10/22)的PD患者胃活检中观察到病理AS播种活性。先前研究胃肠道RT-QuIC的阳性率如下：Fenyi等人使用胃窦、乙状结肠或直肠的活检组织发现55.5%(10/18)的阳性率¹⁷；Vascellari等人报告使用十二指肠活检的阳性率为95.7%(22/23)¹⁵；Emmi等人观察到使用十二指肠活检的阳性率为40.1%(9/22)，使用胃活检的阳性率为59.1%(13/22)²¹；Shin等人记录使用胃手术标本的阳性率为10%(2/20)¹⁶。
这些矛盾的结果可能归因于多种因素。首先，患者队列的临床特征可能影响了结果。Vascellari等人研究中PD患者的平均病程为14±5年。相比之下，Shin等人¹⁶和本研究中PD患者的病程分别为2.7±5.1年和2.1±1.1年，表明处于PD早期阶段。值得注意的是，在Emmi等人的研究中，患者被分为早期PD(中位病程5.5年)和晚期PD组，后者包括经历运动波动并接受经皮左旋多巴空肠内输注治疗的患者(PD诊断后病程未说明，为11.5年)²¹。在该研究中，早期PD患者十二指肠和胃活检的阳性率分别为20%和50%，而在晚期PD患者中分别增至58.3%和66.7%。此外，病理学研究表明，胃肠道中AS积累的程度与大脑中AS病理的进展相关²³,²⁴，且PD患者病程越长，AS积累的程度越高²⁰。这些患者队列特征可能促成了研究间阳性率的差异。
另一个可能的解释是头尾梯度，即AS在胃肠道中的分布模式²⁰,²⁵,²⁶。头尾梯度指胃肠道近端部分(包括食管和胃)中AS积累的频率高于远端部分(包括结肠和直肠)。这一特征是本研究聚焦于胃活检的关键原因。Fenyi等人也通过分析胃肠道多个区域识别出这一梯度¹⁷。在他们的研究中，从胃窦取样的组织在两名患者中均检测到AS扩增，而乙状结肠和直肠组织的检测率分别为58%(7/12)和25%(1/4)。然而，重要的是考虑各区域样本量有限以及该研究中缺乏疾病持续时间数据。此外，需要进一步研究来确认头尾梯度是否仍然存在，因为RT-QuIC检测的高灵敏度可能会掩盖这一特征。
最后，组织处理和保存方法也可能导致这些差异。在Shin等人的研究中，使用了福尔马林固定、石蜡包埋的胃肠道组织¹⁶。福尔马林固定、切片和脱蜡过程可能影响AS种子的丢失。这一点得到了一项病理学研究的支持，该研究显示使用帕金森病患者石蜡包埋皮肤组织进行AS免疫荧光检测的阳性率低于使用冷冻组织²⁷。
RT-QuIC检测在其他解剖部位的诊断准确性显示不同结果。使用皮肤和脑脊液(CSF)的RT-QuIC检测研究分别显示出0.92和0.90的汇总敏感性²⁸。此外，最近使用血清的RT-QuIC检测显示出80.5%至98.8%的高敏感性²⁹⁻³¹。因此，如果仅考虑诊断准确性，胃肠道的RT-QuIC检测作为PD患者生物标志物的潜力可能低于使用其他解剖部位的检测。
本研究采用前瞻性设计，在活检时对PD患者的多种运动和非运动症状进行临床评估。这些评估使我们能够评估它们与病理AS播种活性的关联。有趣的是，在PD+AS组中，滞后时间参数(Lagmed1和Lagmed2)与MoCA评分表现出强大的相关性，即使在调整年龄后也是如此。这些动力学参数被认为比简单的平均滞后时间更能准确反映病理AS播种活性³²。最近，Mastrangelo等人进行了一项涉及重复CSF采样的纵向研究，表明在无症状路易体病(LBD)参与者中，Lagmed1和Lagmed2随时间推移而逐渐下降³³。此外，在整个队列(风险比[HR]=0.91)和PD亚组(HR=0.87)中，较短的基线滞后时间(Lagmed1)与痴呆风险增加相关。同样，在整个队列(HR=0.76)和PD亚组(HR=0.69)中，随时间推移滞后时间的更大减少(Lagmed1)也与痴呆风险增加相关³³。另一项CSF RT-QuIC研究也显示，在PD和路易体痴呆患者中，滞后时间与MoCA评分呈正相关³⁴。与这些基于CSF的研究一致，本研究结果首次提供了PD患者胃活检病理AS播种活性与认知功能之间关联的证据。
从肠-脑轴的角度看，认知功能下降与胃部病理AS播种活性程度之间的观察到的关联可能反映与PD中"身体优先"进展模型一致的模式³⁵。然而，PD+AS组和PD-AS组之间在通常与身体优先模型相关的其他临床特征(如运动不对称性、PD亚型、RBD、胃肠道症状、直立性低血压和嗅觉丧失)上没有差异，且这些特征与播种活性无关。因此，很难得出结论认为当前发现完全支持身体优先进展模型。鉴于样本量小，应谨慎解释结果。然而，MoCA评分与病理AS播种活性之间的强相关性表明，胃部病理AS积累可能作为PD患者认知功能的生物标志物。
先前关于胃肠道病理AS播种活性与PD患者临床表现相关性的研究报道了不同的结果。Vascellari等人报告病理AS播种活性与UPDRS III部分运动评分、便秘评分或疾病持续时间之间无相关性¹⁵。相反，Emmi等人识别出某些与病理AS播种活性相关的临床关联²¹。具体来说，当根据十二指肠活检的阳性RT-QuIC结果进行分层时，阳性结果的患者病程较长。此外，当根据阳性胃活检结果进行分层时，阳性组表现出更高的HY分期和运动障碍学会非运动评分量表总分更高。然而，由于这些研究未包括认知评估，与本研究的直接比较受到限制。
解释本研究结果时应考虑以下局限性。首先，样本量较小。因此，在解释结果时，特别是关于其与临床表现的关联时，应谨慎。其次，未评估其他帕金森综合征，如多系统萎缩或进行性核上性麻痹。这些局限性限制了对AS RT-QuIC检测作为生物标志物的诊断潜力的评估。此外，未进行脑部成像研究，如多巴胺转运体成像。因此，无法评估脑部病变与胃部病理AS播种活性之间的关联。最后，本研究未评估与阿尔茨海默病相关的生物标志物，如淀粉样蛋白成像或液体生物标志物。因此，无法确定观察到的认知功能下降是否与潜在的阿尔茨海默病病理相关。需要进一步专门设计的研究来调查认知功能与病理AS播种活性之间的关联。
总之，使用胃活检组织的RT-QuIC检测在早期PD患者中显示出中等阳性率。AS播种活性的滞后时间与PD患者的认知功能呈正相关。这些发现表明，使用胃组织的AS种子扩增检测可能作为反映PD肠-脑轴疾病病理生理学的生物标志物。需要使用大规模纵向队列的进一步研究来验证其作为PD患者胃活检病理生物标志物的潜力。
方法
研究设计与参与者
2022年11月至2023年8月期间，从首尔国立大学医院(SNUH)前瞻性招募PD患者和健康对照者。参与者的纳入标准为：(1)年龄≥45岁；(2)基于运动障碍学会PD临床诊断标准¹的PD诊断。排除标准为：(1)经确认遗传异常的家族性PD；(2)显著认知下降或提供知情同意能力受损；(3)正在服用口服抗凝剂；(4)因胃肠道状况无法进行胃组织活检；(5)研究者认为不适合参与的个体。
健康对照者的纳入标准为：(1)年龄≥45岁；(2)无神经系统疾病。对照者的排除标准为：(1)正在使用口服抗凝剂；(2)因胃肠道状况无法进行胃组织活检；(3)研究者认为不适合参与的个体。
所有招募的参与者均接受胃内窥镜活检。对PD患者进行综合临床评估。研究方案获得SNUH机构审查委员会批准(编号：2109-096-1255)。所有参与者在招募时均签署书面知情同意书。
临床评估
本研究中入组的PD患者使用运动障碍学会赞助修订的统一帕金森病评定量表(MDS-UPDRS)³⁶和改良Hoehn和Yahr(HY)分期³⁷评估帕金森症状严重程度。根据MDS-UPDRS评分，确定患者运动症状的优势侧(双侧优势、左侧优势或右侧优势)。基于先前研究，PD亚型分为运动迟缓-强直型、震颤优势型或混合型³⁸。使用左旋多巴等效日剂量(LEDD)³⁹计算患者服用的药物剂量。使用蒙特利尔认知评估量表(MoCA)⁴⁰和额叶评估量表(FAB)⁴¹评估认知功能。MoCA是一种广泛使用的认知筛查工具，评估各种认知域，包括视空间/执行功能(5分)、命名(3分)、注意力(6分)、语言(3分)、抽象(2分)、延迟回忆(5分)和定向(6分)，总分为30分。研究表明，它是评估PD患者认知功能的可靠且适当的工具²²。为评估非运动症状，使用非运动症状量表(NMSS)⁴²、老年抑郁量表(GDS)⁴³和快速眼动睡眠行为障碍筛查问卷(RBDSQ)⁴⁴。PD患者的RBD通过RBDSQ评分≥6确定⁴⁴。使用简式嗅觉识别测试(Brief Smell Identification Test，Sensonics International，NJ，USA)评估嗅觉功能障碍。直立性低血压定义为站立5分钟后血压下降至少20/10 mm Hg。两名(9.1%)患者未测量直立性低血压。
标本采集
临床评估后，参与者在SNUH内科消化科接受内窥镜检查和活检。从每位参与者获取四份胃活检标本(胃底和胃窦各两份)。我们根据先前研究中显示头尾梯度的AS积累区域分布模式选择活检部位²⁰,²⁵,²⁶。收集的组织样本置于含有磷酸盐缓冲液的Eppendorf管中，并在-80°C下储存。储存的活检组织被送往韩国脑研究所，并按后续描述进行RT-QuIC检测处理。为分析胃部更近端区域，使用来自胃底的两份活检标本的合并样本进行RT-QuIC检测。胃窦样本被保留用于潜在的未来研究。在此阶段，所有组织均被匿名化，以确保RT-QuIC检测期间进行盲法评估。
胃匀浆制备
如前所述⁵处理从临床疑似PD或非PD对照患者获得的冷冻胃组织。简而言之，使用Precellys 24组织匀浆器(Bertin Instrument，Montigny-le-Bretonneux，法国)将约10-20 mg胃组织在含完全EDTA-free蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche Applied Science，Penzberg，德国)的19体积磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中匀浆。将所得5%(w/v)匀浆在2000×g下澄清2分钟后分装保存在-80°C。
RT-QuIC检测
如前所述⁴⁵进行检测病理AS播种活性的RT-QuIC检测，并进行了小幅修改。该方法开发用于检测路易体痴呆和PD患者死后脑组织中的AS病理扩增，并在先前研究中显示出一致可靠的结果⁵,¹⁶,⁴⁶。实验当天，将5%胃匀浆超声处理⁵并在匀浆缓冲液中连续稀释至0.1%(10⁻³稀释)。使用重组全长人野生型AS(rPeptide)作为底物。RT-QuIC反应使用预装四个玻璃珠(直径1.0-1.25 mm)的96孔黑色板(底部透明，Nalgene Nunc，NY，USA)以四重复进行。每个孔加入100 μL反应混合物，包含2 μL 10⁻³稀释的胃匀浆、0.1 mg/mL重组AS、10 μM硫黄素T、170 mM NaCl、0.00125%十二烷基硫酸钠(SDS)和40 mM磷酸盐(pH 8.2)。将板在FLUOstar Omega板读数仪(BMG Labtech，Ortenberg，德国)中于37°C孵育，交替进行1分钟震荡(400 rpm，双轨道)和1分钟静止循环，持续约50小时。从孔底测量硫黄素T荧光相对荧光单位(440 nm激发和480 nm发射，增益1,900；每孔20次闪光)，每1小时测量一次。当四个重复中至少两个超过荧光阈值时，样品被视为AS播种活性阳性。阈值定义为所有样品前五次测量的平均荧光加上七个标准差(SDs)。患者和对照者的样品随机分布在三个板上，并使用一批重组AS蛋白进行RT-QuIC检测。每个板设置不同的荧光阈值(板1—26,168；板2—25,680；板3—28,837)。
统计分析
比较PD患者与健康对照者的临床特征和RT-QuIC检测结果。为评估病理AS播种活性的动力学特征，计算滞后时间(每次运行达到荧光阈值所需时间)和蛋白聚集率(PAR，滞后时间的倒数)⁴⁷,⁴⁸。进行亚组分析，比较AS阳性(PD+AS)和AS阴性(PD-AS)患者的临床特征。连续变量使用Student's t检验，二项变量使用Pearson's卡方检验。当参数检验的假设不满足时，使用兼容的非参数检验。我们进一步计算了Lagmed1(每个阳性重复的滞后时间中位数)和Lagmed2(每个阳性检测中达到阈值的前两个重复的中位数)。最近研究表明，这些动力学参数与路易体病(LBD)分期和痴呆发展相关³²,³³。使用Spearman等级相关系数评估PD+AS患者中动力学参数与临床特征之间的相关性。对相关分析中显著变量进行年龄调整时使用偏Spearman等级相关。所有统计分析均使用SPSS 30.0.0.0版(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)和R 4.4.3版(R Core Team，2024)进行。统计显著性设定为p<0.05。
数据可用性
本研究期间生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。
讨论
本研究通过胃活检组织的RT-QuIC检测，在早期PD患者中观察到45.5%的病理AS播种活性阳性率，而对照组为0%。这一阳性率低于Vascellari等人在病程较长的PD患者中报告的95.7%¹⁵，但高于Shin等人在胃手术标本中报告的10%¹⁶，这可能反映了疾病阶段、取样部位和组织处理方法的差异。
研究的关键发现是，胃部病理AS播种活性的滞后时间与认知功能(MoCA评分)呈显著正相关，即使在调整年龄后依然成立。这一发现具有重要临床意义，因为它首次建立了胃部AS病理与认知功能之间的直接联系。从病理学角度看，AS在胃肠道的积累可能早于中枢神经系统的病理变化，支持PD的"身体优先"发病模型³⁵。然而，本研究未发现PD+AS组与PD-AS组在运动症状不对称性、亚型分布或自主神经症状方面的显著差异，这提示胃部AS播种活性可能特异性地反映认知相关病理进程。
本研究的临床价值在于为PD提供了潜在的侵入性较小的生物标志物策略。与需要腰椎穿刺的脑脊液检测相比，胃活检是一种常规内窥镜程序，更容易在临床实践中实施。此外，RT-QuIC检测的高特异性(100%)使其成为辅助诊断的有力工具，尽管敏感性(45.5%)仍有提升空间。
研究的局限性包括样本量小、未评估其他帕金森综合征以及缺乏阿尔茨海默病相关生物标志物的评估。未来研究应扩大样本量，纳入纵向设计以追踪AS播种活性与认知功能的动态变化，并探索与其他生物标志物的组合应用。
总之，本研究表明胃部AS种子扩增检测不仅是PD的诊断工具，还可能作为反映肠-脑轴病理生理过程和预测认知功能的生物标志物，为理解PD发病机制和开发早期干预策略提供了新视角。
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