新冠后综合征患者任务诱发的瞳孔动态变化
摘要
背景/目的： 新冠后综合征(PCS)常伴有持续的认知症状，如疲劳和注意力不集中，但缺乏与认知功能障碍相关的客观指标。瞳孔振荡指标已成为评估任务相关认知负荷和自主神经调节的非侵入性指标。本研究调查了大量PCS患者与健康对照组的瞳孔活动指数(IPA)和高低瞳孔活动指数(LHIPA)。
方法： 在这项横断面研究中，526名参与者（397名PCS患者，129名对照）使用带集成眼动追踪的头戴式显示器执行标准化虚拟现实立体视觉任务，该任务有三个视差级别：275弧秒（高难度）、550弧秒（中难度）和1100弧秒（低难度）。记录连续瞳孔测量数据，并计算IPA和LHIPA。采用具有参与者随机截距的线性混合效应模型进行分析，调整年龄、性别和任务难度。
结果： 在事后基于模型的对比中，所有三个任务难度级别下，PCS患者的IPA和LHIPA均显著低于对照组。在调整后的混合效应模型中，PCS也与较低的整体IPA（β = -0.111，95% CI -0.160至-0.062，p < 0.001）和较低的整体LHIPA（β = -0.164，95% CI -0.253至-0.074，p < 0.001）相关。较低的任务难度与两个指标的较高值相关：对于IPA，在550弧秒时β = 0.164，在1100弧秒时β = 0.287（两者p < 0.001）；对于LHIPA，在550弧秒时β = 0.161，在1100弧秒时β = 0.254（两者p < 0.001），相对于275弧秒。因此，两个指标均显示与任务难度的反向关联。年龄与两个指标呈负相关，而男性性别与两个指标均呈正相关。未观察到队列与任务难度之间的显著交互作用。
结论： PCS与标准化立体视觉任务期间降低的IPA和LHIPA相关。这些发现表明PCS中存在异常的任务相关瞳孔动态变化，可能反映了认知负荷处理和自主神经调节的改变。LHIPA，以及谨慎使用的IPA，可能有助于PCS中任务相关瞳孔变化的客观评估。
关键词： 新冠后综合征；长期新冠；瞳孔测量法；认知负荷；瞳孔活动指数(IPA)；高低瞳孔活动指数(LHIPA)；自主神经系统；虚拟现实评估
1. 引言
新冠后综合征(PCS)是指感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)后至少三个月内持续存在的一组新型或持续症状，且无其他诊断可以解释，属于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的临床症状复合体。疲劳和注意力困难是最常报告的症状。然而，PCS中认知功能障碍的客观生理指标仍然有限，使临床护理和研究中的诊断、分层和监测变得复杂。PCS对临床医生和患者而言仍是重大挑战，因为客观诊断指标和因果治疗选择仍然缺乏。
PCS的患病数据因地区而异，某些地区的数据缺失。PCS越来越被理解为一种异质性综合征，而非单一临床实体，包含重叠的亚群，如自主神经功能障碍、免疫介导的通路、器官特异性后遗症（如肺纤维化、心肌炎和肠易激综合征）以及血管功能障碍。由于自主神经系统对瞳孔功能有影响，自主神经功能障碍可能通过改变的瞳孔动态反映出来。瞳孔功能由两块肌肉控制：受副交感神经系统调节的瞳孔括约肌（胆碱能神经元）和受交感神经系统支配的瞳孔开大肌（非胆碱能神经元）。两块肌肉的拮抗收缩导致瞳孔收缩（瞳孔缩小）或扩张（瞳孔扩大），这种精确的调节对于使视觉系统快速适应不同光照条件至关重要。
瞳孔测量法是一种基于非侵入性和快速测量瞳孔反应的眼科方法。最近的数据显示，PCS患者也表现出异常的瞳孔反应：瞳孔收缩持续时间减少（25名PCS患者），不同光照条件下的瞳孔反应异常（44名PCS患者），或瞳孔扩张和收缩减少（65名PCS患者）。这些关于瞳孔光反射的研究主要评估了对亮度变化的反射性自主神经和脑干介导反应，而任务诱发的瞳孔波动则反映了主动任务执行期间的认知努力、唤醒调节和精神工作负荷。
之前关于PCS的瞳孔测量研究主要描述了光诱发或基本瞳孔反应的异常，包括收缩动态改变和扩张/收缩反应减少。任务诱发的振荡瞳孔指标似乎是有希望的客观标记，用于评估PCS中的认知功能障碍。
为评估与认知负荷相关的任务诱发瞳孔动力学，IPA被提出作为任务执行期间瞳孔直径快速振荡的频率基度量。LHIPA进一步将瞳孔信号的低频和高频成分相关联。由于亮度相关变化和基线漂移通常在比任务诱发微扩张更慢的时间尺度上发生，这些指标旨在强调认知驱动的瞳孔动力学，同时减少环境光照变化的污染。最近的数据显示，IPA可能在虚拟3D任务期间反映PCS患者的认知损伤。此外，后续机器学习分析将IPA和LHIPA确定为区分PCS患者与健康对照的最有信息特征。因此，本研究在大量PCS患者和健康对照中，使用具有分级难度的标准虚拟现实立体任务检查了IPA和LHIPA。通过将两种频率基瞳孔指标与受控任务范式和混合效应模型相结合，本研究旨在检查PCS患者与健康对照之间任务诱发的瞳孔振荡是否不同，以及这些测量是否可能作为PCS中改变的认知负荷处理的客观指标。
2. 材料和方法
2.1 研究队列
共有526名参与者在德国埃尔朗根弗里德里希·亚历山大大学附属医院眼科招募：397名PCS患者（41.6%男性，58.4%女性）和129名健康对照（49.6%男性，50.4%女性）。平均年龄为40.6 ± 13.2岁，各队列间无明显差异（对照：36.8 ± 15.5岁；PCS：41.9 ± 12.2岁）。PCS持续时间平均为677.1 ± 347.2天。SARS-CoV-2感染通过阳性聚合酶链反应确认。功能障碍评估使用Bell评分，范围从0到100分，分数越高表示功能能力更好，症状负担越轻。100分表示休息或体力活动时无症状，正常活动；0分表示休息时严重症状、卧床状态，甚至无法进行轻微自我护理活动。排除标准包括预先存在的眼部疾病、系统性疾病伴有眼部受累以及最佳校正视力低于0.8的受试者。健康参与者没有既往COVID-19病史，或已从COVID-19中康复且无任何PCS症状。
2.2 VR-OTS
虚拟现实眼科运动测试系统(VR-OTS；Talkingeyes & More，德国埃尔朗根)用于在立体视觉条件下量化视觉任务表现和瞳孔动力学。该系统在头戴式显示器（HTC Vive Pro Eye，HTC公司，中国台湾桃园）中实现，配备两个3.5英寸OLED显示器（每眼1440×1600像素），刷新率为90 Hz，标称视场角为110°，以及可调节的瞳孔间距（IPD；60-73毫米）。双目眼动追踪由集成的Tobii系统（Tobii AB，瑞典达伦）提供，制造商指定为120 Hz。
虚拟场景由体育场状环境组成，四个球体以200厘米虚拟观看距离以菱形排列。每个球体的虚拟直径为25厘米，每个球体到排列中心的距离为25厘米。刺激可以出现在视觉场中的九个预定义位置：一个中心位置和八个周边位置（下、右下、右、右上、上、左上、左和左下）。周边位置使用球坐标生成，固定倾角为10°。
在每个立体刺激中，四个球体中有一个被渲染为比其他三个更接近参与者。通过双眼视差操作任务难度，使用三个视差级别：275、550和1100弧秒。275弧秒条件表示头显显示几何结构可以实现的最小视差差异。较小的视差值对应更高的任务难度，因为球体之间的深度差异更难分辨。要求参与者识别感知为最接近的球体，并使用相应箭头键尽可能快速准确地表示其反应。在测试前，向参与者介绍头显和任务。使用HTC SRanipal运行时(1.3.6.8版)执行5点眼动追踪校准；此过程也用于优化头显定位和调整IPD设置。通常佩戴眼镜的参与者在测试中不戴眼镜，以避免眼动追踪准确性的降低。
每位参与者完成三轮测试。每轮开始时，所有四个球体以相同深度呈现（空闲阶段）。参与者按下箭头键启动轮次后，以随机顺序呈现81个立体刺激。这些刺激包含3个视差级别、9个刺激位置和3次重复的所有组合。第一轮用作熟悉，第二轮用作训练，第三轮的数据用于统计分析。分析的第三轮持续时间定义为完成81个刺激立体视觉任务的总时间。
对于每个刺激，系统记录反应时间（刺激开始到按键时间）、反应正确性、视差级别和刺激位置。同时，在任务执行期间使用Unreal Engine的SRanipal插件连续记录双目瞳孔直径、注视方向、注视原点和眼睛开合度。
瞳孔测量预处理遵循先前描述的VR-OTS预处理流程。在特征提取前，移除眨眼污染和无效样本。使用眼睛开合度信号识别眨眼；眼睛开合度<0.1的样本被归类为眨眼。拒绝瞳孔范围在1.5-9.0毫米生理范围之外的样本。额外的伪影排除包括移除样本到样本的大幅变化、强烈偏离拟合趋势线的样本以及孤立的短簇。之后，计算双眼平均瞳孔直径，使用分段三次埃尔米特插值多项式方法对缺失样本进行插值。
预处理后，平均双目瞳孔直径信号被用作瞳孔振荡指标的输入信号。IPA和LHIPA在VR-OTS软件(1.0.0版)环境中计算，并用作设备导出的瞳孔测量指标。这些指标的算法基础遵循Duchowski等人对IPA和LHIPA描述的基于小波的方法。简而言之，IPA通过离散小波变换分解预处理的瞳孔直径时间序列，识别瞳孔直径的快速局部变化。然后，使用小波系数信号的局部最大值检测瞳孔直径的突然小幅变化，并应用阈值以抑制可能由噪声引起的微小波动。剩下的超阈值事件被计数并按分析信号段的持续时间标准化。因此，IPA不是以瞳孔直径毫米表示，而是代表检测到的瞳孔振荡事件的时归一化频率样指数。
LHIPA从相同的预处理瞳孔直径信号计算，但通过考虑瞳孔振荡的低频和高频分量之间的关系来扩展IPA概念。在小波分解后，将低频带和高频带的系数相关以获得瞳孔活动的低/高频比。然后在该比率信号中检测模量最大值，进行阈值化、计数，并按信号持续时间标准化。因此，LHIPA也是时归一化振荡指数，而非瞳孔直径的直接测量。
在本研究中，IPA和LHIPA针对分析轮次的刺激时间段进行计算，并按每个视差级别平均。三个视差条件为每位参与者提供了任务特定的瞳孔振荡活动总结值。所得IPA和LHIPA值被用作队列和视差定义任务难度级别间任务诱发瞳孔动态的相对指标。
虚拟环境中的亮度通过为所有参与者使用相同的编程VR环境保持恒定。在原系统描述中，通过避免投射阴影和在虚拟环境中使用远处单一光源来最小化单眼光学线索。为减少可能从虚拟环境外部进入的环境光影响，每次测量前确保头显的贴合和标准化定位。
2.3 统计分析
所有统计分析和数据可视化均使用Python (3.13.7版)、scipy (1.16.3版)、statsmodels (0.14.5版)和seaborn (0.13.2版)进行。描述性统计在参与者级别计算。连续变量以均值±标准差(SD)和中位数[四分位范围(IQR)]报告，分类变量以计数和百分比报告。
评估了瞳孔结果指标IPA和LHIPA的分布，分别针对每个队列(PCS和对照)和每个视差级别(275、550和1100弧秒)。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。此外，通过视觉检查箱线图和带有核密度覆盖的直方图来评估分布形状和明显偏斜或离群值的存在。
为了解决数据的重复测量结构，分别对IPA和LHIPA拟合了具有参与者随机截距的线性混合效应模型(LMMs)。为此，每位参与者贡献最多三个对应三个视差级别的重复观察。因变量是相应的瞳孔测量指标(IPA或LHIPA)。固定效应包括队列(PCS比对照)、视差级别(275、550和1100弧秒)、性别(女性比男性)和年龄。在模型中包含队列和视差级别的交互项，以测试任务难度对不同队列的影响是否不同。对照队列、275弧秒视差和女性性别作为参考类别。年龄在模型拟合前以样本均值为中心。所得模型定义在公式(1)中：
Yij = β0 + β1 Cohorti + β2 Disparityij + β3 (Cohorti × Disparityij) + β4 Sexi + β5 Agec,i + b0i + εij，
其中Yij表示参与者i在视差级别j的观察结果值(IPA或LHIPA)，β0是固定截距，β1表示队列的固定效应，β2表示视差级别的固定效应，β3表示队列与视差的交互效应，β4表示性别的固定效应，β5表示中心化年龄的固定效应。b0i项表示参与者特定的随机截距，考虑重复测量之间的组内相关性，εij是残差误差项。随机截距和残差被假定遵循正态分布。
在混合效应分析中，每位参与者和视差级别的一个汇总值输入模型。因此，每位参与者贡献三个观察值(275、550和1100弧秒)，总共1578个观察值。
模型诊断通过视觉检查残差vs拟合图、Q-Q图、残差直方图和残差在队列和视差级别中的分布进行评估。此检查表明存在轻微尖峰特性，外周残差超过正态分布下期望的值，这在临床数据集中并不罕见。然而，线性混合效应模型通常对这种微小正态性偏差具有稳健性，特别是在足够大的样本中。考虑到526名参与者的样本量，这些偏差不被认为足以使基于模型的推断无效。
模型使用限制性最大似然法(REML)估计。固定效应以回归系数(β)、相应的95%置信区间(CI)和双侧p值报告。显著性定义为p<0.05。除了主要混合模型分析外，还在每个视差级别内估计了简单的队列效应。由于这些比较在每个结果内分别执行，p值使用Holm方法调整。模型导出的预测值用于图形展示。
3. 结果
3.1 瞳孔指标的分布特征
在所有参与者中，分析的第三轮完成的中位时间为99.07秒，四分位范围为78.12秒至131.06秒，平均持续时间为114.31秒±56.28秒。箱线图和核密度估计（图2和图3）展示了IPA和LHIPA值的分布，分别按队列和视差分层。在所有视差级别下，两个指标均表现出单峰分布，形状大致对称，特别是在较高级别视差下。Shapiro-Wilk检验形式表明，几个亚组视差组合的分布偏离了严格的正态性，特别是在PCS队列中。核密度图显示近似正态分布，且每种条件下较大的样本量支持LMMs用于推断分析。
3.2 IPA的线性混合效应模型
线性混合效应建模揭示，与健康对照相比，PCS患者的IPA值更低（见表2）。
模型包括参与者的随机截距和队列、视差、性别、中心化年龄和队列-视差交互的固定效应。PCS队列的IPA值显著低于对照队列（β = -0.111，95% CI -0.160至-0.062，p < 0.001）。视差增加与较高的IPA值相关，550弧秒（β = 0.164，p < 0.001）和1100弧秒（β = 0.287，p < 0.001）与275弧秒相比。因此，IPA显示与任务难度的反向关联，最高难度条件下IPA值最低。男性性别与较高的IPA值相关（β = 0.109，p < 0.001），而年龄与IPA呈显著负相关（β = -0.008，p < 0.001）。队列和视差的交互项在联合Wald检验中不显著（χ²(2) = 0.89，p = 0.640），表明队列间视差相关变化相似。从模型导出的年龄和性别调整后的预测均值如图4和表A1所示。事后基于模型的对比显示，在所有三个视差级别下，PCS队列的IPA值均显著低于对照组。在275弧秒下，调整后的均值差异为β = -0.111（95% CI [-0.160, -0.062]，Holm调整p < 0.001）；在550弧秒下，β = -0.125（95% CI [-0.174, -0.075]，Holm调整p < 0.001）；在1100弧秒下，β = -0.109（95% CI [-0.158, -0.060]，Holm调整p < 0.001）。
在PCS队列中，Bell评分与平均IPA无显著相关性（Spearman's ρ = 0.081，p = 0.114）。
3.3 LHIPA的线性混合效应模型
对LHIPA的线性混合效应建模显示，PCS队列中的值显著低于对照组（见表3）。与IPA模型一样，包括参与者的随机截距。LHIPA值在PCS队列中显著低于对照组（β = -0.164，95% CI -0.253至-0.074，p < 0.001）。较高的视差与LHIPA值增加相关，在550弧秒（β = 0.161，p < 0.001）和1100弧秒（β = 0.254，p < 0.001）下。男性性别与LHIPA呈正相关（β = 0.106，p = 0.003），而年龄显示显著负相关（β = -0.007，p < 0.001）。联合Wald检验未观察到队列与视差的显著交互作用（χ²(2) = 2.15，p = 0.342）。按队列、视差和性别调整后的LHIPA预测均值如图4和表A1所示。
事后基于模型的对比同样显示，在所有三个视差级别下，PCS队列的LHIPA值均显著低于对照组。在275弧秒下，调整后的均值差异为β = -0.164（95% CI [-0.253, -0.074]，Holm调整p < 0.001）；在550弧秒下，β = -0.213（95% CI [-0.303, -0.124]，Holm调整p < 0.001）；在1100弧秒下，β = -0.199（95% CI [-0.289, -0.110]，Holm调整p < 0.001）。在PCS队列中，Bell评分与平均LHIPA无显著相关性（Spearman's ρ = 0.088，p = 0.087）。
4. 讨论
PCS、长期新冠或新冠后急性后遗症是定义症状持续存在且限制生活的术语。迫切需要可视化和量化广泛的患者报告症状。最近的数据表明IPA和/或LHIPA可能提供量化PCS中受损认知负荷的客观指标。在调整年龄、性别和任务难度后，LHIPA在混合效应模型中显示PCS低于对照，表明认知负荷增加；事后基于模型的对比证实在每个视差级别上值均显著降低。然而，IPA在3D任务环境中未能显示此差异。
瞳孔测量法是一种基于非侵入性瞳孔大小测量的眼科方法，用于评估认知和自主神经功能。除了调节视网膜照明，瞳孔大小与唤醒和精神努力相关联。研究表明，瞳孔区域的变化与精神努力和难度成比例。观察到瞬时瞳孔扩张与精神负荷或难度之间的相关性。这些快速运动独立于较慢的瞳孔光反射，被认为是自发精神努力的表达。在急性新冠期间观察到改变的瞳孔光反射和降低的扩张速度。此外，PCS患者表现出较低的瞳孔直径和较高的瞳孔不稳定指数，均与降低的中枢神经系统激活相关。
传统的基于均值或峰值直径的测量极易受基线漂移影响，因为亮度变化限制了适用性。因此，为强调瞳孔动力学，IPA被确立为信号处理值，强调瞳孔直径的高频变化。IPA不参考总体瞳孔区域，而是量化单位时间内快速瞳孔运动的速率（也称为瞳孔不稳定或微扩张），间接通过高频瞳孔波动量化任务诱发精神负荷的变化，同时最小化环境亮度引起的基线位移以及疲劳相关的基线变化。
LHIPA由Duchowski等人引入，作为IPA失效时的认知负荷标记。它特别被提议作为更稳健的低/高频比率基指标，随着认知负荷的增加而降低。IPA是固定凝视任务（基于心理算术）的敏感标记，但在创建n-back任务（包括工作记忆）时，IPA无法显示认知负荷，而LHIPA可以。LHIPA在n-back测试中显示敏感结果，而眼睛可以移动。本研究结果证实了这些数据。LHIPA在3D任务期间对PCS患者认知负荷显示敏感，而IPA未能做到这一点。
瞳孔功能由自主神经系统调节。源自睫状神经节和翼腭神经节神经元的副交感后节纤维调节瞳孔括约肌，控制瞳孔收缩（胆碱能神经元）。源自颈上神经节的交感后节纤维（非胆碱能神经元）调节瞳孔开大肌，控制瞳孔扩张。除了脑干和自主机制外，瞳孔直径还受视觉和非视觉皮层区域的影响。观察到在更高阶皮层功能（如问题解决）期间瞳孔直径的小幅变化，即使刺激不包含观看距离或视网膜照明的变化，但通过颜色、空间频率和表观运动而变化。这些瞳孔运动与神经调节剂（主要是去甲肾上腺素能和胆碱能影响）密切相关。去甲肾上腺素（去甲肾上腺素）主要通过蓝斑核引起快速、短暂的瞳孔扩张。乙酰胆碱引起更长时间的瞳孔变化。瞳孔扩张减少与副交感神经功能障碍和负责瞳孔控制的脑干功能一致，这在急性感染期间和临床恢复后均存在，表明持续效应。PCS的病理生理机制涉及受损的微血管组织血液供应，与自主神经和脑干功能障碍相关。受损的微血管供应可能导致自主神经系统中的代谢失调，这可能解释了研究中报告的较低IPA和LHIPA值。在精神负荷期间测量的PCS患者的瞳孔动力学变化表明认知功能的病理行为。
假设PCS认知症状与自主神经系统功能障碍和特别是脑干中的改变的中枢唤醒调节相关。对急性新冠期间死亡患者的初步尸检表明，除了脑干和小脑区域白质中微胶质细胞和巨噬细胞激活外，SARS-CoV-2 RNA可在从嗅觉系统到脑干的神经元区域中观察到。有趣的是，显示认知障碍的PCS患者在氟脱氧葡萄糖PET中显示脑干和脑桥中低代谢区域，与急性新冠严重程度无关。
PCS常见症状包括持续精神疲劳、注意力缺陷、工作记忆受损和SARS-CoV-2感染后数月的认知处理速度减慢。这些症状通常无法通过常规神经影像学或临床神经系统检查追踪；因此，需要合适的敏感生物标志物。由于LHIPA被观察为PCS患者的敏感标记，这些数据证实了先前的发现。任务难度增加与两个队列中两个指标的较低值相关。因此，最高难度条件（275弧秒）显示最低LHIPA值，而最低难度条件（1100弧秒）显示最高值。年龄显示负相关，如文献所述。男性性别与较高值相关，但在瞳孔测量中性别的相关研究情况不一致。
LHIPA与蓝斑-去甲肾上腺素(LC-NE)系统相关，这是调节注意力、唤醒和努力的关键调节器，其失调与疲劳、减少的精神效率和不稳定性相关。LC-NE系统通过去甲肾上腺素信号的变化影响LHIPA。LC神经元激活释放去甲肾上腺素(NE)，结合肾上腺素受体，调节神经元兴奋性和突触增益，影响精神努力和唤醒状态。NE通过G蛋白偶联肾上腺素受体（包括α和β亚型）作用，影响cAMP依赖性信号等细胞内级联反应和离子通道调节。任务期间LHIPA的增加可能是LC-NE活动补偿上调的标志，而增加的精神努力是执行任务所必需的。LHIPA值降低可能表示在疲劳患者的患者中突出的低唤醒或耗竭。
本研究并非没有局限性。潜在的混杂因素可能干扰LHIPA数据（如抗胆碱能药物）。研究设计针对年龄大于18岁的患者。由于VR-OTS是一种非侵入性、方便且直接的程序，该方法可能特别有益于儿童和青少年。因此，后续研究应在此18岁以下患者的队列中扩展此发现。此外，结果代表了欧洲患者人群的单中心研究，因此不能代表全球人口。由于这是横断面研究，建议进行更广泛的纵向或治疗相关研究，以验证这些发现，评估其在患者评估或监测中的潜在有用性。
5. 结论
这些数据显示，PCS患者的IPA和LHIPA值在所有任务难度级别下均显著低于对照组。这些发现表明PCS中存在改变的任务诱发瞳孔动力学，而LHIPA模式与先前方法学文献一致。IPA的行为应谨慎解释，因为先前工作表明该指标可能更容易受到实验和信号相关影响。
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