摘要
背景 狼疮性肾炎(LN)中的间质纤维化通常被免疫细胞浸润，但通常被视为非特异性的"瘢痕反应"。本研究旨在探讨LN中炎症性纤维化与肾脏疾病进展之间的关系。
方法 对124例LN肾脏活检样本进行间质纤维化和小管萎缩(IFTA)评分。根据Banff移植病理学分类，对IFTA区域的炎症(i-IFTA)进行0-3级分级。显著肾小球滤过率(GFR)下降定义为活检后3年内下降>15 mL/min。通过连续免疫组织化学(13重)确定免疫细胞表型。
结果 88/124 (71%)活检样本中观察到IFTA，其中76/88 (86%)存在i-IFTA。i-IFTA分级在所有IFTA分级中分布不均。在IFTA中至重度(>25%)的患者中，i-IFTA程度与显著GFR下降风险增加相关：i-IFTA分级0、1、2和3的患者GFR下降比例分别为0/1 (0%)、0/3 (0%)、3/4 (75%)和7/9 (78%)(p=0.015)。多重组织学分析显示，i-IFTA主要由CD163+巨噬细胞和CD4 T细胞组成，其次是CD8 T细胞和粒细胞。
结论 i-IFTA在LN中常见且主要由巨噬细胞和T细胞主导。对于基线IFTA >25%的患者，i-IFTA程度是GFR下降的预测指标。这些数据支持在LN中常规评估i-IFTA，因其具有预后意义，并表明i-IFTA可能成为潜在的治疗靶点。
本领域已知内容
- 间质纤维化和小管萎缩(IFTA)是狼疮性肾炎和其他肾脏疾病中肾脏存活的主要决定因素。肾脏活检中经常观察到纤维化区域内的炎症(i-IFTA)，但一直被视为非特异性的"瘢痕反应"，其在狼疮性肾炎中的预后价值尚未得到系统研究。
本研究新增内容
- 我们发现i-IFTA在狼疮性肾炎中常见且具有异质性，其严重程度改变了IFTA的预后影响。在IFTA中至重度(>25%)的患者中，较高的i-IFTA分级与显著肾小球滤过率下降风险增加密切相关，而i-IFTA缺失则与肾功能保存相关。
本研究对研究、实践或政策的潜在影响
- 这些发现支持在狼疮性肾炎活检中常规评估和报告i-IFTA。它们还表明i-IFTA可能成为生物标志物和潜在治疗靶点，用于旨在减缓纤维化进展和改善长期肾脏结局的干预措施。
引言
狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)患者发病和死亡的主要原因，在10%-30%的病例中导致终末期肾病(ESKD)。LN目前根据肾小球组织学特征的严重程度和分布分为六类。肾脏组织学还提供了肾内LN活动性(炎症)和慢性化(损伤)程度的信息，通常通过美国国立卫生研究院(NIH)活动指数(AI)和慢性化指数(CI)进行量化。目前对LN自然病程的理解表明，它从一个活动性炎症阶段发展到一个恢复阶段，急性病变可能通过类似伤口愈合的过程发展为纤维化瘢痕。在此框架下，组织学活动反映可能可治疗的病变，而慢性化则表示不可逆的损伤。诊断性活检中的慢性化(而非活动性)是LN未来肾功能丧失和进展至ESKD的最强预测因子。CI是一个综合评分，反映肾小球硬化、纤维性新月体、间质纤维化和小管萎缩的程度。在LN中，IFTA是CI中最强预测不良肾脏结局的组分，同样适用于IgA肾病等其他肾小球疾病以及肾移植。
在IFTA区域经常观察到炎症浸润(i-IFTA)，但在原发性肾脏活检中通常被视为非特异性特征(瘢痕反应)，而非需要治疗的活动性疾病。i-IFTA也见于非免疫性肾脏疾病，如糖尿病肾病和高血压肾病，其临床意义同样不明确。相比之下，在肾移植病理学中，i-IFTA被视为具有免疫学意义的病变，是慢性活动性细胞介导排斥反应的组织学标准之一。然而，支持在此背景下使用免疫抑制治疗的证据仍不充分。
i-IFTA在LN中的临床意义尚不清楚。本研究的目的是调查LN中炎症性纤维化与肾脏疾病进展之间的关联。此外，我们还表征了炎症性i-IFTA的免疫表型。
方法
研究设计与患者人群
本研究纳入了加速药物合作伙伴关系(AMP)类风湿关节炎(RA)/SLE队列中登记的患者。简言之，如果18岁以上SLE患者满足美国风湿病学会或SLICC SLE分类标准，进行了临床指征肾活检(定义为尿蛋白/肌酐比值(UPCR) >0.5 g/g)并诊断为LN，则予以纳入。排除活检时有肾脏移植史或怀孕的患者。本研究仅纳入拥有高分辨率、完整数字图像的肾脏活检光镜切片的患者。在活检前最近一次就诊时收集临床信息，包括血清学指标。所有患者在筛查时均进行尿液分析，由治疗医生在推荐肾活检前从临床上排除尿路感染。
参与者根据其治疗医生确定的标准治疗方案接受LN治疗。实验室测量在当地实验室进行，异常结果根据实验室的临界值定义。
估算的肾小球滤过率(eGFR)使用慢性肾脏病流行病学协作组(CKD-EPI)公式计算。肾功能显著丧失定义为在3年(±3个月)内达到ESKD(eGFR <15 mL/min/1.73 m²)或下降超过15 mL/min/1.73 m²。该阈值被指南认为具有临床相关性，并已应用于早期CKD的类似研究。
组织学评分
肾活检最初由活检所在机构的认证病理学家评估，并根据国际肾脏病学会/肾脏病理学会分类分配组织学分类、活动性和CI。使用虚拟显微镜(Concentriq, Proscia, Philadelphia, Pennsylvania; Aperio ImageScope V.12.3.2.8013, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)获取经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织的高分辨率、完整数字切片图像，这些组织经H&E、过碘酸希夫、过碘酸银甲胺染色和Masson三色染色。由两名操作员集中评估IFTA和间质炎症(包括i-IFTA)，并由资深肾病理学家(SB)进行审核。IFTA和i-IFTA根据Banff移植病理学分类进行0至3级分级(0: <5%，1+: 6%-25%，2+: 26%-50%，3+: >50%；i-IFTA分别为0: <10%，1+: 10%-25%，2+: 26%-50%，3+: >50%)。间质炎症评分时避免围绕硬化肾小球的炎症浸润和外渗的Tamm Horsfall蛋白的收集。这是首次将Banff i-IFTA评分应用于LN的研究，在此特定背景下尚无先前验证。Banff标准在移植病理学中已广泛应用，在移植中，纤维化区域的间质炎症被认为具有临床意义。
统计分析
描述性统计以均值和标准差或中位数和四分位距表示连续变量，以频数表示分类变量。使用方差分析(ANOVA)、双尾Student's t检验或Wilcoxon检验比较连续变量，根据情况使用Fisher精确检验比较分类变量。使用趋势χ²检验关联间质纤维化中的炎症与肾脏结局。通过Cochran-Armitage趋势检验测试趋势，在样本量较小时通过置换精确检验确认。
连续免疫组织化学
获取存档FFPE组织进行连续免疫组织化学染色。简言之，连续免疫组织化学(sIHC)涉及多轮染色、脱色和复染，每轮获得高分辨率图像。将组织切片(5 µm)脱蜡并进行抗原修复。将载玻片用过氧化物酶阻断，与一抗、二抗辣根过氧化物酶(HRP)试剂、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)-Red显色剂和苏木精孵育。载玻片在90%乙醇中脱色，用抗体洗脱缓冲液剥离，并依次通过标记面板(CD3、CD20、CD138、PR3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD163、CD66b、CD15、髓过氧化物酶(MPO)、泛角蛋白)循环。每轮以40X放大倍率捕获图像。
将图像文件导入HALO-AI (V.3.5, Indica Labs)进行解卷积、配准、融合和细胞分割，创建包含单细胞水平所有标记的配准复合图像。最初通过DenseNet V.2 AI分类器识别包括肾小球和肾小管间质的组织区域，该分类器经过核心注册的过碘酸-希夫(PAS)验证并经人工验证。IFTA区域由人工注释(SM)并由经验丰富的肾病理学家(SB)验证。使用伪彩色生成代表性多重sIHC图像。
使用R软件(V.4.4.1, The R Foundation)进行单细胞分析。使用中心对数比转换对标记强度进行归一化，然后进行缩放。使用Harmony进行批次校正。使用Seurat包(V.5.0.3)进行PCA降维，随后构建k近邻(KNN)图，并使用Louvain算法进行聚类。
排除显示高泛角蛋白强度的细胞簇以过滤掉肾上皮细胞。识别免疫标记水平超过均值2个标准差的细胞簇，作为密度分析的候选免疫细胞簇。使用配对t检验发现IFTA或非IFTA中显著富集的免疫细胞类型。
数据归属
此处公布的结果全部或部分基于从ARK门户(arkportal.synapse.org)获得的数据。
结果
i-IFTA是LN中常见特征
我们纳入了124例LN患者的肾脏活检，这些患者接受了临床指征肾活检且UPCR>0.5 g/g。临床和人口统计学特征总结在表1中。大多数患者为女性(79.8%)，其中50%为黑人，25%为白人，11%为亚洲人，28.2%为西班牙裔。活检时，大多数患者肾功能保存良好，蛋白尿处于亚肾病范围(平均eGFR 82.8 mL/min/1.73m²)。增殖性LN(纯III类、IV类或与V类混合)存在于58%的患者中，NIH AI和CI评分差异很大(中位AI 3(范围3-18)，中位CI 3(范围0-9))。
IFTA在124例活检中的88例(71%)中观察到，主要为轻度：58例患者(47%)IFTA评分为1，21例患者(17%)评分为2，9例患者(7%)评分为3。在88例IFTA患者中，76例(86%)存在i-IFTA，不同IFTA评分组(>0)中i-IFTA程度的分布相似。具体而言，在IFTA患者中，12例(14%)i-IFTA评分为0(<10% IFTA)，19例(22%)评分为1(10%-25%)，25例(28%)评分为2(25%-50%)，32例(36%)评分为3(>50%)。
未发现i-IFTA与活检时的年龄、性别、种族或治疗之间存在显著关联。i-IFTA程度越高，eGFR越差(p=0.005)，蛋白尿数值上也越高(p=0.075)。i-IFTA分布在大多数LN组织学分类中相似。i-IFTA与主要关注肾小球炎症的NIH AI之间无关联。然而，i-IFTA与较高的NIH CI评分显著相关(p<0.001)。
i-IFTA先于肾功能丧失
接下来，我们测试了i-IFTA是否与未来肾功能丧失相关。67例患者在索引肾活检后3年有纵向GFR数据。其中，26/67 (39%)的GFR下降>15 mL/min或发展为ESKD。
如预期，GFR下降与NIH CI和较高的IFTA相关。发展为GFR下降的患者在基线时i-IFTA评分较高。i-IFTA根据IFTA区域内炎症浸润的百分比进行分级。因此，活检中i-IFTA的总丰度取决于基础IFTA量。例如，轻度IFTA如10%(1级)可能在其50%区域内被浸润(i-IFTA 3)，但i-IFTA的总皮质区域将等于5%。相比之下，重度IFTA如50%(3级)可能在其10%区域内被浸润(i-IFTA 1)，因此代表i-IFTA的总皮质区域相同为5%。为最好地分析i-IFTA的临床影响并避免这种潜在偏倚，我们将患者根据IFTA程度分为两组：IFTA 0-1和2-3(无至轻度，中至重度)。根据IFTA程度的i-IFTA分级分布如图2所示。在IFTA无至轻度(0-1级，≤25%)的患者中，i-IFTA程度与GFR下降风险无关。相反，在IFTA中至重度(2-3级，>25%)的患者中，i-IFTA程度与eGFR下降风险增加相关(p趋势为0.015)。在IFTA 2或3级的患者中，i-IFTA缺失与GFR下降风险增加无关。相反，风险随i-IFTA程度增加而增加，i-IFTA 0、1、2和3的GFR下降比例分别为0%、0%、75%和78%。
i-IFTA中免疫浸润的表型
我们采用sIHC表征i-IFTA中免疫浸润的表型。从四例活检中获得47,022个细胞，包括8,875个免疫细胞，聚类为七个组。这些包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD20+B细胞、CD163+巨噬细胞和两簇粒细胞。粒细胞以MPO表达为特征，一簇共表达PR3和CD66b，提示中性粒细胞谱系，而另一簇PR3表达可变但无CD66b，提示单核细胞谱系(或基于形态学的非典型/非多叶中性粒细胞)。
i-IFTA中的浸润具有异质性，包括所有细胞类型。CD163+巨噬细胞(37.6%)和CD4 T细胞(24.9%)构成i-IFTA浸润的主体，其次是CD8 T细胞、粒细胞和B细胞。浆细胞也存在于i-IFTA中，但非常罕见，在分析的四例活检中总共仅识别出33个。
图3C显示了i-IFTA中每个免疫簇的密度与无纤维化的肾小管间质区域中浸润的比较。i-IFTA的特征是大多数免疫细胞密度更高，尤其是CD163+巨噬细胞和CD4+T细胞。代表性多重sIHC图像展示了IFTA中CD163+巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD66b-粒细胞的增加，如图3D所示。
讨论
在本研究中，我们证明i-IFTA在LN中常见且表现出显著的严重程度异质性。i-IFTA的特征是异质性免疫浸润，主要由CD163+巨噬细胞和T淋巴细胞组成。尽管被视为非特异性发现，但i-IFTA程度成为GFR下降的预测指标，特别是对基线IFTA>25%的患者。
IFTA是损伤严重程度的既定标志物，在包括LN在内的各种肾脏疾病中是CKD进展的强预测因子。与先前发现一致，本研究证实较高的IFTA与较高的GFR下降风险相关。IFTA内的风险受炎症浸润程度(i-IFTA)的显著影响。在IFTA中至重度的患者中，较高的i-IFTA预测CKD进展，而尽管存在IFTA但无i-IFTA与无GFR下降相关。最后一组患者数量有限，限制了明确结论。尽管如此，这些发现突显了i-IFTA的预后价值，并支持将其常规纳入和量化于LN活检报告中。如预期，IFTA >1仅在重复活检的患者中观察到，表明i-IFTA可能反映持续性损伤并导致难治性或复发性LN患者的CKD进展。i-IFTA在LN中的意义进一步得到先前研究的支持，这些研究表明总肾小管间质炎症(而非非纤维化区域的炎症)与更差的肾脏结局相关。这些观察结果解决了2018年国际肾脏病学会(ISN)/肾脏病理学会(RPS)对LN组织学分类修订中确定的关键缺口，并应为未来评分系统的开发提供信息。
i-IFTA与GFR下降的关联强化了炎症与纤维化之间的联系。这进一步得到i-IFTA在慢性活动性T细胞介导排斥反应诊断中的关键作用及其与肾脏存活率差的关联的支持。与其他器官类似，肾脏中的纤维生成遵循共同模式，急性损伤激活间充质细胞、成纤维细胞和周细胞，导致促炎级联反应。此环境触发肌成纤维细胞增殖，促进胶原分泌和细胞外基质(ECM)沉积。在正常条件下，此过程是自我限制的，一旦修复过程完成，肌成纤维细胞就会发生凋亡。然而，如果炎症持续或损伤反复发生，修复过程变得不平衡，导致ECM过度沉积、实质扭曲和功能下降。在肾脏中，这导致瘢痕形成、肾单位丧失和肾功能降低，关键因素包括肌成纤维细胞、巨噬细胞、转化生长因子-β(TGF-β)信号传导、上皮-间质转化和缺氧。鉴于i-IFTA与GFR下降的关联，我们假设i-IFTA促进纤维化，可能作为可治疗性靶向以改善肾脏结局的持续炎症过程的标志物。动物模型支持这一假设，显示损伤后去除巨噬细胞可预防纤维化。先前的重复活检研究表明LN中的肾脏纤维化可部分逆转。未来研究应探索靶向i-IFTA是否能减轻LN中的CKD进展。
i-IFTA内的免疫浸润主要由CD163+巨噬细胞和CD4+T细胞组成，类似于在IgA肾病和移植排斥等其他纤维化疾病和肾脏疾病中观察到的模式。在IgA肾病中，CD68+巨噬细胞积聚和CD3+/CD8+T淋巴细胞浸润与疾病进展相关。CD163+巨噬细胞与肾功能下降的关联在IgA肾病和肾脏移植中一致，表明损伤进展的共享机制。包括替代性激活(M2)促解决和促纤维化表型的CD163+巨噬细胞被认为通过招募和激活肌成纤维细胞促进纤维生成。此外，M2巨噬细胞可能通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转化直接促进纤维化。机制研究表明，M2巨噬细胞驱动从急性损伤到慢性肾脏疾病的转变，其耗竭减少胶原沉积。巨噬细胞在纤维化过程中的作用在特发性肺纤维化、肝纤维化和心脏新生儿狼疮等组织中均有观察到。除巨噬细胞外，CD4+和CD8+ T细胞以及B细胞与粒细胞和单核细胞的存在表明适应性和先天免疫系统之间的广泛相互作用。IFTA内的反应是否由特定抗原驱动(如先前在间质炎症中观察到的)仍有待确定。
我们承认本研究的几个局限性。样本量限制了我们进行亚组分析的能力，例如按ISN分类分层或评估药物使用的影响。此外，我们无法确定每位患者的"诱导"治疗方案。高血压控制、药物依从性或肾毒性事件等重要混杂因素无法完全考虑。此外，未量化纤维化涉及的关键细胞类型(如成纤维细胞和树突状细胞)，限制了我们系统研究细胞-细胞相互作用的能力。多重组织学仅在四名患者中进行，限制了研究结果的普遍性。需要更大规模的研究来确认这些发现并评估其更广泛的应用性。
总之，我们的研究结果确立i-IFTA作为LN中的负面预后标志物，预测不良肾脏结局。由于其预后意义，应在活检评估中常规报告i-IFTA的存在和严重程度。重要的是，i-IFTA代表潜在的治疗靶点，未来研究应关注旨在减少间质炎症的干预措施是否能减缓或预防LMN和其他纤维化肾脏疾病中的CKD进展。
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