摘要
背景 炎症、凝血和心肌应激的生化标志物已与现患和新发心房颤动(AF)相关，但关于生物标志物表达与心房颤动负担之间关系的研究较少。
目的 本研究旨在探讨心血管生物标志物与心房颤动负担以及持续时间≥24小时的心房颤动发作之间的关联。
方法和结果 在这项多中心观察性队列研究中，我们纳入了来自"重新评估心房颤动：高凝状态、电重构和血管不稳定在心房颤动进展中的相互作用"(RACE V)研究的404名阵发性心房颤动患者，并评估了总共92种潜在的心血管血液生物标志物。所有患者均完成了1年的随访，使用植入式循环记录仪或双腔起搏器进行持续心律监测。我们使用包含九个预先选定的协变量的多元回归分析生物标志物表达与心房颤动之间的关系：年龄、性别、既往心力衰竭、高血压、肾功能不全、既往卒中、冠状动脉疾病、体重指数和抗心律失常药物治疗。N末端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)水平升高与心房颤动负担增加(发生率比1.75，95%置信区间1.49至2.06)以及持续时间≥24小时的心房颤动发作(OR 1.78，95%置信区间1.39至2.27)相关。基质金属蛋白酶2、神经元基因座notch同源蛋白3和肿瘤坏死因子受体2水平升高也与持续时间≥24小时的心房颤动发作相关。
结论 在阵发性心房颤动患者中，循环中NT-proBNP水平升高与心房颤动负担增加以及持续时间≥24小时的心房颤动发作相关。
试验注册号 NCT02726698。
研究已知内容
- 多种参与炎症、凝血和心肌应激的基于血液的生物标志物已与现患和新发心房颤动(AF)相关。
- 心房颤动负担高的患者经历更多的心房颤动相关并发症，心房颤动负担已被提议作为潜在的治疗目标。
本研究新增内容
- 本研究评估了92种候选心血管生物标志物与心房颤动负担和发作持续时间的关联，通过植入式循环记录仪进行为期1年的持续心律监测。
本研究对研究、实践或政策的潜在影响
- 我们的结果表明，N末端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)是心房颤动负担的敏感标志物。
- NT-proBNP可能对监测阵发性心房颤动患者的心房颤动有益。
- 循环中的基质金属蛋白酶2、神经元基因座notch同源蛋白3和肿瘤坏死因子受体2可能在持续时间较长的心房颤动发作患者中发挥作用，但需要更多研究。
引言
心房颤动(AF)与多种不良心血管结局相关，包括卒中、心力衰竭(HF)、生活质量下降和死亡率增加。心房颤动的潜在机制复杂，涉及心房的结构、电和收缩重构。这可能是由于心房细胞基质和细胞外基质(ECM)成分的进行性心房纤维化所致。炎症、凝血和心肌应激的生化标志物先前已与现患和新发AF、血栓栓塞和心血管事件以及AF进展相关，但迄今为止，大多数与AF相关的生物标志物研究都集中在预测新发AF上。关于生物标志物表达与AF负担和持续时间较长的AF之间的关联知之甚少。多项研究表明，较高的AF负担或较长的AF发作持续时间与AF相关不良结局的风险增加相关，但通过持续心律监测评估AF负担既费时又昂贵，且AF中的症状可能不是心律失常负担的可靠指标。
识别循环血液生物标志物可以提高我们对AF病理生理学的理解，并能够早期预防和个性化治疗以减少AF进展，预防卒中，预测和监测治疗反应，并最大限度地减少AF相关并发症。本研究的目的是检查已确定的心血管生物标志物与AF负担和发作持续时间之间的关联。
方法
总共纳入了来自"重新评估心房颤动：高凝状态、电重构和血管不稳定在心房颤动进展中的相互作用"(RACE V)研究(ClinicalTrials.gov编号NCT02726698)的417名患者。研究方案先前已有描述。从荷兰八个站点纳入临床阵发性AF患者(最长AF病史10年)，年龄≥18岁，CHA2DS2-VASc评分最高为5，且无口服抗凝治疗的其他适应症。排除标准包括持续性AF病史、基线时使用胺碘酮治疗、妊娠、由短暂触发因素引起的AF、既往肺静脉隔离(PVI)或计划进行PVI、先天性心脏病或预期寿命<2.5年。所有患者在基线时都接受了临床评估，包括体格检查、心电图记录、血液采样以及病史和伴随用药的确认。对于本研究，所有纳入的患者至少有1年的随访。
RACE V方案获得了机构审查委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。所有患者在参与研究前均提供了知情同意。患者未参与本研究的设计、实施、报告或传播。
心房颤动发作裁定
患者使用LINQ Reveal植入式循环记录仪(ILR)(Medtronic，明尼苏达州，美国)(大多数)或连接到CareLink远程监测系统(Medtronic)的双腔起搏器进行持续心律监测。ILR设置为自动检测≥2分钟的AF(无论心率如何)。为防止数据丢失，患者被指示每天进行自动传输和每周手动传输。所有AF发作均由四位独立医生进行个体裁定。AF裁定对患者特征和研究信息进行盲法评估。在本研究中，仅评估了在研究纳入后第一年内捕获的心律记录。
生物标志物测定
在基线时使用EDTA血浆管采集外周血样本。在血液采样前获得心电图以确定心律。所有样本均在窦性心律和中断口服抗凝治疗的情况下获取。血液样本使用Olink心血管III面板(Uppsala，瑞典)通过多重免疫测定进行分析，其中包括92种心血管候选生物标志物。在线补充表S1显示了所包括生物标志物的完整列表。
结局
本研究评估的结局为：(1)总体AF负担(即1年内处于AF状态的总时间百分比)，(2)随访期间任何时间点AF发作持续时间≥24小时，以及(3)1年AF负担≥0.1%。
统计分析
分类变量以计数和百分比表示，连续变量以中位数与四分位距(IQR)或均值±标准差表示，视情况而定。所有生物标志物均通过二进制对数(log2)进行转换。应用单独的多变量逻辑回归模型来评估每个生物标志物与相应结局之间的关联。临床协变量预先选择并包含在多变量回归分析中。预先选定的协变量包括年龄、性别、心力衰竭、高血压、肾功能不全、既往卒中、冠状动脉疾病、体重指数和抗心律失常药物(IA类或III类)治疗。对于逻辑模型，测试了预测因子与结局之间的多重共线性和线性。我们使用Akaike信息准则和似然比检验选择最终模型。将连续协变量评估为分类变量并使用限制性立方样条。
AF负担呈强右偏斜，因此在评估生物标志物与AF负担之间的关联时，使用负二项回归模型来解释0% AF负担的过度离散。所有分析均使用稳健的方差估计器。负二项回归模型的乘积可以解释为发生率比(IRR)。每个生物标志物均使用预先定义的协变量进行调整分析。
低于0.05的双尾p值被认为具有统计学意义。为了平衡I型和II型错误率，我们应用了Benjamini-Hochberg程序，将错误发现率设定为10%(α=0.10)。对于被认为是随机缺失的协变量缺失数据(20组)，使用多重链式插补。统计分析在Stata SE for Windows V.18.5(StataCorp，美国)中进行。
结果
我们纳入了RACE V中417名合格患者中的404名，并评估了总共92种潜在的心血管生物标志物(完整列表见在线补充表S1)。13名生物标志物测量缺失的患者被排除在进一步分析之外。患者的中位年龄为64.6岁(IQR 57.7-70.8)，171名(42%)为女性，中位CHA2DS2-VASc评分为2(IQR 1-3)。在随访期间有≥1次AF发作的患者中，中位AF负担为0.7%(IQR 0.1-3.6)(整个队列为0.4%，IQR 0.02-2.6)，142名(35%)患者的AF负担<0.1%。总共95名(24%)患者至少有一次AF发作持续≥24小时，62名(15%)患者在随访期间无AF。
心房颤动负担
AF负担的分布显示，92个候选生物标志物中，有4个在多变量调整后与累积AF负担独立相关：基线N末端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)、肺表面活性物质相关蛋白D和脊椎蛋白1(SPON-1)浓度升高，以及纤溶酶原激活物抑制剂-1浓度降低与累积AF负担相关。在这四种蛋白质中，只有NT-proBNP在控制错误发现率后仍与累积AF负担显著相关(IRR 1.75，95%置信区间1.49至2.06)。
心房颤动发作持续时间≥24小时
AF发作≥24小时的患者更可能是男性，有冠状动脉疾病既往史，PR间期较长，并且左心房容积增大。29种生物标志物在AF发作持续≥24小时的患者中表现出差异表达。与AF负担的结果一致，AF发作≥24小时的患者与AF发作较短(<24小时)或无AF复发的患者相比，基线NT-proBNP浓度较高。
基质金属蛋白酶2(MMP-2)、神经元基因座notch同源蛋白3(NOTCH-3)、肿瘤坏死因子受体2(TNF-R2)、SPON-1、簇分化93、E-选择素、整合素β2、激肽释放酶6和基底膜蛋白聚糖的浓度升高也与AF发作持续时间≥24小时强相关(p<0.01)。值得注意的是，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)家族的三个成员，IGFBP-1、IGFBP-2和IGFBP-7的基线浓度在AF发作≥24小时的患者中升高。然而，在控制错误发现率后，只有四种蛋白质与AF发作≥24小时显著相关：NT-proBNP(OR 1.78，95%置信区间1.39至2.27)、MMP-2(OR 3.76，95%置信区间1.84至7.72)、NOTCH-3(OR 2.85，95%置信区间1.57至5.17)和TNF-R2(OR 2.53，95%置信区间1.42至4.51)。
心房颤动负担≥0.1%
在AF负担≥0.1%的患者中，NT-proBNP和肽酶抑制剂3的基线浓度升高，但在控制错误发现率后，只有NT-proBNP与AF负担≥0.1%显著相关(OR 1.41，95%置信区间1.15至1.74)。
讨论
在这一探索性RACE V分析中，我们研究了92种候选生物标志物与1年随访期间累积AF负担、发作持续时间≥24小时和AF负担≥0.1%之间的关联。无论采用哪种量化指标，NT-proBNP均与AF负担增加一致相关。除NT-proBNP外，MMP-2、NOTCH-3和TNF-R2被确定为较长持续时间AF的潜在标志物。
NT-proBNP与心房颤动负担
NT-proBNP主要由心房心肌细胞在壁拉伸、神经激素激活和缺氧时分泌。它可能是研究最广泛的用于新发和复发性AF的生物标志物。AF中NT-proBNP浓度升高的病因尚未完全阐明，但可能包括AF期间由于心房收缩丧失和/或不规则和快速心率导致的血流动力学恶化，为发展或恶化心力衰竭奠定基础。事实上，包括钠尿肽在内的升高的生物标志物可能代表与心房心肌病一致的心房组织变化。
我们的发现支持NT-proBNP与通过持续心律监测评估的不同AF负担指数之间存在强烈、正相关的关联。尽管该人群中总体AF负担较低(中位数0.4%)，NT-proBNP仍被确定为累积AF的敏感标志物。虽然大量研究已将NT-proBNP确立为新发和现患AF的预测因子，但只有一项其他研究研究了NT-proBNP浓度与AF负担的关系。在"通过植入式循环记录仪连续心电图监测检测心房颤动以预防高风险个体卒中"(LOOP)研究的事后分析中，作者报告了NT-proBNP与AF负担之间的正相关(中位数40.2个月)，IRR 1.34(95%置信区间1.02至1.69)，在调整常见心血管危险因素后。这与目前的结果一致。观察性数据进一步表明，转换为窦性心律后血浆NT-proBNP浓度降低，并且在永久性AF中高于阵发性AF。在LOOP研究中，NT-proBNP水平高于中位数(>125 pg/mL)与筛查检测到AF的可能性更高相关，而在NT-proBNP水平较高的个体中，使用ILR筛查AF与卒中风险降低相关(HR 0.60，95%置信区间0.40至0.90)，与NT-proBNP水平较低的个体相比。
NT-proBNP广泛用于监测心力衰竭，这两种情况相互作用且经常共存。AF患者中NT-proBNP水平升高可能反映新发或恶化的心力衰竭、AF复发或AF与心力衰竭共存。在一项比较直接口服抗凝剂与华法林的三项大型随机对照研究的汇总分析中，AF和HF患者中较高的NT-proBNP水平与HF住院和心血管死亡风险相关，无论HF病史如何，NT-proBNP都能改善未来HF事件的风险分层。该人群中HF不常见，无法评估HF是否改变NT-proBNP与AF负担之间的关联。尽管如此，AF患者中升高的NT-proBNP水平应引起临床关注，以识别AF和/或进行性心脏失代偿。
目前用于新发AF的已建立的风险分层工具未纳入生物标志物，但纳入NT-proBNP可能会增加价值，即将NT-proBNP添加到Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology AF (CHARGE-AF)风险评分中被证明可以改善预测能力。如果我们能够预测新发AF和高负担AF，这可以指导何时以及采取哪种治疗策略，因为AF负担高的患者易发生更差的结局。NT-proBNP浓度变化与AF负担之间的时间关系以及测量时机应是未来研究的主题。
与延长的心房颤动发作相关的生物标志物
AF发作持续时间≥24小时与不同的患者特征以及主要与炎症、细胞外基质稳态和重构相关的升高的生化标志物相关，这些标志物可能诱发AF。除NT-proBNP外，AF发作持续时间≥24小时与几种炎症标志物的较高基线浓度相关，尤其是MMP-2、NOTCH-3和TNF-R2。
MMP-2由心肌细胞和心脏成纤维细胞分泌，参与细胞外基质转换。细胞内MMP-2浓度增加可导致包括肌钙蛋白、肌联蛋白和肌球蛋白轻链在内的几种肌小节和细胞骨架蛋白的蛋白水解，因此导致心脏收缩功能受损。临床前研究将MMP-2与心房纤维化和重构以及通过减少炎症蛋白的抑制促进炎症过程相关联。MMP-2浓度升高可能是潜在AF心房基质严重程度的标志物，这可能导致AF发作持续时间更长。先前的一项基于社区的研究确定MMP-2可能是新发AF、与AF相关的心力衰竭且射血分数保留以及射血分数降低的心力衰竭的潜在生物标志物，提出MMP-2可能有助于AF的发病机制。同样，在一项包括102名接受AF药物或电复律的临床研究中，升高的MMP-2浓度与恢复窦性心律的概率较低相关。
TNF-R1和TNF-R2是促炎细胞因子TNF-α的受体，TNF-α由人心肌细胞表达。TNF-α在心房心肌拉伸时被激活，先前已与心力衰竭、肥厚性心肌病、高血压和缺血性心脏病相关。升高的心脏TNF-α浓度可能诱导心房纤维化，并且临床前研究表明，TNF-α诱导的心房结构和电重构可能导致功能异常，包括心房心律失常和AF。虽然我们没有发现TNF-α与AF发作持续时间之间的直接关联，但观察到AF发作持续时间≥24小时的患者基线TNF超家族受体和配体(TNF-R1、TNF-R2和TNFSF-13B)以及几种相关促炎蛋白浓度升高，从而加强了炎症在AF持续中的作用，可能是通过病理性重构。
NOTCH-3是四种跨膜Notch受体蛋白之一，对于响应机械负荷维持心肌的结构和功能完整性至关重要。与TNF-α一样，NOTCH-3也参与炎症。它已被提出作为血管损伤的生物标志物，并与包括动脉粥样硬化、卒中和心力衰竭在内的心血管疾病相关。据我们所知，Notch受体以前从未直接与AF相关联。体外实验表明，TNF-α调节Notch信号传导并导致细胞凋亡，NOTCH-1和NOTCH-3还参与MMP分泌。NOTCH激活可能与心肌重构或修复过程有关，但NOTCH-3在心房心律失常发生和/或重构中的作用有待进一步研究。
AF负担和最长不间断AF发作的持续时间似乎比任何分类测量的AF更密切地与不良AF相关结局相关。然而，使用持续心律监测进行长期AF监测既费力又昂贵，主要限于植入起搏器和除颤器的患者。我们描述了NT-proBNP与AF负担和延长的AF发作持续时间之间的密切关联，表明NT-proBNP也可能对AF监测有用。
局限性
尽管使用ILR准确捕获了AF负担，但仍存在一些局限性。这是一项观察性研究，尽管进行了深入表型分析，但我们无法排除残余混杂的可能性。总体AF负担较低，我们的样本量有限。这降低了我们分析的统计功效，可能会遗漏临床相关关联。另一方面，为减少I型错误风险而控制多重性会增加II型错误的风险。出于这个原因，我们提供了校正错误发现率前后结果。为防止过拟合，多变量回归模型中包含的变量数量有限，这可能会增加残余混杂的风险。生物标志物测量仅在基线时进行，因此我们无法提供有关生物标志物表达与AF发生和持续时间变化之间时间关系的更详细见解。在RACE V中，排除了持续性AF和既往AF消融的患者，中位CHA2DS2-VASc评分为2(最高5分)。因此，无法在本研究中评估生物标志物评估在这些高风险个体中的效用。需要在更大样本和高风险患者群体中验证我们的结果。使用连续血液采样将生物标志物表达与AF负担相关联可能有助于表征循环血液生物标志物与AF发生之间的时间关系。
结论
在具有自终止性阵发性AF的患者中，循环中NT-proBNP浓度升高与AF负担增加、发作持续时间≥24小时以及AF负担>0.1%相关。本研究的结果进一步表明，循环中的MMP-2、NOTCH-3和TNF-R2在具有长持续时间AF发作的患者中可能发挥作用，但需要进一步研究以确认这些关联。
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