图形摘要
我们通过结构引导的片段筛选方法，开发出高效且选择性强的非共价Keap1-Nrf2抑制剂。这些纳摩尔级抑制剂可激活Nrf2调控基因，通过NLRP3和STING通路抑制炎症反应，并展现出区别于共价Nrf2激活剂的转录组特征，为氧化应激相关疾病提供了有前景的化探针和药物候选物。
摘要
激活核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的细胞保护反应可降低氧化应激和炎症。一个有前景的策略是开发靶向Keap1 Kelch结构域的非共价化合物来抑制Keap1-Nrf2蛋白相互作用。这些化合物可能比共价Keap1反应性Nrf2激活剂更具特异性。然而，由于Kelch结合口袋的尺寸和极性特性，开发具有类药性的非共价Keap1-Nrf2抑制剂面临挑战。本文中，我们从晶体学筛选发现的微弱片段出发，通过两步生长策略和X射线共晶结构指导的优化，获得了具有低纳摩尔亲和力的化合物，且在同源Kelch结构域组中对Keap1具有完全选择性。在细胞实验中，化合物24和28有效激活Nrf2调控基因并表现出抗炎作用，通过下调NLRP3炎症小体和STING信号激活实现。RNA测序显示其激活了细胞保护通路，并呈现出区别于典型共价Nrf2激活剂的独特转录谱。本研究凸显了片段引导药物发现（FBDD）方法在Keap1等挑战性靶标上的潜力，并引入了新型Keap1-Nrf2抑制剂作为化探针和药物候选物。
引言
蛋白相互作用（PPIs）在众多细胞功能中起核心作用，是许多疾病的理想药物靶标。尽管早期认为其"难以成药"，但片段引导药物发现（FBDD）等新技术为开发小分子PPI调节剂提供了可能。截至目前，已有7种FBDD衍生药物获批，其中两种针对PPIs。
Keap1与Nrf2的相互作用是氧化应激和炎症相关疾病的重要药物靶标。Keap1作为活性氧（ROS）感受器和Nrf2负调控因子，在生理条件下介导Nrf2泛素化降解。当细胞受到亲电或氧化应激时，Keap1半胱氨酸残基被修饰，导致构象变化并释放Nrf2。共价Nrf2激活剂（如多发性硬化症药物富马酸二甲酯）直接反应Keap1半胱氨酸，但其反应性可能导致脱靶结合和毒性问题。一种有前景的替代方法是开发靶向Keap1 Kelch结构域的非共价化合物，这些化合物通过结合Keap1 Kelch结构域与Nrf2 Neh2结构域肽段相互作用的口袋，具有更高的特异性。
开发有效的非共价Keap1-Nrf2抑制剂面临Kelch结合口袋的挑战。其埋藏表面积为550-780 Ų，虽小于多数PPIs，但仍大于典型小分子-蛋白相互作用。此外，该口袋包含三个精氨酸（Arg380, Arg415, Arg483），导致分子相对较大（>500 Da）且含羧酸基团，表现出低细胞通透性和较差口服吸收。因此，需要结合高亲和力与对抗酸极性的理化特性。近年来通过片段筛选、结构设计、前药开发等策略，已开发出兼具高亲和力、细胞活性和药代动力学特性的抑制剂，但尚未有非共价Keap1-Nrf2抑制剂进入临床试验。
为推进该领域发展，我们应用FBDD识别出新的化探针和药物候选物。本文展示了从毫摩尔级亲和力的片段优化为纳摩尔级Keap1-Nrf2抑制剂的完整案例，证明这些化合物具有选择性、细胞活性和抗炎作用，并利用RNA测序比较其激活的细胞保护通路与共价Nrf2激活剂的差异。
结果与讨论
从DSI-poised片段库筛选中，通过X射线晶体学在Keap1 Kelch结构域检测到80个高分辨率（1.0-2.1 Å）片段复合物，其中13个片段锚定在P3/P5亚口袋。片段1（Kd~0.7 mM，LE=0.25）由苯基核心和环己基乙酰胺取代基组成，与Keap1 Kelch结构域形成阳离子-π相互作用、氢键和疏水相互作用，被选为优化起点。
通过两步生长策略优化：第一步将片段1延伸酸性烷基链形成与Arg483的盐桥，获得Kd=160 μM的化合物4（LE=0.25）；第二步引入芳香取代基与Tyr525形成π-π堆积，获得Kd=1.1 μM的化合物12。通过引入对位甲氧基形成氢键，最终获得Kd=23 nM的苯并二氧杂环戊烯类似物19（LE=0.29）。进一步优化获得高亲和力化合物24和28（Kd=10和8.8 nM，LE=0.30和0.29）。
X射线晶体学显示，这些高亲和力抑制剂保持原始片段的结合模式，S型对映体更优。核-壳疏水塌陷可能促进结合构象，苯并二氧杂环戊烯基团与Gln530/Ser555的氢键进一步增强亲和力。热位移实验显示，化合物在16个人类Kelch结构域中仅对Keap1有显著结合（ΔTm>5°C），展现出卓越选择性。
在细胞活性实验中，化合物24和28在HaCaT细胞中显著激活AKR1B10、NQO1等Nrf2调控基因（Western Blot和qPCR验证），在BEAS-2B细胞中的EC50分别为110和60 nM。抗炎实验显示，这些化合物通过抑制NLRP3炎症小体激活（降低cleaved caspase-1和IL-1β释放）和STING信号通路（降低磷酸化STING和TBK1），显著减少炎症反应，同时不影响IFN信号通路。
转录组分析显示，非共价抑制剂（24、28和KI-696）上调基因数（175-193个）显著少于共价激活剂（DMF:845个；CDDO-Me:1091个），但共享29个核心基因。通路分析显示，化合物24激活细胞因子受体互作和JAK-STAT通路，同时调控纤维化、炎症和ROS代谢相关基因。Nrf2敲除细胞实验显示，非共价抑制剂的脱靶效应（347和266个基因变化）显著低于共价激活剂（DMF:3709个），证实其更高特异性。
结论
本研究通过结构引导的FBDD方法，开发出新型非共价Keap1-Nrf2抑制剂系列。从晶体筛选发现的片段1（Kd~0.7 mM）出发，通过系统优化获得纳摩尔级化合物（24和28，Kd=9-10 nM，LE=0.29-0.30）。X射线晶体学揭示其结合模式包括与Tyr525的π-π堆积和与Gln530/Ser555的氢键，化合物在结合口袋的紧凑构象可能增强亲和力。
这些化合物展现出卓越的Keap1选择性（15个同源Kelch结构域无显著结合），在细胞实验中有效激活Nrf2调控基因，并通过抑制NLRP3炎症小体和STING通路发挥抗炎作用。转录组分析显示其区别于共价激活剂的独特信号，同时调控纤维化和炎症相关基因。与低脱靶活性和激活保护性通路的特性相结合，这些新型非共价Keap1-Nrf2抑制剂展现出治疗潜力。
本研究凸显了FBDD方法应对挑战性PPI靶标的效用，为开发选择性Keap1-Nrf2抑制剂作为化探针和药物候选物奠定了坚实基础。未来的优化研究将聚焦其在氧化应激和炎症相关动物模型中的疗效评估。
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