可卡因化学遗传学通过合成生理机制抑制药物寻求行为
生理学中的化学反馈普遍存在，但研究时难以不干扰基础功能。成瘾药物就是一个典型例子，它们通过增加大脑多巴胺信号传导引发正反馈循环的药物寻求和摄入行为。然而，改变基础多巴胺水平会负面影响学习、运动、注意力和觉醒。受生理控制系统启发，我们开发了一种高选择性合成生理学方法，通过在身体-大脑信号循环中安装可卡因依赖的拮抗信号过程来干预成瘾的正反馈循环。
我们利用蛋白质工程技术创建了可卡因门控离子通道，在大鼠外侧缰核（LHb）表达兴奋性可卡因门控通道后，该通道抑制可卡因自我给药而不影响食物动机。这种人工可卡因激活的化学遗传过程减少了伏隔核的细胞外多巴胺升高。研究显示，可卡因化学遗传学通过夹制多巴胺释放选择性对抗药物强化作用。未来可为其他成瘾药物或激素、代谢物开发化学遗传受体，这将有助于使用合成生理学方法探索其神经环路机制。由于这些化学遗传离子通道对自然奖赏具有特异性，它们可能为可卡因成瘾提供基因疗法。
可卡因激活的离子通道
我们聚焦开发可卡因化学遗传受体，补充研究心理兴奋剂机制的工具。可卡因通过阻断多巴胺再摄取转运体（DAT）导致细胞外多巴胺水平升高。可卡因激活的化学遗传受体可系统研究特定神经元群体在维持可卡因寻求中的作用。由于DAT是可卡因拮抗的共转运蛋白，难以改造为可直接调节神经元活动的可卡因门控离子通道。但可卡因含有胺类药效团，与离子通道激动剂分子化学类似，因此我们采用蛋白质工程方法开发可卡因激活离子通道。
α7烟碱型乙酰胆碱（ACh）受体（nAChR）是配体门控离子通道，通过改变配体结合域（LBD）可赋予其新的药理特性。α7 nAChR的LBD可拼接到五羟色胺受体（5HT3）的阳离子选择性孔道域（IPD）或甘氨酸受体的阴离子选择性IPD，形成分别用于神经元激活或抑制的五聚体离子通道。重要的是，nAChR激动剂与成瘾药物具有结构相似的药效团。晶体结构显示可卡因与同源ACh结合蛋白（AChBP）的结合模式与尼古丁类似，提示可能通过改造LBD获得可卡因激活特性。
通过荧光膜电位检测筛选突变体，发现Leu141替换为Gly或Ala显著增强可卡因激动作用并降低ACh效力。Leu141的庞大侧链靠近可卡因的羧甲基酯基团，减少位阻冲突促进了可卡因结合和激动剂活性。进一步优化获得α7(L141G,G175K,Y210F,Y217F)-5HT3突变体（命名为coca-5HT3），其可卡因EC50为1.5±0.3 µM，远低于大鼠脑内可卡因浓度（~2.5-20 µM）。该通道对内源性nAChR激动剂（ACh和胆碱）效力极低，仅为生理浓度的1/100。放射性配体结合实验显示coca-5HT3具有高亲和力结合位点（KiH=1.6±0.9 nM），优于其天然靶标DAT的亲和力范围（0.23-2.0 µM）。值得注意的是，coca-5HT3不被可卡因代谢物（ecgonine和苯甲酰芽子碱）激活，对其他成瘾药物（苯丙胺、甲基苯丙胺、吗啡、海洛因和羟考酮）也无反应。
可卡因化学遗传学抑制自我给药
我们测试了可卡因化学遗传学对抗可卡因强化作用的效果。外侧缰核（LHb）通过激活RMTg GABA神经元和VTA GABA神经元发挥抗奖赏功能，这些神经元抑制VTA多巴胺神经元。在体内，LHb通常被可卡因抑制，这种抑制是瞬时的（0-15分钟），与可卡因脑暴露时间短的特征一致。我们假设在LHb神经元中表达coca-5HT3兴奋通道可逆转可卡因引发的抑制反应，建立人工可卡因依赖信号节点。
使用静脉药物自我给药（IVSA）模型评估滥用可能性。在IVSA模型中，自愿可卡因摄入依赖输注剂量，呈倒U型剂量反应曲线。干预使剂量反应曲线向下偏移表明具有临床疗效，而向右偏移则可能导致代偿性药物增加。通过立体定位注射AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry靶向LHb，在获得性自我给药阶段，实验组与对照组无显著差异，但低剂量（0.125和0.25 mg/kg）下实验组输注次数显著减少。混合效应ANOVA显示剂量×转基因交互作用显著（P=0.02）。
验证自然行为影响时，coca-5HT3表达不影响蔗糖偏好（双因素RM-ANOVA，P=0.39）或操作反应（P=0.63），也不影响新环境下的运动活性（P=0.83）。这些实验确认在无可卡因情况下，LHb中coca-5HT3表达不影响运动、享乐食物偏好或蔗糖操作反应。
可卡因化学遗传学抑制多巴胺升高
多巴胺升高是可卡因强化特性的关键，而LHb神经元活动负向调节伏隔核多巴胺释放。我们假设LHb中coca-5HT3的可卡因激活会减少伏隔核多巴胺升高。使用小动物PET和[18F]fallypride放射性示踪剂，发现对照组可卡因显著降低伏隔核和背内侧纹状体的[18F]fallypride结合，而实验组抑制效果减弱。三因素RM-ANOVA显示时间×转基因×脑区交互作用显著（P<0.001）。独立实验确认LHb中coca-5HT3表达不影响纹状体多巴胺浓度（P=0.31），表明可卡因激活coca-5HT3抑制伏隔核多巴胺升高。
进一步通过光纤光度法使用GRABDA传感器验证，在麻醉大鼠中对照组可卡因显著增加GRABDA信号，而实验组无显著变化。AUC分析显示实验组GRABDA反应显著降低（P=0.01）。这些结果共同表明，LHb中coca-5HT3激活通过抑制伏隔核多巴胺升高来拮抗可卡因效应。
讨论与展望
本研究展示了一种生理启发的化学遗传学方法，通过可卡因直接响应建立人工反馈过程，在可卡因进入大脑时抑制药物寻求。这种干预通过工程化激活通常被可卡因抑制的环路，降低伏隔核多巴胺升高。工程化的可卡因门控通道对生理相关剂量的内源性分子和其他成瘾药物（包括尼古丁）不敏感，可专门在药物暴露期间创建拮抗信号过程。
化学反馈过程普遍存在但研究困难，传统方法通常干扰基础功能。可卡因化学遗传学通过将化学遗传调制与药物自我给药和脑药代动力学内在耦合，实现了独特的时间控制。研究发现仅在可卡因暴露期间激活LHb神经元，通过减少多巴胺释放抑制高努力可卡因自我给药。这种效应与开放环化学遗传抑制VTA多巴胺神经元的效果一致。
该方法可扩展研究其他神经群体对成瘾行为的贡献。例如，激活疼痛或不适神经群体可能改变药物自我给药，类似戒酒硫机制。未来可开发针对其他成瘾药物或药物组合的化学遗传受体，研究其神经环路机制。基于成瘾药物的研究，这些闭环化学遗传方法可应用于其他身体-大脑信号过程，如激素或营养素信号。
值得注意的是，该化学遗传受体对可卡因的选择性优于食物奖赏。这很重要，因为可卡因改变的信号通路也用于处理自然奖赏。激活LHb仅在摄取可卡因时发生，避免影响健康生理相关奖赏的动机。由于这些化学遗传离子通道具有可卡因特异性，它们可能最终发展为选择性治疗可卡因成瘾的基因疗法，而不影响自然奖赏的享受。
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