新研究揭示了如何通过精细调节视黄酸代谢使墨西哥钝口螈再生复杂肢体，为再生医学开辟了新的可能性。
在最近发表于《自然通讯》杂志上的一项研究中，美国的研究人员探讨了细胞色素P450家族26亚家族B成员1（CYP26B1）介导的视黄酸（RA）分解如何调控墨西哥钝口螈肢体再生过程中的近端-远端（PD）身份。
该研究还解决了关于再生过程中RA梯度是如何建立的问题，并探讨了这些机制如何转化为未来再生医学的应用。
背景
想象一下，失去一条肢体并看着它完美地再生，从骨头到关节一一恢复。虽然对人类来说这听起来像是科幻小说，但墨西哥钝口螈却能常规地做到这一点。它们以惊人的精度再生肢体，从肩部（股骨段）到手部（自动段）。这种能力依赖于胚芽，这是一种干细胞簇，能够“记住”它们的原始位置。视黄酸影响这种记忆，但在再生过程中其水平是如何控制的仍不清楚。理解这些控制机制可能会改变再生医学。进一步的研究需要解码指导位置身份的分子机制。作者还指出，尽管视黄酸在位置身份中的重要性已得到确认，但视黄酸合成是否沿肢体轴分级或均匀且受局部降解控制仍是一个未解之谜。
研究方法
该研究利用了在定义的近端-远端（PD）水平截肢的墨西哥钝口螈，包括上股骨段（US）、下股骨段（LS）、上腕骨段（UZ）和自动段（A），以研究视黄酸信号传导。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、杂交链反应荧光原位杂交（HCR-FISH）和单细胞核糖核酸测序（scRNA-seq）被用于评估基因表达。涉及视黄酸合成的酶和基因，如视黄醛脱氢酶1（RALDH1）、RALDH2和RALDH3，视黄酸降解，如CYP26A1和CYP26B1，以及视黄酸响应，包括视黄酸受体α（RARA）和视黄酸受体γ（RARG），在近端胚芽（PBs）和远端胚芽（DBs）中进行了分析。
为了操纵视黄酸水平，动物被用塔拉唑（TAL，也称为R115866）处理，浓度分别为0.1微摩尔（μM）、1 μM和5 μM。视黄酸活性通过视黄酸反应元件：增强型绿色荧光蛋白（RARE:EGFP）报告动物进行测量。在某些实验中，TAL与二硫代氨基甲酸酯（DIS）结合使用，后者是一种泛RALDH抑制剂，或AGN 193109（RAA），一种泛视黄酸受体（RAR）拮抗剂。评估了模式基因Meis同源盒1和2（Meis1, Meis2）、同源框A簇基因（Hoxa9, Hoxa11, Hoxa13）和矮小同源盒（Shox, Shox2）的表达。使用成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）生成Shox敲除动物（Shox-/-），以评估其功能作用。
研究结果
研究证实，视黄酸信号沿PD轴变化，在近端胚芽中的水平高于远端胚芽。CYP26B1在远端胚芽的间充质中表达显著较高。相比之下，与近端身份相关的视黄酸响应基因Meis1和Meis2在近端胚芽中富集。Hoxa13在远端胚芽中高度表达。这些表达模式与肢体节段位置相匹配，并且在进化上保守。
通过TAL抑制视黄酸降解会增加视黄酸信号，如RARE:EGFP报告器所显示的那样，并诱导从远端截肢处出现近端肢体重复。TAL处理导致远端胚芽再生股骨段或腕骨段而不是自动段。在1 μM TAL处理下，66.7%的远端胚芽发展出完整的股骨段重复。相比之下，同样浓度的TAL处理近端截肢肢体则正常再生，尽管高剂量会损害再生。这些效应确认了CYP26B1调节对节段特异性模式至关重要的视黄酸浓度。
TAL处理的远端胚芽显示出Hoxa13减少而Meis1增加的表达。RNA测序揭示了剂量依赖性的转录重编程，TAL处理的远端胚芽采用了与DMSO处理的近端胚芽相似的表达谱。差异表达基因包括Shox和Shox2，它们是视黄酸响应的，并在近端胚芽中富集。Shox表达与Hoxa13呈负相关并与Meis1共定位，表明它在视黄酸信号传导和Meis1下游起作用。作者指出，Meis1可能在这个调控级联中位于Shox上游，这得到了启动子分析的支持，并且Shox和Hoxa13表达细胞是互斥的。
使用CRISPR/Cas9诱导的Shox敲除动物的功能研究表明，Shox-/-墨西哥钝口螈发育出缩短的股骨段和腕骨段，伴有受损的软骨内骨化。组织学染色和苏木精-伊红分析显示，未成熟的软骨细胞未能成熟为骨骼。然而，自动段保持不变。尽管存在这些骨骼缺陷，Shox-/-动物仍能再生肢体，这证实Shox对于再生不是必需的，但对于近端骨骼节段的模式至关重要。研究还观察到，在某些情况下，Shox2表达可以部分补偿Shox的缺失，尽管近端缺陷仍然存在，并且远端元素的软骨细胞形成与Shox无关。
Shox表达主要在间充质细胞中观察到，并在TAL处理的远端胚芽中被激活。当TAL与DIS或RAA联合给药时，远端胚芽的近端化被阻止，表明视黄酸合成和受体介导的信号传导都是这种效应所必需的。此外，在接受TAL处理的Shox-/-动物中，肢体重复发生，但重复的节段发育不良，表明Shox对于执行而非启动视黄酸诱导的近端模式是必要的。
虽然该研究提供了强有力的证据，证明Cyp26b1介导的视黄酸降解控制节段身份，但也讨论了再生过程中Cyp26b1的上游调控因子（如Hoxa11、Hoxa13或FGF信号）仍有待确定。
结论
总之，这项研究表明，CYP26B1依赖的视黄酸降解在墨西哥钝口螈肢体再生过程中近端-远端身份的建立中至关重要。通过调整胚芽中的视黄酸水平，CYP26B1使模式基因在特定节段被激活。高水平的视黄酸通过Meis1和Shox促进近端身份，而视黄酸降解支持由Hoxa13标记的远端身份。Shox对于股骨段和腕骨段的形成和骨化至关重要，但不是自动段形成或整体再生所必需的。
这些发现也与节段特异性阈值模型（类似于法国国旗模型）一致，尽管论文强调了视黄酸合成本身是否沿PD轴均匀或分级尚不确定。这些见解强调了局部视黄酸代谢在再生复杂结构中的重要性，并可能为未来的再生策略提供信息。
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