摘要
背景
中风是导致死亡的主要原因，患者常出现严重残疾。中风分为缺血性（血管阻塞导致脑血流减少）和出血性（血管破裂导致脑内出血）。转化生长因子β1（TGF-β1）作为多效性细胞因子因其对增殖、细胞外基质沉积和炎症的多重作用被研究。本综述系统评估了TGF-β1在缺血性和出血性中风的临床前研究中的作用。
方法
通过PubMed、Web of Science和Scopus数据库检索了以TGF-β1信号为结局或干预措施的动物研究。共纳入89项研究：68项缺血性中风研究，21项出血性中风研究。根据SYRCLE指南评估研究偏倚，提取方法学和TGF-β1作用的数据。
结果
研究显示SYRCLE指南符合度低，中风模型方法学存在差异。多项干预措施可调节TGF-β1表达或信号传导，外源性TGF-β1在所有缺血性中风研究中均改善结局。TGF-β1在76%的缺血性中风研究中具有保护作用，而在33%的出血性中风研究中具有保护作用，后者可能与纤维化发展有关。
结论
研究发现TGF-β1在两类中风中的功能存在显著差异，出血性中风后血液细胞毒性可能产生比缺血性中风更持续的TGF-β1表达，导致TGF-β1介导的纤维化和脑积水，而缺血性中风后发挥神经保护作用。这些发现提示缺血性中风后使用外源性TGF-β1疗法，出血性中风后使用TGF-β1抑制剂可降低发病率和残疾率。
图形摘要
非标准缩写和首字母缩写表
BBB血脑屏障
CBF脑血流
GMH生发基质出血
ICH脑内出血
IVH脑室出血
LRG1亮氨酸富集α-2糖蛋白1
MCAO大脑中动脉阻塞
NSS神经严重程度评分
ROB偏倚风险
SAS蛛网膜下腔
SYRCLE实验动物研究系统评价中心
TGF-β1转化生长因子β1
ZEB1锌指E-box结合同源盒1
研究视角
新发现
• 系统分析缺血性和出血性中风的临床前模型发现，转化生长因子β1在76%的缺血性中风研究中相关或导致保护作用，但在出血性中风研究中仅33%具有保护作用。
• 注射外源性转化生长因子β1在所有涉及这些终点的缺血性中风研究中均改善神经学评分、恢复或梗死体积。
下一步需解决的问题
• 缺血性中风后使用外源性转化生长因子β1，以及出血性中风患者使用转化生长因子β1阻断剂或拮抗剂预防出血后脑积水或纤维化是否具有临床潜力？
中风是西方世界的首要致死原因[1]，人群发病率约为3%[2]，缺血性中风和颅内出血的病例死亡率分别为46%和61%[3]。幸存者中最高达50%会慢性致残[4]，造成显著经济负担，欧洲卫生支出占比达1.7%[5]。人口老龄化及高血压、饮食不良和腹部肥胖等风险因素持续增加预计将进一步加重公共健康负担[6]。
中风分为缺血性和出血性，两者均导致脑组织血氧输送减少，迅速导致细胞功能和活力丧失[7]。缺血性中风占比80%[4]，通常由脑血流栓塞触发。出血性中风占20%[4]，但死亡风险显著高于缺血性中风[8]。出血性中风特征为血管破裂导致脑实质（脑内出血[ICH]）、脑室系统（生发基质出血[GMH]/脑室出血[IVH]）或蛛网膜下腔（蛛网膜下腔出血[SAH]）出血，导致组织氧合减少[9]。虽然这些情况均与组织或脑脊液空间出血相关，但触发事件和出血部位的差异会导致不同形式的出血性中风结局出现显著差异。整体而言，出血性中风在硬膜间隙、实质或脑室产生游离血液，导致血肿形成和脑肿胀。与缺血性中风相同，早期诊断和治疗对患者生存且无重大神经功能缺损至关重要。
炎症在缺血性和出血性中风中均起关键作用，由组织损伤或脑组织对游离血液的反应触发[10]。炎症级联反应包含一系列受体、细胞和细胞因子，但转化生长因子β1（TGF-β1）作为多效性细胞因子被广泛关注。TGF-β1可通过Smad信号通路影响增殖、分化、凋亡和免疫细胞激活[11]。TGF-β1已被证明可上调星形胶质细胞I型纤溶酶原激活物抑制剂[13]，促进血管生成[14,15]，并通过下调核因子κβ减少炎症[16]。此外，TGF-β1激活在细胞外基质重塑中起关键作用，通过Smad2/3信号传导控制包括纤维连接蛋白和胶原蛋白的基质蛋白沉积[17]。虽然TGF-β1通路通常被严格调控，但严重创伤（如中风）可能导致失调，引发过度无序的细胞外基质沉积（即纤维化）[19]。
本系统综述旨在调查TGF-β1在缺血性和出血性中风的临床前动物模型中的作用。目前比较TGF-β1在两类中风中作用的研究较少，多数人体研究局限于检测脑脊液中TGF-β1水平。而临床前动物模型可研究TGF-β1表达、信号通路、纤维化形成、组织活力等关键终点，这些在人体研究中无法实现。更深入理解TGF-β1上调在中风中的影响，将有助于开发改善这一致命疾病的预后疗法。
方法
协议注册
本系统综述研究方案已在PROSPERO注册（编号CRD42022341574），遵循PRISMA指南[20]（表S1）。
检索策略和数据来源
2024年1月18日，通过PubMed检索了涉及SAH、蛛网膜下腔出血、缺血性/出血性卒中，以及转化生长因子β1或TGFβeta1的相关文献。Web of Science和Scopus数据库也进行了系统检索。
纳入排除标准
纳入体内外和人体内研究被排除在筛选之外。出血性卒中模型包括血液/血液制品注射、胶原酶注射、血管内穿刺及遗传模型。缺血性卒中模型包括暂时性和永久性大脑中动脉闭塞（MCAO），排除缺氧诱导的全脑缺血模型。任何包含TGF-β1应用的干预均被纳入，无需比较组。
结局
主要结局包括TGF-β1或其信号通路的任何改变。排除将TGF-β1作为大型炎症分子面板（如RNA测序）一部分的研究。
数据收集、合成与呈现
提取数据时包含模型类型、诱导技术、干预措施、动物物种和数量等方法学信息。记录测量的结局、任何干预的影响以及数据形成的整体结论，特别关注TGF-β1依赖性结局或信号通路变化。根据可用数据，将TGF-β1的作用简要总结为保护性或有害性。"保护性"和"有害"定义为导致死亡率、发病率或相关分子标记客观减少或增加，"不确定"则指结局混合或作用描述不清的研究。数据提取由一名研究者完成，第二名研究者进行验证，必要时由第三名研究者讨论解决。生成PRISMA流程图和数据叙事合成，使用GraphPad Prism 10.0进行图表生成。
统计分析
对缺血性卒中中外源性TGF-β1研究和出血性卒中中的TGF-β1抑制剂/拮抗剂研究进行荟萃分析，使用RevMan 5.4生成森林图。采用标准均差作为效应量，进行随机效应模型和固定效应模型分析。缺血性卒中研究使用梗死体积作为结局指标，出血性卒中研究使用侧脑室体积作为结局指标。数值直接从文章中获取或使用WebPlotDigitizer提取。
结果
检索结果
Scopus（632篇）、Web of Science（469篇）和PubMed（271篇）共收集1372篇文章，删除307篇重复文献。标题和摘要筛选后删除948篇无关文献。117篇全文评估后排除28篇（图1）。排除原因包括模型不当[25,26,27]、体外实验[28,29]、与TGF-β1无关[30,31]、全文不可用[32,33,34,35,36,37,38,39]、无实验对照[40]，以及测量不当结局或作为大型分子面板一部分的研究[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52]。最终纳入89项研究进行分析（表S2和S3）。
临床前动物研究中的卒中建模：研究设计
缺血性卒中模型
89项研究中68项建模缺血性卒中，其中52项使用经动脉阻塞（MCAO）模型，12项使用永久性MCAO，4项使用光化学栓塞，2项使用自体血块颈动脉注射。MCAO时间在暂时性MCAO研究中差异显著（20分钟至2天），最常见闭塞时间为60、90和120分钟（占89项中的36项）。
出血性卒中模型
21项研究建模出血性卒中，包括8项SAH、7项ICH和6项GMH/IVH。SAH通过大脑中动脉或颅内颈动脉血管内穿刺或血液制品注入延髓池诱导。ICH通过血液制品或胶原酶注入脑实质诱导，IVH/GMH通过血液、胶原酶或甘油的脑室内注射诱导。
使用的动物物种和品系
98.9%（89项中的88项）使用啮齿类模型。53项研究使用大鼠（Sprague-Dawley 33项、Wistar 14项、自发性高血压大鼠3项、Lewis大鼠1项），31项使用小鼠（C57BL/6或C57Bl/6J 19项、CD-1 4项、昆明小鼠1项、BALB/C 1项、转基因小鼠7项、未披露2项）。2项研究使用新西兰白兔，1项使用仔猪。81.8%（73/89）使用雄性动物，8项使用混合性别，5项仅使用雌性动物，3项未披露性别。
TGF-β1测量
52项缺血性卒中研究（76%）和13项出血性卒中研究（62%）直接测量TGF-确证技术包括PCR（16项）、原位杂交（4项）、Western blot（26项）、免疫组化（20项）以及ELISA或Luminex（6项）。研究通常在卒中诱导后几天内进行测量，仅少数进行时间过程实验。一项研究显示，MCAO后7天核心区TGF-β1基因表达达峰，在梗死周围区轻度增加，对侧半球保持低水平[53]。ELISA研究显示TGF-β1在脑组织中增加（186.2-53,200 pg/g）。
在出血性卒中中，Western blot（7项）和ELISA（6项）最常用于测量TGF-β1，其次为PCR（4项）和免疫组化（3项）。通过ELISA测量脑脊液TGF-β1显示SAH或IVH后2-3周内TGF-β1水平增加（69.3-315.5 pg/mL）[54,55,56,57]。一项兔研究显示IVH后脑脊液TGF-β1减少[58]。
TGF-β1的保护或有害作用
缺血性卒中模型
68项缺血性卒中研究中，52项（76%）显示TGF-β1补充或表达具有保护作用，10项（15%）显示有害作用，6项（9%）显示不确定。76%的保护作用研究中，TGF-β1与梗死体积减少、神经功能评分改善相关。有害作用研究中，TGF-β1信号抑制与梗死体积增加相关[64,78,107,118]。
出血性卒中模型
21项出血性卒中研究中，7项（33%）显示保护作用，11项（57%）显示有害作用，3项显示不确定。57%的有害作用研究中，TGF-β1与蛛网膜下腔纤维化和侧脑室扩大相关[54,56,135,138]。TGF-β1拮抗剂（如decorin、LSKL、SD208、吡非尼酮、洛沙坦）在SAH/GMH研究中显示显著改善神经严重程度评分和减少脑室扩大的作用[54,56,124,125,135]，而口服TGF-β1拮抗剂在IVH模型中作用不确定[134]。对6项SAH/GMH研究进行荟萃分析显示TGF-β1抑制/拮抗剂显著减少脑室体积（随机效应模型：标准化均差−1.03 [95% CI −1.62至–0.44]，I²=78%）[54,56,124,125,135]。
研究偏倚
本综述纳入的临床前中风研究通常对SYRCLE RoB工具符合度较低，89项研究中平均符合SYRCLE RoB标准为3.90项，2项研究0项符合，无研究完全符合10项标准（图7）。
讨论
本综述揭示了临床前卒中研究中模型和方法学的多样性。多数缺血性卒中研究使用Longa MCAO模型或其改良模型，该模型可在不进行开颅的情况下可逆性诱导脑缺血[139]。尽管缺血时间差异显著（图2），但这未影响TGF-β1的作用。既往研究显示Longa MCAO方法与Koizumi方法的炎症反应存在差异[140]，表明方法学在研究结果中起重要作用。出血性卒中模型方法更具多样性，包括ICH、IVH、SAH和GMH的不同建模方式。标准化方法学可能有助于确保研究结果的真实性和可比性。
研究发现TGF-β1在缺血性卒中中可能发挥保护性抗炎作用，在出血性卒中中则可能通过纤维化和脑积水产生有害作用。在缺血性卒中中，TGF-β1的主要益处在于氧化应激/炎症、血管/血脑屏障和凋亡/神经保护。有害作用研究主要集中在纤维化和炎症。在IVH和SAH模型中观察到TGF-β1的类似负面效应，主要与纤维化和脑积水发展相关。ICH研究结果不一，TGF-β1可减少炎症但增加凋亡并影响血脑屏障。需注意仅33/89项研究直接调控TGF-β1（外源或抑制剂），多数研究仅显示相关性。
缺血性卒中未干预研究显示TGF-β1激活增加与多种治疗结局指标改善相关。TGF-β1在新血管形成[14]和血管重塑[85]中的作用已被证实，其促血管生成功能可改善缺血组织血流和亚急性期功能恢复[144]。TGF-β1还被证明可限制出血转化[72,75,81]。出血转化是缺血性卒中的常见严重并发症，脑卒中后炎症导致血脑屏障破坏，使血液从循环系统渗出到脑组织[145]。因此TGF-β1在减少缺血性卒中主要影响（组织缺血和脑血流减少）和继发性损伤（如出血转化）方面均具有实用价值。
多数缺血性卒中研究通过外源性TGF-β1给药进一步探讨其效应。所有纳入的外源性TGF-β1研究均显示比对照组有更好的结局指标改善，无论剂量或给药途径如何。荟萃分析（图5）进一步支持这一发现，显示外源性TGF-β1或TGF-β1过表达研究的综合效应量显著减少了治疗动物的梗死体积。研究间异质性显著，这可能是由于TGF-β1剂量或过表达载体的使用差异所致。
鼻内给药和延髓池、脑室、颈动脉和皮层注射均能改善主要功能结局指标，包括神经严重程度评分和梗死体积。抗炎剂通过多种途径显著减少炎症因子和氧化应激标志物，与TGF-β1水平增加相关。炎症治疗已被提议作为缺血性卒中的治疗靶点，旨在限制神经元损伤并改善神经功能恢复[146]。TGF-β1给药或上调可限制凋亡，多项研究显示凋亡标志物和梗死区域减少。
研究显示，外源性细胞因子研究和TGF-β1或其信号通路遗传修饰研究也得到相似结果。此外，3项研究发现TGF-β1信号抑制与恶化结局相关[73,74,88]。需注意某些遗传修饰研究显示TGF-β1过表达与恶化结局相关[64,78,107,118]。星形胶质细胞TGF-β1过表达已被证实与胶质激活、脑积水和淀粉样蛋白沉积相关[147]。推测过表达方法可能导致持续性异常高水平的TGF-β1，远超正常炎症反应。一项研究发现缺血性卒中亚急性期升高的TGF-β1导致皮质纤维化和胶淋巴系统脑脊液外流减少[67]。TGF-β1与纤维化广泛相关，高浓度可触发伤口愈合模型中的过度无序细胞外基质沉积[148,149,150]。在缺血性卒中治疗中考虑TGF-β1使用时，时机可能至关重要，卒中后过晚给药可能无法限制主要影响（梗死体积、凋亡、出血转化），反而增加纤维化风险，恶化结局。
本综述表明TGF-β1可能在缺血性卒中中具有保护作用，在出血性卒中中可能恶化结局。TGF-β1拮抗或抑制在出血性卒中研究中通常与结局改善相关，通常通过神经严重程度评分和脑室扩大（脑积水标志）评估。既往研究显示TGF-β1过表达可导致脑积水和先天性脑积水模型[151]，以及通过鞘内注射外源性TGF-β1[125]。推测在出血性卒中中，TGF-β1可能发挥促纤维化作用，与缺血性卒中中的治疗作用形成对比。本综述中的一项研究探讨了CBR2在IVH后调节TGF-β1水平的作用，发现TGF-β1下调可减少蛛网膜下腔纤维化[57]。蛛网膜下腔纤维化已被证实在TGF-β1依赖性方式中通过蛛网膜颗粒和胶淋巴系统减少脑脊液外流而产生脑积水[152]。出血性卒中后降低TGF-β1水平可能减少脑积水导致的发病率，最终提高生活质量。
机制假设
TGF-β1在缺血性和出血性卒中中作用差异的潜在机制尚待直接研究。假设炎症刺激的性质可能是TGF-β1在卒中中作用的决定因素。血液及其代谢产物被广泛认为具有脑毒性，加剧卒中物理破坏的影响[10]。因此，清除血肿的手术和药物治疗被研究用于减少出血性卒中后的继发性脑损伤[154,155,156]。观察性临床前缺血性卒中研究显示TGF-β1表达早期高峰在损伤后3天[157]或7天[16,77,85]出现，随后在损伤亚急性期略有升高[82,109]。研究显示MCAO损伤后TGF-β1表达或信号传导增加2-3倍[67,85]。而出血性卒中研究中，脑脊液TGF-β1水平在损伤后14-21天增加，一项研究显示损伤后14天TGF-β1水平比对照组高10倍[158]。假设TGF-β1表达和信号传导的时间、位置和强度可能决定分子作用。出血性卒中后血液产物产生的持续性细胞毒性损伤可能导致TGF-β1持续性高水平释放，远超缺血性卒中后水平。这可能导致TGF-β1在缺血性卒中中可能的治疗作用转变为出血性卒中中的促纤维化作用。此假设得到证据支持，持续或重复的TGF-β1表达与肝病[159]和胰腺炎[160]中的纤维化严重程度相关。这种效应也可解释TGF-β1过表达在缺血性卒中研究中的负面作用[64,78,107,118]，长期上调超过缺血性卒中后通常观察到的水平。
如图8所示，本系统综述显示TGF-β1在缺血性卒中中具有神经保护性和抗炎作用。值得注意的是，所有使用外源性TGF-β1的研究均显示结局改善。而在出血性卒中模型中，TGF-β1可能加重纤维化和脑积水。假设出血性卒中血液进入蛛网膜下腔、脑室和脑组织可能产生比缺血性卒中更持续和高水平的TGF-β1表达。这种持续高水平的TGF-β1可能使分子作用从修复转向促纤维化，增加继发性脑损伤和额外发病率。比较不同卒中类型中TGF-β1表达或信号传导的强度和时间过程的进一步研究可验证或推翻该假设。本综述也显示TGF-β1在卒中中的临床重要性，局部应用的TGF-β1抑制剂可改善出血性卒中结局，虽不如缺血性卒中中外源性TGF-β1治疗效果显著。合适的TGF-β1治疗递送和时机可能减少原发和继发性脑损伤，降低卒中后发病率。
【全文结束】
