背景：肠道微生物组与结直肠癌(CRC)的关联日益受到关注。多项对粪便和结肠组织的微生物组调查已帮助定义了CRC的多微生物特征并指导我们理解肿瘤相关群落。这些研究发现多种细菌在CRC中富集，包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、小单胞菌属(Parvimonas micra)、消化链球菌属(Peptostreptococcus stomatis)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas asaccharolytica)和摩氏摩拉菌(Gemella morbillorum)，而通常有益的、产生短链脂肪酸的菌群则常减少。随后的实验工作表明，某些候选细菌如具核梭杆菌可通过与宿主上皮细胞的相互作用引发肿瘤发生，这些相互作用由粘附素和毒素递送介导。此外，细菌通过免疫调节和(局部)炎症对CRC进展的间接影响也有充分记录。
尽管在从宏基因组数据中界定CRC相关微生物特征方面取得了进展，但关于这些特征的稳健性和泛化性仍存在重要问题：不同研究间的技术和生物异质性如何影响这些特征？样本收集、DNA提取和测序方法的差异有多大影响？地理和人口差异是否会影响CRC特征？CRC特征在不同癌症亚型和阶段中是否通用？早期发病CRC(EO-CRC)的肠道微生物组变化是否与更常见的晚期发病CRC(LO-CRC)不同？EO-CRC尤其值得关注，因为其发病率不断上升且早期检测具有挑战性。最近比较EO-CRC与LO-CRC肠道微生物组变化的研究表明可能存在特定的EO-CRC肠道微生物特征，但这些发现地理限制性强且受到其他研究的质疑，需要在多样化人群中进一步调查。
为解决这些问题，本研究呈现了一个全面的CRC肠道微生物组元分析，其中我们对6,779个病例-对照粪便样本（来自15个国家的27项研究）以及906个肿瘤组织样本进行了统一重新分析。我们发现由此元分析得出的肠道微生物CRC特征对研究异质性具有显著的稳健性，并强烈反映肿瘤组织富集的微生物。我们将此特征统一为一个统计分类器，该分类器能够准确区分CRC与对照组的粪便微生物组谱，并探索了检测准确率如何随发病年龄、肿瘤位置、阶段和癌前病变而变化。我们进一步研究了CRC分类评分如何与饮食模式相关并可通过饮食干预进行调节。最后，我们进行了微生物毒力因子(VFs)的功能元分析，以及探索Fusobacterium亚种之间地理差异的基因组、菌株解析分析。
结果：为全球调查肠道微生物CRC特征，我们从15个国家的27项已发表研究中获取了6,779个病例-对照粪便样本的公共数据，通过系统性PubMed搜索识别(补充表S1和S2；见STAR方法)。这包括在诊断时和治疗前生成的鸟枪法(WGS)和16S数据。我们重新计算了分类谱，便于两种数据类型的整合分析(见STAR方法)。这产生了据我们所知迄今为止分析的单一疾病最大微生物组数据集。
首先，我们使用主坐标分析(PCoA)评估了研究和测序方法间微生物组组成的整体变异(图1A和S1)。研究特异性差异解释了大量群落结构(Bray-Curtis，PERMANOVA R² = 0.18，p < 0.001；图1A)，与先前发现一致。特别是16S数据集中，PCR靶向的高变区引发了明显的分离(Bray-Curtis，PERMANOVA R² = 0.096，p < 0.001；图S1)。相比之下，CRC病例和对照组(在合并数据集)之间的组成差异更为细微但显著(PERMANOVA R² = 0.003，p < 0.001；图S1)。总体而言，这一分析促使我们使用下游统计方法来解释研究异质性。
为评估不同测序方法对个体肠道微生物与CRC关联的影响，我们使用线性混合效应模型(LMM)框架对16S(n = 4,831)和WGS(n = 1,948)谱进行了347种常见细菌属的单独元分析，该框架考虑了研究异质性(补充表S3；STAR方法)。对于两种测序方法，我们观察到先前描述的CRC相关细菌富集——包括消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小单胞菌属(Parvimonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)——以及与短链脂肪酸产生相关的健康相关属的减少，如毛螺菌属(Lachnospira)。尽管存在研究异质性，CRC相关属在16S和WGS数据集之间的一致性非常高(图1D；效应大小估计的Pearson's R² = 0.65，Jaccard指数 = 0.41)。
我们进一步研究了机器学习分类器是否能够利用微生物组差异来区分CRC病例和对照组，以及这些模型是否利用了测序方法特定的分类特征。具体而言，我们在标准化属水平相对丰度谱上分别对16S或WGS数据集进行随机森林分类器的交叉验证(见STAR方法)。对于两种数据类型，分类器均实现了高内部检测准确率(曲线下面积[AUC] = 0.80 对 16S；0.81 对 WGS)。有趣的是，当将这些模型应用于跨数据类型(即在16S数据上训练的WGS数据分类器，反之亦然)时，它们保持了高预测准确率(AUC ≥ 0.78；图1E)。与我们对单变量属关联的比较类似，这些结果表明机器学习模型捕获了一个通用的CRC特征，该特征仅受到不同方法生成的微生物组谱差异的最小影响。
基于CRC特征对研究异质性的稳健性，我们着手在合并数据集上研究CRC的相关亚组(见图1)。在这些亚组中，EO-CRC因其全球发病率不断上升而成为首要研究对象。我们对EO-CRC相关微生物组变化进行了迄今为止最大规模的研究，超越了先前基于中国(东部)患者人群报告EO-CRC和LO-CRC具有不同特征的研究。为此，我们根据年龄将CRC病例分为EO-CRC(诊断年龄<50岁)和LO-CRC(年龄≥50岁)组，覆盖总共22个具有年龄发病注释的研究(总计n = 5,663；补充表S1)。我们分别对LO-CRC和EO-CRC进行了属水平关联的元分析，基于上述相同的LMM方法。有趣的是，这揭示了EO-CRC和LO-CRC高度一致的微生物富集模式，具有相似的方向性和跨研究的效应大小(图2A和S2；补充表S4)。值得注意的是，在CRC中富集最显著的属，包括消化链球菌属(Peptostreptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、小单胞菌属(Parvimonas)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，在不同发病年龄下特别一致(图2B)，EO-CRC和LO-CRC之间的效应大小总体高度相关(Pearson's R² = 0.82，Jaccard指数 = 0.48)。
此外，当我们直接使用LMM测试EO-CRC和LO-CRC之间的差异时，我们发现了一些差异丰度属，但效应大小非常小(图S2)。与此一致，我们在β多样性分析中观察到EO-和LO-CRC样本之间的显著重叠，发病年龄仅解释了总体变异的很小部分(图S2)。香农多样性在EO-和LO-CRC之间或EO-和LO-对照组之间没有显著变化。当直接对比CRC状态和发病年龄所解释的属丰度变异时，我们发现CRC状态比年龄解释了更多的微生物组变异(对于关键属消化链球菌属、梭杆菌属、小单胞菌属和卟啉单胞菌属，分别为8%-16%和<1%；图2C)。EO-CRC和LO-CRC在肠道微生物属方面的差异对界定EO-CRC和LO-CRC的年龄截点不敏感(图S2；补充表S4)。总体而言，这些分析强调CRC相关微生物组变化局限于少数几个属，疾病关联明显占主导地位。
为进一歩证实EO-CRC和LO-CRC之间微生物组特征的相似性，我们还测试了机器学习模型在年龄组之间的可转移性。为此，我们独立训练了EO-CRC和LO-CRC数据集的分类器，并在另一个(保留的)年龄组上评估分类器。通常，机器学习分类器对特征分布的细微差异很敏感；因此，如果富集模式在EO-CRC和LO-CRC之间(相对于各自对照组)存在差异，那么在LO-CRC上训练的分类器在EO-CRC上应表现出较差的预测性。然而，这里我们观察到，仅在EO-CRC上交叉验证的分类器(以及与年龄匹配的对照组，AUC为0.79)与仅在LO-CRC上训练并在EO-CRC上评估的分类器(AUC为0.82)相比，具有同样强大的预测准确率(图2D和S2)。LO-CRC分类器性能在使用不同年龄截点时没有显著变化(图S2；补充表S4)。为确定最强烈推动CRC分类的微生物属，我们使用Shapley加性解释(SHAP)值量化了特征贡献(见STAR方法)。该分析揭示了在LO-CRC和EO-CRC机器学习模型中驱动预测的类似微生物属，无论年龄组如何，包括梭杆菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)和小单胞菌属(Parvimonas)等属排名最具影响力的特征(图2E)，与单变量属水平关联密切相关(见图2A和2B)。
在证明机器学习分类器在测序方法和发病年龄之间具有良好的泛化能力后，我们接下来构建了一个统一的CRC微生物组特征。该统一随机森林分类器在来自27项研究和15个国家的16S和WGS数据的属水平相对丰度上进行了交叉验证(图3A；补充表S1)。交叉验证平衡了病例-对照比例，并在训练/测试折叠中按研究分块，实现了0.84的AUC(图3B)。
我们通过留一研究(out)评估进一步评估了模型性能(图3C和S3)。在27项研究中，留一研究AUC范围从0.7到0.94(补充表S5)，突显了模型的泛化能力。一些研究(如Hannigan等人的研究)观察到的低AUC值(交叉验证和留一研究评估中分别为0.59和0.70)可能是由于测序深度较低，这在先前的元分析中也有报道。在其他情况下，当观察到低研究间转移AUC时(例如Zhou等和Ternes等；图S3)，留一研究AUC相对较高，表明分类器训练中数据集的多样性可以在一定程度上克服技术研究异质性。
为了解最具影响力的特征，我们还计算了统一CRC分类器的SHAP值。该分析显示，梭杆菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小单胞菌属(Parvimonas)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)是对CRC预测最具影响力的属，与其在不同数据集中的持续CRC富集一致(图3D)。这些最具影响力的CRC富集菌属彼此高度相关，表明它们在全球CRC微生物组中频繁共存(图3D)。
为解决分类分辨率如何影响CRC特征的问题，我们还评估了种水平CRC富集模式(在鸟枪法数据集上使用mOTUs分析器获得种等效物)。包括小单胞菌属(micra)、消化链球菌属(stomatis)、具核梭杆菌动物亚种(subsp. animalis)和摩氏摩拉菌(morbillorum)在内的关键CRC富集属的成员是富集最显著的种(图S3；补充表S6)。然而，我们也观察到CRC富集种，如共生梭菌(symbiosum)和脆弱拟杆菌(fragilis)，其对应属未(或仅微弱)在CRC中富集。当我们在种水平特征上训练分类器时，我们观察到种分类器和属分类器的AUC分别为0.80和0.81(直接在WGS数据上比较；图S3)，表明在这种情况下，更高分类分辨率并未直接转化为微生物组CRC检测的更高准确率。
此外，为概念上比较微生物组谱相对于标准非侵入性CRC检测的诊断潜力，我们评估了在可用粪便隐血试验(FOBT)和粪便免疫化学试验(FIT)结果的研究中的分类器性能(图S3)。在FOBT或FIT数据可用的情况下，测试性能在不同研究中差异很大(特别是真阳性率[TPR]从0.38到0.86)，突显了所用不同类型和品牌的这些测试的显著异质性。虽然粪便微生物组分类器在这些数据集上表现出同样可变的留一研究性能(TPR在0.22和0.55之间)，Hannigan等人和Baxter等人研究中特别低的微生物组检测率部分可归因于其较低的测序深度(图3C)。虽然仅限于少数数据集，我们的比较表明FIT结果目前优于微生物组分类器。需要更大的具有最新FIT测试结果的研究人群，以更全面地评估临床非侵入性测试与微生物组测试之间的互补性，以及组合诊断的潜力。
早期癌前病变是CRC非侵入性检测的另一个挑战。为评估粪便微生物组与结直肠腺瘤(AD)(作为癌前病变)的潜在关联，我们利用了来自AD患者的大规模微生物组谱集(n = 1,551)，这些患者是我们大型数据收集的一部分(见补充表S1)。我们首先使用我们统一的属水平分类谱和前述元分析方法(见补充表S7和STAR方法)比较了CRC、腺瘤和无新生物对照样本之间的粪便微生物组特征。虽然CRC样本与AD和无新生物对照样本相比有明显且一致的差异，但与对照相比，腺瘤相关细菌富集明显较弱，与CRC相关富集仅有最小一致性(图S4A-S4D)。当我们将统一的CRC分类器应用于AD谱时，所得分类评分仍低于CRC谱，且与对照相比区分度较差(图S4E)。该CRC训练分类器以及我们专门重新训练以区分AD和对照谱的分类器(见STAR方法)均在队列中产生高度可变的AD检测准确率，AUC范围在0.35至0.70和0.48至0.79之间(图S4F和S4G；补充表S8)。单个属对腺瘤-对照分类的贡献很小(图S4H；补充表S8)，反映了与AD相关的相对细微的丰度变化。我们发现AD检测有限与大多数先前报告一致(图S4I)。
粪便微生物组读数经常被批评为是胃肠道特定区域病理生理状况的不完美替代物。为研究结直肠肿瘤的这一问题，我们直接比较了肿瘤组织驻留与粪便微生物组。我们进行了癌症组织样本与相邻非肿瘤组织的元分析(见STAR方法)，涵盖七个具有配对样本的研究(总计n = 906；457个肿瘤和449个相邻非肿瘤组织；图4A；补充表S9)。在研究人群中，与非肿瘤组织相比，肿瘤组织富集了先前描述的CRC相关属，包括梭杆菌属(Fusobacterium)、Campylobacter_A、Campylobacter_B、Leptotrichia、小单胞菌属(Parvimonas)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、Gemella和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)。相反，健康相关共生菌如Faecalibacterium和毛螺菌属(Lachnospira)在肿瘤组织中减少(图4A)。总体而言，CRC组织微生物组特征与粪便CRC特征非常相似，因为梭杆菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、小单胞菌属(Parvimonas)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)和其他几个属在CRC中持续存在并显著富集(图4B)。虽然我们发现许多属在CRC组织样本(相对于相邻非肿瘤组织)和CRC患者的粪便样本(相对于肿瘤对照)中都富集，但我们还注意到它们的累积相对丰度在组织中平均比在粪便中高得多，可能是由于肿瘤驻留微生物在粪便中稀释所致(图4C)。
接下来，我们研究了关键CRC富集细菌在肿瘤阶段和解剖位置上的分布情况，以及这在粪便和组织微生物组谱之间是否存在差异。虽然我们观察到关键CRC富集菌属在粪便谱中随肿瘤进展而增加(图4D)，但这些相同菌属在组织谱中表现出相对稳定的富集，且在早期阶段肿瘤中已可清晰检测(除梭杆菌属(Fusobacterium)外，其在研究间表现出更高变异性；图4E)。类似地，虽然粪便谱表明这些菌属在远端和直肠肿瘤中比近端肿瘤中富集更强(图4F)，但组织谱则显示出相反的弱趋势，即在近端而非远端和直肠肿瘤中富集，可能是由于解剖位置之间肿瘤生物学的生物差异(图4G)。综上所述，这些发现表明当前粪便微生物组分析方法对早期阶段和右侧肿瘤的非侵入性检测灵敏度略低，尽管这些肿瘤中富含关键CRC相关细菌。
虽然本研究无法确定肠道微生物是否对CRC病因学有因果贡献，但越来越多的基因组和临床前证据支持细菌驱动CRC发展的合理机制。假设肠道微生物组是CRC的一个风险因素，一个有趣的问题是它是否可以被调节以预防CRC。
为探讨这一想法，我们检查了CRC微生物组特征是否与已知的CRC饮食风险因素(如纤维摄入)相关，以及相关菌群如何对饮食干预做出反应。我们首先重新分析了记录参与者习惯性饮食的横断面研究，发现估计的纤维摄入(及其他植物衍生饮食成分；见图S5)与CRC特征评分显著逆相关(图5A和5B)。这在Yachida等人的病例-对照研究(斯皮尔曼rho = -0.18，p = 0.00026)和健康超重个体基线样本研究中均观察到(斯皮尔曼rho = -0.2，p = 0.013)。同样，坚持植物性饮食(素食或纯素)的个体与杂食个体相比，CRC特征评分显著降低(威尔科克森秩和检验，p = 0.043；图5C)。同样，Healey等人的研究基线样本也显示，与低纤维饮食者相比，高纤维饮食者CRC微生物组特征评分较低(威尔科克森秩和检验，p = 0.043；图S5)。
当重新分析旨在增加纤维摄入的饮食干预研究时，我们发现CRC微生物组特征评分在几种类型的干预中显著降低(图5D-5G和S5)。这在对比西方化饮食(低纤维高饱和脂肪)与高纤维干预的研究中观察到，在这些研究中，引入富含纤维的零食导致CRC微生物组特征评分显著降低。在类似研究中，我们还观察到安慰剂对照纤维干预后CRC特征评分降低。总体而言，这些结果支持以下概念：CRC相关肠道微生物的丰度与习惯性纤维摄入相关，并可通过膳食纤维补充进行调节。
为调查CRC中功能性微生物组变化，我们比较了CRC和对照宏基因组(n = 1,948个WGS谱，来自14项研究)中差异丰富的肠道代谢模块(GMMs)、KEGG通路和模块，使用LMM控制研究异质性(见STAR方法)。这证实了先前报道的CRC微生物组功能谱向氨基酸降解的转变：一致地，在GMM和KEGG中，最显著和最强烈CRC富集的模块涉及氨基酸降解。此外，我们注意到与氧化还原和呼吸系统相关的模块在CRC宏基因组中更为丰富。这种参与有氧呼吸基因丰度的增加可能与CRC微环境中较高活性氧水平下繁荣的兼性厌氧革兰氏阴性菌(如卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、大肠杆菌属(Escherichia)和摩根菌属(Morganella))的高丰度有关。此外，在非代谢KEGG模块中，我们检测到许多编码III、IV和VI型分泌系统成分的基因在CRC宏基因组中富集。这些分泌系统允许病原体将效应蛋白和毒素递送到宿主细胞。与脂多糖生物合成丰度增加(p = 7.2e−12)一起，这些结果表明CRC中病原共生菌和毒力机制的扩展。
为更全面地表征肠道微生物VF谱，我们将毒力因子数据库(VFDB)2.0条目与手动策划的VF注释相结合，以增加与CRC相关的VF覆盖率(见STAR方法)。差异丰富的VF包括强烈CRC富集的粘附素(fap2、pcwbr2、fadA、fplA、srtC-1/srtB、cmpA、srtC4和fomA)、氧化应激相关基因(msrA/B)(图6A；补充表S13)，以及dps (FN1079)，它编码一种在肿瘤进展中起作用的具核梭杆菌VF。另一个值得注意的CRC富集基因是pcwbr2，它编码一种小单胞菌厌氧种(Peptostreptococcus anaerobius)表面蛋白，介导通过整合素α2/β1的肿瘤细胞粘附和促肿瘤信号传导。
为进一步解析和情境化梭杆菌VF，我们使用总共698个基因组进行了梭杆菌属的菌株水平系统基因组分析，揭示了有趣的谱系特异性基因存在/缺失模式：CRC富集的fadA、fap2、flpA、fusolisin和msrA/B基因主要局限于单系的具核梭杆菌/periodonticum亚支的基因组和物种(图6B)。该VF调查显示梭杆菌亚支中CRC相关性最强的VF和物种汇聚在一起。
利用我们全面的数据集，我们接下来重新审视了梭杆菌菌株超越先前工作的癌富集和生物地理学。先前一项研究报告了两个不同的具核梭杆菌动物亚种(subsp. animalis)亚支——称为"Fna C1"和"Fna C2"——具有不同的毒力潜力和CRC组织富集。虽然我们的系统基因组分析支持这些支系的界定(图6B)，但它表明它们对应于预先存在的物种或亚种水平支系：虽然mOTUs的分子界定建议物种，NCBI注释在物种或亚种分配方面含糊不清。Fna C2直接对应于mOTU 01001，注释为具核梭杆菌亚种动物亚种(subsp. animalis)，或动物梭杆菌(F. animalis)，根据NCBI分类法(该和其他梭杆菌mOTUs也包含未进一步解析到亚种的具核梭杆菌NCBI注释)。另一方面，Fna C1对应于mOTU 01002，注释为具核梭杆菌亚种vincentii/watanabei，或watanabei梭杆菌(F. watanabei)，根据NCBI分类法(具有一致的NCBI指定)。Fna C1和Fna C2的独立分类学重新评估独立提出了与我们的重新分类一致的结论。
最后，我们在元分析中的地理多样化患者人群中研究了梭杆菌种的CRC富集情况。虽然我们发现具核梭杆菌动物亚种(subsp. animalis)(mOTU 01001，Fna C2)在全球所有大陆的患者中均一致CRC富集，但其他亚种在各大洲之间表现出更多异质性。在具核梭杆菌支系内，具核梭杆菌亚种vincentii/watanabei(mOTU 01002，Fna C1)、具核梭杆菌亚种nucleatum(mOTU 01003)和具核梭杆菌亚种polymorphum/hwasookii(mOTU 01004)在美国患者人群中均显示很少或没有富集，但在亚洲人群中显示出更强的CRC关联(图6C)。periodonticum梭杆菌、varium梭杆菌和mortiferum梭杆菌甚至表现出更明显的异质性，在亚洲人群中CRC富集达到峰值(图6C)，与先前报告一致(在中国人群中)。综上所述，这些结果支持以下概念：虽然CRC相关细菌属在全球一致，但致病性物种和菌株仍可在全球人类群体中显示有趣的生物地理模式。
讨论：本研究据我们所知代表了迄今为止基于一致重新分析的最大单一疾病微生物组元分析之一，包括来自34个研究人群的总计6,779个粪便和906个肠道组织样本。除了规模之外，这项工作的关键优势在于向微生物组谱标准化和协调的方法学进步。通过整合一致分析的16S和WGS测序数据进行关联测试和机器学习建模(见图1)，我们能够大幅扩展先前的元分析，评估CRC微生物组特征在广泛研究、地理区域、测序方法和CRC亚组中的表现，尽管非洲、亚洲和南美洲的主要人类群体仍未被充分采样。
我们研究的一个主要目标是重新审视临床上重要的问题，即EO-CRC相关肠道微生物组特征是否与LO-CRC有显著差异。Yang等和Kong等报告了EO-CRC和LO-CRC之间显著的分类和功能差异；然而，他们没有进行直接的跨研究验证，且其患者人群规模有限且地理上局限于中国。相比之下，Qin等最近分析了更大规模的多中心数据集(同样在中国)，并得出结论：微生物特征在各年龄组间基本共享。在我们的元分析中，包括来自全球22个年龄注释研究人群，提供了更全面的视角，我们几乎没有证据表明粪便CRC微生物组特征因发病年龄而异(见图2)。相反，我们的结果强烈支持统一CRC特征的概念：关键CRC富集属，最重要的是消化链球菌属(Peptostreptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、小单胞菌属(Parvimonas)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，在EO-CRC和LO-CRC中表现出同等增加，仅因发病年龄有最小变化，并且是统一机器学习模型中的关键预测因子，这些模型在年龄组之间泛化良好(见图3和4)。
通过分析由肿瘤阶段和位置划分的CRC亚组，我们发现关键细菌属在所有阶段和位置的粪便读数中均富集，尽管在早期阶段和右侧或近端CRC中较弱(见图4)。与较低的早期阶段CRC检测率一致，AD难以检测，无论使用通用CRC分类器还是腺瘤特异性分类器(见图S4)。与先前显示腺瘤检测率低的研究一起，我们的结果表明，该领域目前缺乏可重复且可泛化的粪便微生物组AD标记物。这些发现引发了微生物定植是否仅在肿瘤进展后期发生的疑问——暗示细菌"乘客"模型。为排除粪便替代读数中的间接效应，我们直接分析了肿瘤组织中关键CRC相关细菌的富集情况，按阶段和位置分层。有趣的是，与粪便模式相反，肿瘤组织富集(相对于相邻非肿瘤组织)在阶段和位置之间基本均匀(见图4)，与早期微生物肿瘤定植的"驱动"模型一致。我们认为，粪便和组织谱之间观察到的这种差异可能反映了肿瘤定植细菌在粪便中的"稀释"读数，阻碍了对更局部化(早期阶段)或离直肠更远(即右侧，近端CRC)肿瘤的特征性CRC相关细菌的检测。更敏感的粪便微生物组读数(如更高测序深度)可能提高早期阶段和右侧CRC的非侵入性微生物组检测。
随着CRC微生物组特征通过本研究和先前工作得到牢固确立，CRC相关细菌(可能首先在口腔微生物组中出现)如何定植结肠以及这一过程如何逆转的问题变得越来越重要——不仅因为它们对于开发癌症预防的潜在微生物组调节策略至关重要。基于我们统一的CRC微生物组评分模型，我们记录了膳食纤维摄入(流行病学证据强烈支持其具有癌症保护作用)与CRC微生物组评分之间的显著逆相关，无论是在癌症患者还是肿瘤对照个体中(见图5)。更重要的是，我们还表明几种旨在增加膳食纤维含量的干预措施有效降低了CRC微生物组评分。这些干预措施倾向于增加如Agathobaculum和毛螺菌属(Lachnospira)等属(见图S5)，这些属似乎是CRC富集细菌的可信拮抗剂，由其对CRC微生物组评分的逆向影响以及与CRC富集菌群的反相关丰度所表明(见图3D)。虽然我们的结果提供了概念证明，但我们无法完全解决复杂的饮食效应，这使得植物性饮食的其他成分可能促成了观察到的关系(见图S5)。需要更多工作，包括前瞻性研究，以界定具有降低CRC风险功效的饮食成分以及如何合理识别和促进那些最有效拮抗CRC富集病原共生菌的肠道微生物的生长。
我们对CRC相关细菌菌株、基因和通路的调查(见图6)揭示了如fadA、fap2、fplA、cmpA、fomA和fusolisin等梭杆菌毒力基因——所有已知促进细菌粘附、调节抗肿瘤免疫反应或辅助上皮侵入的基因——集中在具核梭杆菌支系中。虽然具核梭杆菌动物亚种(subsp. animalis)在该支系中表现出全球一致的CRC富集模式，但其他(亚)种，包括periodonticum梭杆菌、varium梭杆菌，以及在一定程度上还包括mortiferum梭杆菌，表现出在各大洲之间不同的CRC富集模式。亚洲人群中更广泛的CRC相关梭杆菌(亚)种多样性值得进一步研究，以探究菌株特异性毒力机制、储库和传播途径的生物地理差异。虽然这些结果在(亚)种水平上突显了地理分层，但我们的工作同时也强烈支持存在在全球范围内普遍CRC富集的细菌属，无论是在肿瘤组织还是粪便微生物组谱中。
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