转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病（ATTR-CM）的特点是转甲状腺素蛋白（TTR）的错误折叠、纤维生成以及在心肌中的渐进性淀粉样纤维沉积，导致心脏功能障碍且预后不良。在ATTR-CM中，不稳定的突变（变异型TTR，ATTRv）或与衰老相关的过程（野生型TTR，ATTRwt）会导致TTR淀粉样纤维的形成。由于缺乏具有代表性的疾病模型，ATTR-CM的疾病机制仍然未知，从而限制了对疾病的了解和治疗发现。
方法与结果
在此，我们报告了一种新型的体外ATTR-CM模型，该模型通过将三种主要的人类心脏细胞类型暴露于TTR纤维中，揭示了细胞类型特异性的疾病表型，从而为ATTR-CM疾病的细胞机制提供了新见解。人类重组TTR蛋白（WT、V122I、V30M）及其相应的纤维通过硫黄素T、Amytracker、刚果红和斑点印迹分析进行生成和表征。将人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）和内皮细胞（ECs）接种在TTR纤维上，导致细胞活力下降。共聚焦显微镜显示TTR纤维在hiPSC-CMs上的细胞外定位，导致肌节破坏、钙处理改变和机电耦合紊乱，而ECs则表现出迁移能力降低和异常的细胞形态。hiPSC-成纤维细胞（hiPSC-FBs）基本不受TTR纤维影响，表现出正常的活力，但显示出与TTR纤维增强的定位。
结论
我们的模型表明，WT和变异型TTR纤维会导致细胞类型特异性表型，为ATTR-CM的潜在细胞疾病机制提供了新见解，从而促进了新治疗靶点和生物标志物的识别。
引言
心脏淀粉样变是一种进行性、危及生命且浸润性的疾病，由不溶性淀粉样纤维在心肌中的沉积引起。其中一种主要的心脏淀粉样变是转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病（ATTR-CM）。转甲状腺素蛋白（TTR）是一种同源四聚体蛋白，主要在肝脏中合成，在血液和脑脊液中作为甲状腺素（T4）和视黄醇的转运蛋白。ATTR-CM可分为两种亚型：野生型TTR（ATTRwt-CM），在老年人群中越来越常见；变异型TTR（ATTRv-CM），基因突变影响TTR蛋白稳定性并加速纤维形成和沉积。ATTRwt-CM最常影响心脏，主要发生在老年男性中，被认为与年龄相关。尽管ATTRv-CM被认为是一种罕见的遗传性疾病，但已鉴定出超过一百种不同的TTR变异，其进展方式和涉及的器官各不相同。V30M变异，即TTR氨基酸序列第三十位的缬氨酸被甲硫氨酸取代，主要表现为多神经病变和心肌病如传导障碍和心力衰竭。另一个常见的变异V122I，主要存在于非裔美国人人群中，患病率为3–4%。临床上，TTR纤维的渐进性积累导致心室壁厚度增加、舒张功能障碍、传导障碍，最终如果不治疗会出现预后不良的限制性心肌病。由于早期症状的非特异性和缺乏特定的生物标志物，诊断延迟或误诊并不罕见，这凸显了寻找特定早期生物标志物和增加对早期疾病进展的机械理解的重要性。随着对ATTR-CM的认识提高，越来越多的患者被识别出来。尽管引入了包括TTR稳定化、TTR基因沉默和TTR耗竭在内的新疗法，这些干预措施并不能治愈疾病，而是旨在减缓或阻止正在进行的淀粉样物质形成。因此，对病理生理学和疾病进展的更好理解变得越来越重要。
迄今为止，尚无研究全面展示心脏中存在的三种主要细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞）在暴露于WT和最常见的两种TTR变异（V122I和V30M）纤维时的反应。在这项研究中，我们开发了一种新方法，通过将iPSC-CMs、hiPSC-FBs和ECs暴露于种子化的TTR纤维，来模拟人类ATTR-CM疾病，随后评估细胞活力和不同的表型及功能性细胞反应。我们的结果揭示了ATTR-CM详细的细胞表型，为细胞疾病机制提供了新见解，可能促进ATTR-CM的诊断和治疗策略的发展。
材料与方法
重组WT和变异型TTR的生产与纯化
鉴于TTR在生理条件下不发生糖基化，我们选择利用细菌表达系统生成重组人类TTR。从Addgene获得不含信号肽序列的人TTR前体cDNA（补充表1），并将其亚克隆到pCI8b表达载体中。在hTTR cDNA末端插入TAA终止密码子以停止C末端His标签翻译，确保只有N末端表达6xHis标签。先前的研究表明，His标签的存在不会影响TTR的功能。使用New England BioLabs Inc.的Q5®定点诱变试剂盒和Agilent Technologies的QuickChange II试剂盒分别生成变异型V122I和V30M TTR（补充表1），按照制造商的说明操作。随后，WT、V122I和V30M hTTR蛋白在含有相应质粒的ClearColi BL21感受态细胞中表达。当吸收值（A600）达到0.6时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达。BL21细胞在30°C下过夜生长并通过离心（5000 g，10分钟，4°C）收获。接下来，收集的细胞重悬于裂解缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl，0.2 mg/ml溶菌酶，10 U/mL DNase，1 mM 2-巯基乙醇，EDTA-free蛋白酶抑制剂混合片，pH 7.4）并在37°C孵育30分钟。细胞裂解物在-80°C储存至少1小时或直至使用。裂解物在37°C解冻30分钟并进行10次短周期超声处理。然后通过离心（4°C，13,000 rpm，20分钟）收集上清液，使用0.45 μm SFCA过滤器过滤并储存在4°C。对于蛋白纯化，将过滤后的上清液加载到HiTrap TALON粗柱上。在用平衡缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl，pH 7.4）平衡柱后洗脱蛋白（洗脱缓冲液：50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl，250 mM咪唑，pH 7.4）。然后将对应的TTR组分合并并通过尺寸排阻色谱进一步纯化，使用HiLoad Superdex 75pg制备型尺寸排阻色谱柱并用无Ca2+和Mg2+的PBS洗脱。纯化后，将洗脱样品合并并通过Amicon® Ultra-15离心过滤装置在4°C以最大速度离心浓缩。使用Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒测量该样品的浓度（补充图1A）。使用Pierce™显色内毒素定量试剂盒分析内毒素水平，其低于相对于BL21（DE3）感受态细胞（ThermoFisher Scientific，# EC0114）的检测限1 EU/µg（数据未显示），并且与市售低内毒素重组蛋白一致。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
使用Bio-Rad的4–15%预制聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE和天然PAGE。对于SDS-PAGE（补充图1B），包含样品、4X NuPAGE™ LDS样品缓冲液和10X NuPAGE™样品还原剂的加载混合物在95°C加热10分钟，并在Tris/Glycine/SDS缓冲液中运行。对于天然PAGE（补充图1C），样品与加载缓冲液按1:1比例混合并在Tris/Glycine缓冲液中运行。蛋白质纯度通过SDS-PAGE判断，纯度大于95%，并使用InstantBlue®考马斯亮蓝蛋白染色进行染色。通过与BSA（66 kDa）比较，使用天然PAGE确认重组hTTR大小。
TTR纤维形成和特性分析
根据之前描述的协议，人类重组WT和变异型（V122I和V30M）hTTR纤维的诱导和形成过程进行了适应性调整。简而言之，酸性缓冲液（200 mM醋酸钠，100 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 4.3）与纯化的TTR四聚体（2 mg/mL）按1:1比例混合，以诱导TTR解离、错误折叠和聚集。纤维形成在37°C使用加热块进行5天。纤维立即用PBS透析，并使用10k MWCO Slide-A-Lyzer™透析盒在4°C进行。透析后，新鲜制备的纤维在48小时内用于后续细胞实验。
使用荧光淀粉样标记物Amytracker 540的荧光读数系统地评估了所有类型的TTR纤维形成的程度。荧光强度显著增加的Amytracker 540染色表明，在温和酸化条件下，所有类型的TTR均显著增加了荧光强度，特别是V122I和V30M变异型比WT TTR表现出更高的强度。此外，通过特征性的发射光谱偏移和增强的ThT荧光进一步证明了纤维的形成。这些发现强调了特定氨基酸替换对TTR蛋白稳定性的影响，导致解离和聚集效率的提高。TTR纤维形成的进一步验证通过刚果红染色并随后在偏振光下检查，检测到典型的苹果绿双折射信号，证实了淀粉样纤维的形成。此外，通过斑点印迹分析验证了纤维形成，使用针对人类TTR和淀粉样纤维的抗体，并包括胰岛素衍生纤维作为阳性对照。值得注意的是，V122I和V30M TTR纤维表现出对抗淀粉样纤维抗体的强烈免疫反应，而WT纤维表现出较弱的信号，表明其淀粉样纤维形成效率较低。
图1
体外生成的TTR纤维的特性。（A）TTR纤维在温和酸性缓冲液中形成。（B）有（蓝色）或无（红色）温和酸性缓冲液的TTR溶液的Amytracker 540荧光。数据表示为N = 3次独立实验的平均值±SEM。（C）TTR和TTR纤维的ThT光谱荧光读数，显示未结合ThT（实线）和结合到纤维上的ThT（虚线）的荧光发射。λ激发= 450 nm，λ发射= 482 nm。（D）刚果红染色的TTR纤维在明场和交叉偏振光下检查（比例尺，50 μm）。（E）使用抗TTR和抗构象淀粉样纤维抗体对TTR、TTR纤维和胰岛素纤维进行斑点印迹分析。完整的印迹见补充图6。P值通过双向ANOVA检验随Tukey多重比较测试确定。**P < 0.01，****P < 0.0001
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TTR纤维对hiPSC-CMs具细胞毒性
成功生产TTR并生成体外TTR纤维后，我们旨在通过将hiPSC-CMs培养在WT和变异型（V30M，V122I）TTR四聚体及其相应的纤维上，与标准包被表面相比，调查它们对细胞活力和形态的潜在影响。AlamarBlue细胞活力试剂和活/死染色显示WT和变异型TTR四聚体对细胞活力没有不良影响。相比之下，暴露于TTR纤维导致细胞毒性反应，显示hiPSC-CM细胞活力显著减少（WT纤维：90.9% ± 2.4% SEM；V122I纤维：78.9% ± 2.5% SEM；V30M纤维：84.6% ± 3.1% SEM）。特别是，我们观察到V122I纤维比WT纤维具有显著更高的细胞毒性效应（图2A）。不同类型TTR纤维的细胞毒性进一步通过活细胞群体的减少（WT纤维：94.7% ± 1.0% SEM；V122I纤维：92.1% ± 1.8% SEM；V30M纤维：90.3% ± 2.0% SEM）和增加的细胞死亡染色得到证实（图2B和D）。
随后，我们探索了TTR纤维的定位和hiPSC-CMs的肌节形态。发现TTR纤维大量定位于hiPSC-CMs外部（图2E），如代表性正交视图所示（补充图2A）。心肌肌钙蛋白的免疫染色显示，暴露于TTR纤维的hiPSC-CMs中存在更多的不规则肌节（图2E中的箭头指示），与暴露于TTR四聚体或对照组的细胞相比（WT纤维：4.0 ± 0.3 SEM；V122I纤维：4.0 ± 0.3 SEM；V30M纤维：4.2 ± 0.2 SEM）（图2C）。这种肌节组织的破坏在存在纤维的情况下大约高出四倍，表明结构异常的程度明显更大。补充图8至10列出了放大图以展示肌节破坏。
图2
hiPSC-CM细胞活力和TTR纤维及肌节的免疫染色。（A, B）通过AlamarBlue活力和活/死试验显示TTR和TTR纤维的细胞毒性。数据表示为N = 4次独立实验的平均值±SEM。（C）TTR、TTR纤维和对照组的肌节破坏倍数变化。（D）hiPSC-CMs的活/死染色图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、Calcein-AM（绿色）和EthD-1（红色）（比例尺，500 μm）。数据表示为N = 4次独立实验的平均值±SEM。（E）hiPSC-CMs的共聚焦图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、TTR（绿色）和cTnT（红色）（比例尺，100 μm）。对于A和C，P值通过单向ANOVA检验随Tukey多重比较测试确定。对于B，P值通过单向ANOVA非参数Kruskal-Wallis检验随Dunn多重比较测试确定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001
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TTR纤维扰乱hiPSC-CMs的机电耦合和钙处理
由于心律失常常是ATTR-CM中最常见的表现，我们在hiPSC-CMs培养在TTR四聚体和纤维上时评估了其收缩和松弛模式以及钙处理（图3A和B）。评估了包括上升时间、衰减时间、幅度和钙瞬态持续时间（CTD90）在内的钙处理参数。暴露于V122I和V30M纤维的hiPSC-CMs的钙瞬态幅度显著降低（WT纤维：91.7% ± 2.7% SEM；V122I纤维：91.1% ± 2.1% SEM；V30M纤维：90.1% ± 1.7 SEM）（图3C）。虽然我们没有观察到衰减时间和CTD90的统计学显著差异（图3E和F），但在所有纤维类型中观察到相对于TTR四聚体和对照组的显著延长的上升时间（WT纤维：117.3% ± 3.6% SEM；V122I纤维：117.7% ± 3.7% SEM；V30M纤维：116.2% ± 4.6 SEM）（图3D）。此外，重新接种到WT和变异型TTR四聚体或未经处理表面的hiPSC-CMs显示正常的电生理特性，如同步收缩和松弛的单层细胞伴随周期性钙瞬态（图3G）（视频1和2）。相反，培养在TTR纤维上的hiPSC-CMs显示机电耦合紊乱，伴随着在分离细胞簇中混沌和自发的钙释放事件（图3G，补充图3，虚线圆圈指示）（视频3）。接下来，这些数据共同表明，当TTR纤维定位于hiPSC-CMs时，可能起到传播屏障的作用，从而扰乱正常的机电耦合，反映出ATTR-CM患者观察到的心律失常。改变的钙处理参数突显了TTR纤维对hiPSC-CM收缩功能的影响，导致容易出现舒张功能障碍的情况。
图3
TTR纤维对hiPSC-CMs钙处理的影响。（A）钙瞬态分析示意图。（B）500ms内归一化的代表性钙瞬态。（C - F）钙瞬态幅度、上升时间、衰减时间和CTD90的量化。数据表示为N = 4次独立实验的平均值±SEM。（G）使用Cal520染色的hiPSC-CMs的代表性钙瞬态和延时图像。比例尺500 μm。对于C，P值通过单向ANOVA非参数Kruskal-Wallis检验随Dunn多重比较测试确定。对于D，P值通过单向ANOVA检验随Tukey多重比较测试确定。*P < 0.05，***P < 0.001
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TTR纤维对内皮细胞具细胞毒性并降低其迁移能力
内皮细胞是心脏中最丰富的细胞类型之一，淀粉样沉积物与患者的内皮功能障碍有关。为了评估沉积的TTR四聚体和纤维是否对ECs具有细胞毒性，我们使用AlamarBlue和活/死染色评估了细胞活力。结果显示，TTR四聚体（WT和变异型）不影响EC活力，这一点在hiPSC-CMs中也观察到。然而，当在TTR纤维上培养ECs时，两天后观察到显著的细胞活力下降（WT纤维：69.0% ± 4.6% SEM；V122I纤维：57.75% ± 4.3% SEM；V30M纤维：55.75% ± 2.8 SEM）（图4A）。V30M纤维显著增加了细胞毒性效应，相较于WT纤维，表明变异型TTR纤维更具细胞毒性。此外，在所有TTR纤维组中观察到显著的细胞密度下降，这在活/死染色图像的Calcein-AM/活通道中显示（图4D），表明细胞死亡主要发生在早期时间点。然而，在终点（第2天），我们观察到在纤维条件下显著更低的活细胞百分比（WT纤维：96.5% ± 1.1% SEM；V122I纤维：93.8% ± 0.9% SEM；V30M纤维：95.5% ± 0.5 SEM）（图4B）。使用CD31和TTR免疫染色评估TTR纤维定位和EC形态，显示TTR纤维在ECs上细胞外定位（图4E，补充图2B）。TTR纤维影响了EC之间的细胞连接，与四聚体和对照组相比，这些细胞发展出异常的细胞形态。通过伤口愈合试验评估TTR纤维对EC功能的影响，具体方法是评估EC迁移能力。相对伤口闭合在12小时（T12）后评估和分析。变异型TTR四聚体显示出影响EC迁移的趋势，而所有纤维类型显著降低了迁移能力，特别是V30M纤维（WT纤维：38.6% ± 0.9% SEM；V122I纤维：34.1% ± 1.5% SEM；V30M纤维：26.0% ± 1.2 SEM）（图4C和F）。此外，我们观察到V30M纤维对迁移能力的影响与V122I和WT纤维相比有显著差异，表明V30M纤维对ECs功能的影响最为显著。
图4
TTR纤维降低内皮细胞活力和迁移能力。（A, B）通过AlamarBlue和活/死染色确定TTR和TTR纤维的细胞毒性。数据表示为N = 5次独立实验的平均值±SEM。（C）直方图显示伤口闭合的百分比。数据表示为N = 4次独立实验的平均值±SEM。面积通过Image J确定。（D）ECs的活/死染色图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、Calcein-AM（绿色）和EthD-1（红色）（比例尺，500 μm）。（E）ECs的共聚焦图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、CD31（红色）和TTR（绿色）（比例尺，100 μm）。（F）ECs迁移的明场显微镜图像在0和12小时（比例尺，100 μm）。对于A和C，P值通过单向ANOVA检验随Tukey多重比较测试确定。对于B，P值通过单向ANOVA非参数Kruskal-Wallis检验随Dunn多重比较测试确定。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001
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TTR纤维对hiPSC-FBs不具细胞毒性
心脏成纤维细胞负责产生和重塑细胞外基质，并有报道称TTR纤维会影响成纤维细胞的结构和功能。此外，与ECM累积的淀粉样纤维可能导致心脏组织的硬化。因此，我们也评估了hiPSC-FBs的细胞活力。类似于CMs和ECs，我们观察到WT和变异型TTR四聚体没有任何细胞毒性影响。然而，与在hiPSC-CMs和ECs中观察到的细胞毒性效应相反，hiPSC-FBs的活力在任何TTR纤维条件下都没有显著受影响，除了V122I纤维引起的轻微下降（WT纤维：99.8% ± 0.2% SEM；V122I纤维：98.8% ± 0.4% SEM；V30M纤维：98.5% ± 0.8 SEM），表明对TTR纤维暴露的细胞类型特异性恢复力（图5A和B，补充图2）。我们确实观察到在暴露于纤维时细胞大小的小幅减少，表明纤维在FBs中引发了一些细胞应激。相比之下，Dittloff等人展示了在WT TTR纤维作用下的大鼠原代心脏FBs表现出细胞骨架紊乱、粘着斑减少和核结构扁平化，这也表明细胞应激。有趣的是，与hiPSC-CMs和ECs不同，hiPSC-FBs似乎介导了涂层TTR四聚体和TTR纤维的分布，表现出更明显的细胞表面积累（补充图5）。综上所述，hiPSC-FBs显示出对TTR纤维细胞毒性的高度抵抗力，并在暴露于TTR纤维时不会转变为更具活性的肌成纤维细胞表型。
图5
hiPSC-FBs对TTR纤维具有恢复力。（A, B）通过AlamarBlue和活/死试验显示TTR和TTR纤维的细胞毒性。数据表示为N = 4次独立实验的平均值±SEM。（C）条形图显示hiPSC-FBs中平均a-SMA荧光强度。荧光强度值通过Image J确定。数据表示为N = 3次独立实验的平均值±SEM。（D）hiPSC-FBs的活/死图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、Calcein-AM（绿色）和EthD-1（红色）（比例尺，500 μm）。（E）hiPSC-FBs的共聚焦图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、波形蛋白（红色）和TTR（绿色）（比例尺，100 μm）。（F）接种后hiPSC-FBs的代表性共聚焦图像，染色为Hoechst 33,342（蓝色）、a-SMA（红色）和TTR（绿色）（比例尺，100 μm）。对于B，P值通过单向ANOVA非参数Kruskal-Wallis检验随Dunn多重比较测试确定。*P < 0.05
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TTR纤维引发hiPSC-CMs的凋亡和细胞骨架变化、ECs的血管重塑和hiPSC-FBs的基质重塑
为了理解细胞对TTR纤维反应的分子机制，我们通过批量RNA-seq研究了hiPSC-CMs、ECs和hiPSC-FBs的转录组谱。转录组分析在hiPSC-CMs接种在纤维包被培养板上4天后进行，而在ECs和hiPSC-FBs接种2天后进行。在hiPSC-CMs中，基因集富集分析显示所有纤维条件下的DNA修复、凋亡、细胞衰老和氧化应激相关过程上调，同时那些与细胞呼吸相关的过程如氧化磷酸化和ATP合成也上调，这对于维持机械活性细胞的功能至关重要。另一方面，细胞黏附、细胞连接组装和结构组织相关过程在暴露于纤维的hiPSC-CMs中显著下调（图6A）。这些结果即使只考虑在所有纤维条件下差异表达的基因时也保持不变（图6A和补充图11A）。值得注意的是，暴露于纤维还导致与钙离子结合和钙离子运输相关过程的下调，这与我们的功能实验一致（图3D）。在ECs中，TTR纤维的引入导致与DNA复制、线粒体基因表达、间隙连接组装、细胞黏附和伤口愈合过程相关的基因集下调，而与ECM降解、ECM组织和血管内皮细胞分化相关的基因集上调（图6B和补充图11B）。最后，在FBs中，最重要的生物学差异与细胞生长、细胞黏附、胶原形成和未折叠蛋白结合相关过程的上调有关（图6C和补充图11C）。总之，这些RNA-seq结果在很大程度上与我们的观察一致，并突显了细胞对TTR纤维反应的细胞表型。
图6
hiPSC-CMs、ECs和hiPSC-FBs对TTR纤维的不同细胞反应。（A, B, C）左侧面板显示来自基因集富集分析（GSEA）的富集点图，比较每种纤维条件与阴性对照在（A）hiPSC-CMs、（B）ECs和（C）hiPSC-FBs中的选定富集基因集，使用基因本体（GO）生物过程（GOBP）、GO分子功能（GOMF）、Reactome、WikiPathways（WP）和标志性数据库。透明度代表-log10（校正后的p值），点大小代表标准化富集分数（NES），颜色代表富集方向（蓝色=下调，红色=上调在纤维中）。右侧面板显示来自基因过度表达分析（ORA）的条形图，针对相同的数据库，考虑在三种纤维条件下相对于对照条件检索到的差异表达基因（校正后的p值<0.05）（参见补充图11和补充材料ORA Excel文件）
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讨论
ATTR-CM是因未被充分认识而导致心力衰竭的原因，由于人口老龄化，这一原因变得越来越普遍。通过提高疾病意识和改进非侵入性诊断方法，怀疑和诊断正在改善。ATTR-CM的疾病机制，特别是在细胞水平上，仍然大部分未知，从而限制了对疾病的了解和治疗发现。临床前研究模型是理解心脏淀粉样变病理和发现新的治疗策略的宝贵平台。尽管在过去几十年中使用多种疾病模型在理解ATTR-CM发展的复杂性方面取得了重要进展，但使用更具有预测性的ATTR-CM疾病模型极其有限。动物模型，如短期大鼠模型，其中聚集的TTR被注射到心脏尖端，转基因V30M小鼠模型，以及S52P TTR过表达和淀粉样种子模型，已被证明可以重现体内ATTR的一些方面。体外模型，使用暴露于WT和变异型TTR四聚体或纤维的培养的动物原代心肌细胞或改良的AC16人类心肌细胞，显示出降低的细胞活力、增加的活性氧（ROS）生产和异常的钙瞬变。此外，RNAseq和ATACseq技术已被用于研究心肌细胞暴露于WT和变异型TTR四聚体时的最早反应。进一步研究直接分化ATTR患者特异性iPSCs成为肝细胞，这些肝细胞产生L55P变异型TTR，显示出对心肌细胞和神经元氧化应激和细胞死亡的影响。几种iPSC系的建立进一步促进了潜在疾病机制和治疗策略的体外研究。然而，迄今为止，尚无研究展示人类心脏中三种主要细胞类型如何响应TTR纤维。我们的模型通过使用酸诱导的TTR纤维建立了包含hiPSC-CMs、hiPSC-FBs和ECs的临床相关平台，解决了这一空白。我们采用源自WT和变异型TTR的种子纤维来研究反映临床表现的细胞特异性反应。这种方法为ATTR-CM发病的细胞表型提供了更全面的理解，并为推进诊断和治疗策略提供了一个强有力的系统。
在这项研究中，体外生成的WT和变异型TTR纤维被发现可以降低hiPSC-CMs和ECs的细胞活力，但对hiPSC-FBs没有影响。此外，细胞外定位的TTR纤维扰乱了电机械耦合和肌节组织，影响了hiPSC-CMs的钙处理，表现为上升时间延长和幅度降低，并损害了ECs的功能，表现为迁移能力降低。通过将这些主要心脏细胞类型暴露于WT TTR和其他普遍存在的TTR变异（V122I和V30M）的纤维中，我们可以模拟与ATTR-CM相关的纤维-细胞相互作用，并展示细胞特异性的ATTR-CM表型。
TTR纤维的形成是建立可靠的ATTR-CM研究模型的关键步骤。然而，在体外重构完全反映患者来源结构的TTR纤维仍然具有挑战性。最常报道且有效的实现这一目标的方法是酸性变性。通过调整这种方法，我们成功诱导了具有体内淀粉样纤维关键特征的TTR纤维形成，如刚果红、硫黄素T、Amytracker和淀粉样纤维抗体染色所示（图1）。此外，V122I和V30M变异在温和酸性条件下表现出显著更高的荧光强度，表明相较于其WT对应物更快且更多的纤维生成。这种在变异型TTR中观察到的纤维生成效率的增加与先前的研究结果一致，进一步支持它们相较于WT TTR更容易形成纤维的倾向。除了酸性方法外，最近的研究使用修饰的单体TTR和用从患病心脏组织中纯化的TTR纤维进行淀粉样种子化，显示在酸性和中性条件下均有明确的纤维结构，表明使用体外淀粉样纤维种子化可能是更符合生理的方法。然而，初级患者来源ATTR-CM淀粉样纤维的有限可用性对该方法在体外疾病模型中的实施构成了障碍。酸诱导纤维方法凭借其经过验证的有效性和易用性，成为可靠且现成的工具。
在这项研究中，通过在培养表面上涂覆TTR纤维来模拟病理生理环境。我们观察到在所有类型的TTR纤维上生长的hiPSC-CMs细胞活力显著下降，伴随细胞死亡增加（图2A、B和D）。类似的结果，如代谢活性降低和ROS生产上调，已在新生大鼠心肌细胞、HL-1和H9C2心脏小鼠细胞系中显示，暴露于TTR纤维后。虽然所有类型的TTR纤维都减少了细胞活力并导致hiPSC-CMs的肌节破坏，但V122I TTR纤维对细胞活力的影响显著强于WT纤维（图2A）。这些结果表明TTR纤维的变体依赖性细胞毒性特性，因为V122I TTR表现出更高的纤维形成倾向，这是由于不稳定的基因突变所致。这一发现与临床观察相符，即特定TTR变体倾向于比WT TTR更快速地形成纤维，随着时间逐渐累积，导致症状逐渐发作并主要影响老年人群。
据我们所知，尚无研究报道TTR纤维对心脏中存在的所有三种主要细胞类型的细胞毒性影响。我们的研究结果表明，当暴露于TTR纤维时，ECs的细胞活力显著降低，尤其是V30M变体（图4A和B）。这表明纤维具有直接的毒性作用。一旦ECs附着在纤维涂层表面，它们显示出异常的细胞形态和减少的细胞间连接。这一现象表明，TTR纤维可能会阻碍ECs的正常附着，影响正常的细胞形态和功能。这引发了ATTR-CM患者心脏中淀粉样沉积区域的ECs可能发生类似改变的可能性，这可能促成疾病进展。与在hiPSC-CMs和ECs中观察到的结果相反，hiPSC-FBs在暴露于TTR纤维时表现出显著的抵抗力，维持其活力（图5A和B，补充图2）。我们确实观察到在暴露于纤维时细胞大小的小幅减少，表明纤维在FBs中引发了一些细胞应激。相比之下，Dittloff等人展示了在WT TTR纤维作用下的大鼠原代心脏FBs表现出细胞骨架紊乱、粘着斑减少和核结构扁平化，这也表明细胞应激。综上所述，这些发现表明，与CMs和ECs相比，成纤维细胞能够通过较小的结构变化适应TTR纤维环境。总体而言，TTR纤维细胞毒性的变异依赖性效应和不同细胞类型特异性反应突显了TTR纤维引起的病理生理效应的复杂性。
在体内，浸润的TTR淀粉样纤维会导致组织结构破坏和心脏损伤。在这项研究中，共聚焦显微镜分析显示TTR纤维优先定位于所有心脏
(全文结束)
