细胞代谢对成体神经干细胞/祖细胞（NSPC）的行为至关重要。然而，它在从静息向增殖转换中的作用尚未完全阐明。我们在此证明，线粒体丙酮酸载体（MPC）在这一过程中扮演着关键且出乎意料的角色。MPC将丙酮酸转运至线粒体，连接胞质糖酵解与线粒体三羧酸循环及氧化磷酸化。尽管其代谢功能关键，但MPC在NSPC中的作用尚未被研究。我们发现，静息态NSPC具有活跃的线粒体代谢，并表达高水平的MPC。药理性抑制MPC会增加天冬氨酸并触发NSPC激活。此外，在体外和体内遗传性敲除Mpc1同样能激活NSPC，这些细胞能分化为成熟神经元，从而在成体和老年小鼠中整体增加海马神经发生。这些发现强调了代谢对NSPC调控的重要性，并鉴定出一个通过线粒体丙酮酸输入控制NSPC静息与激活的重要通路。
引言
干细胞必须在静息、增殖和分化之间维持严格平衡，以维持终生的组织再生和维持。成体神经干细胞/祖细胞（NSPC）也是如此，它们在整个生命过程中产生新生神经元。NSPC在成年期主要处于静息状态，但可在内在和外在刺激下增殖。尽管NSPC激活对正常神经发生至关重要，但其潜在机制仍未完全阐明。
细胞代谢已被证明可决定干细胞的活性状态，且不同组织特异性成体干细胞之间的代谢特征似乎相似。一般来说，干细胞倾向于糖酵解以支持细胞构建模块的合成，从而维持细胞生长，而在分化过程中，其代谢谱转向氧化代谢以产生三磷酸腺苷。这种代谢转变似乎对NSPC也很重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究发现，在成体NSPC命运转变的早期阶段，糖酵解基因表达下降，而参与氧化磷酸化（OXPHOS）的基因表达上调。这些发现得到了体外分化NSPC代谢分析的支持。然而，最近的研究表明，当NSPC处于静息状态时，其代谢可能与糖酵解的增殖性NSPC有显著不同：静息NSPC具有高水平的线粒体脂肪酸β氧化（FAO），并表达许多参与线粒体代谢不同方面的蛋白质。此外，NSPC中线粒体丰富，其动力学影响自我更新和命运选择。因此，线粒体代谢可能比之前预期的在NSPC静息中发挥更重要的作用。
从糖酵解向氧化代谢的转变通常需要将糖酵解终产物丙酮酸从乳酸产生重新导向至线粒体中的三羧酸（TCA）循环氧化。线粒体丙酮酸载体（MPC）是MPC1和MPC2的异二聚体，负责这种转运。其中一个蛋白的缺失会导致丙酮酸转运丧失，并对细胞的代谢状态产生深远影响。尽管MPC在连接糖酵解和线粒体代谢中起关键作用，但尚不清楚MPC是否在NSPC行为中发挥调控作用。
我们在此利用药理性MPC抑制和Mpc1基因缺失，评估破坏丙酮酸进入线粒体是否会影NSPC的维持、激活和分化。出乎意料的是，我们发现静息NSPC表达高水平的MPC，并且需要丙酮酸进入线粒体以维持静息。抑制MPC会通过增加细胞内天冬氨酸池（尽管TCA循环中间体显著减少）来触发其激活。此外，条件性MPC1敲除（cKO）NSPC能够分化为成熟神经元，表明其具有高度的代谢灵活性，能够根据底物可用性调整代谢。我们进一步证明，这种增加的激活和不受干扰的MPC1-cKO NSPC分化导致成体和中年小鼠神经发生的整体增加。
结果
MPC随活性状态动态调控，其转运功能对NSPC静息至关重要
为确定MPC在NSPC中的作用，我们首先分析了现有RNA-seq数据库中Mpc1的表达。我们发现，Mpc1在NSPC以及成年小鼠齿状回（DG）的其他细胞类型中均有表达。来自MPC1-GFP报告小鼠DG切片的可用图像进一步显示GFP在DG的颗粒下层表达。
出乎意料的是，当我们分析包含NSPC不同活性状态体内scRNA-seq数据时，发现Mpc1在最静息的NSPC群体中表达最高，并随谱系进展而降低，这表明丙酮酸进入线粒体可能在NSPC静息调控中发挥基本作用。Nestin-GFP报告小鼠中MPC1蛋白染色证实，MPC1在放射状胶质样静息NSPC中确实高表达，并在增殖时减少。
为评估Mpc1表达是否依赖于NSPC的活性状态，我们使用培养的成年海马NSPC，并应用一种已建立的体外系统，该以可逆方式模拟静息。支持scRNA-seq分析，我们发现静息NSPC中Mpc1 mRNA和MPC1蛋白水平显著高于活跃/增殖NSPC。Mpc2/MPC2遵循相同模式。当人工静息状态恢复为增殖状态时，Mpc1/MPC1和MPC2水平显著降低至增殖NSPC水平，表明MPC水平随活性状态动态调控。OXPHOS复合物遵循相同模式，在静息NSPC中蛋白水平升高。此外，线粒体形态计量学分析显示，静息NSPC主要包含融合和延长的线粒体，这指示高度活跃的OXPHOS，而增殖NSPC具有更多碎片化的线粒体。总之，这些发现表明静息NSPC具有高水平的MPC和延长的线粒体网络。
鉴于高MPC水平，我们接下来测试了抑制MPC是否会影响这些细胞的静息。我们使用特异性MPC抑制剂UK5099，在静息诱导期间或静息建立后进行处理。值得注意的是，UK5099显著增加了循环和分裂的Ki67和磷酸化组蛋白3（pH3）阳性NSPC的数量，表明MPC活性确实是维持静息所必需的，其阻断导致体外NSPC激活。为确认这些发现，我们从成年Mpc1 floxed小鼠和野生型（WT）对照小鼠中分离并扩增了NSPC。在增殖期间用Cre-GFP逆转录病毒（RV）感染导致Mpc1 fl/fl NSPC（以下简称MPC1 cKO）中MPC1蛋白明显减少，如免疫组化所示。在静息条件下，Mpc1缺失显著增加了增殖NSPC的数量，证实了UK5099的发现。
体内NSPC中Mpc1缺失导致后代数量增加并触发NSPC增殖
接下来我们探讨MPC在体内维持静息NSPC中的重要性。为在成体NSPC中敲除Mpc1，我们将Mpc1 fl/fl小鼠与他莫昔芬诱导的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-Cre重组酶品系杂交。为了可视化重组细胞及其后代，我们还将这些诱导型Mpc1 cKO小鼠与诱导型tdTomato谱系示踪品系杂交，得到三转基因小鼠，以下简称MPC1 cKO-tdTom小鼠。对照小鼠以相同方式生成，但携带Mpc1基因的WT等位基因（MPC1 WT-tdTom小鼠）。在出生后第30天（P30）给予他莫昔芬诱导Cre表达，导致cKO-tdTom小鼠中GFAP表达细胞（包括NSPC）中Mpc1缺失。
为确定Mpc1缺失对体内NSPC激活的影响，我们在P38时分析了tdTomato阳性细胞的数量，此时MPC1 cKO-tdTom NSPC中MPC1蛋白明显减少。虽然P38时tdTom阳性（tdTom+）细胞总数没有增加，但激活/增殖的tdTom+细胞比例显著增加，如细胞周期标记蛋白Ki67所示。由于DG中有几种NSPC亚型可以增殖，我们根据先前描述的命名法将Ki67+/tdTom+细胞分为1型细胞和2a型细胞。2a型细胞进一步通过缺乏未成熟神经元标记物双皮质素（DCX）与定向神经母细胞区分。而Ki67+ tdTom+ 2a型细胞数量在对照和MPC1 cKO-tdTom小鼠之间相当，但在KO小鼠中Ki67+ tdTom+ 1型细胞数量显著增加，表明Mpc1缺失后静息NSPC大量激活。
总之，这些数据表明NSPC中Mpc1缺失导致NSPC激活和增殖增加，从而产生更多后代。这些发现与体外MPC阻断和Mpc1 cKO后静息NSPC激活增加一致。
乳酸水平升高对静息NSPC激活并非必需
接下来我们通过Seahorse技术评估了静息NSPC的代谢谱。燃料灵活性测试显示，静息NSPC的耗氧率（OCR）主要依赖于葡萄糖。然而，谷氨酰胺和脂肪酸也作为氧化燃料来源，表明静息NSPC在能量和生物合成代谢中具有底物使用灵活性。在静息NSPC中，急性注射UK5099后，基础条件下OCR显著受损，而使用依托莫昔和BPTES分别抑制FAO和谷氨酰胺分解对OCR的降低程度较小。这些数据表明，静息NSPC使用丙酮酸作为线粒体呼吸的主要底物，并且至少部分糖酵解产生的丙酮酸被转运至线粒体。
UK5099急性抑制也导致细胞外酸化率（ECAR）显著增加，而阻断FAO和谷氨酰胺分解对ECAR无影响。这些结果表明，MPC抑制后乳酸分泌增加，我们通过直接测量UK5099处理的静息NSPC培养基中的乳酸含量证实了这一点。先前研究表明，外源性乳酸可促进NSPC增殖。因此，我们推测较高的细胞外乳酸水平可能是MPC抑制后增殖增加的原因。因此，我们测试了在静息诱导期间添加乳酸是否能模拟UK5099的效果。然而，静息NSPC的增殖率在添加乳酸后没有变化，尽管相同剂量的乳酸足以在增殖条件下增加NSPC的增殖。为证明乳酸浓度升高本身不足以解释UK5099对静息NSPC的影响，我们接下来使用了一种已建立的乳酸脱氢酶抑制剂，它可阻止丙酮酸转化为乳酸。同时用Ldh-i和UK5099处理的静息NSPC培养基中的乳酸浓度显著低于仅用UK5099处理的细胞，表明Ldh-i按预期减少了乳酸产生。如果丙酮酸转化为乳酸是MPC抑制后增殖增加所必需的，那么同时使用Ldh-i处理应至少部分阻止UK5099的效果。然而，我们发现，在静息条件下，单独使用UK5099或同时使用UK5099和Ldh-i处理时，NSPC的增殖没有差异。总之，这些数据表明，乳酸水平升高不是静息NSPC激活所必需的。
MPC抑制导致静息NSPC细胞内天冬氨酸水平升高
为分析静息NSPC中线粒体丙酮酸输入抑制导致的代谢变化，我们在静息诱导期间对存在或不存在UK5099培养的NSPC进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析显示，样本按处理分组，表明MPC抑制驱动静息NSPC发生深刻的代谢变化。通路富集分析显示，UK5099显著影响TCA循环和氨基酸代谢。虽然糖酵解中间体没有显著变化，但TCA中间体，特别是柠檬酸和琥珀酸水平，与未处理细胞相比明显降低。值得注意的是，苹果酸和富马酸没有显著差异。此外，MPC抑制导致细胞内天冬氨酸显著增加。总体而言，这些测量结果表明TCA活性受损以及氨基酸代谢重新布线，导致天冬氨酸水平升高。
细胞内天冬氨酸池由两种转氨酶维持：胞质酶谷草转氨酶1（GOT1）和线粒体GOT2。GOT1使用天冬氨酸生成谷氨酸和草酰乙酸，而GOT2使用这两种底物合成α-酮戊二酸和天冬氨酸。因此，我们测量了两种转氨酶的mRNA表达。UK5099处理的静息NSPC中Got1显著增加，而Got2仅略有增加。此外，天冬酰胺合酶（Asns）将天冬氨酸转化为天冬酰胺，其表达也增加。这些数据表明，MPC抑制后Got转氨酶表达增加，导致天冬氨酸水平升高。
细胞还可以通过谷氨酸-天冬氨酸质膜转运体溶质载体家族1成员3（SLC1A3，也称为GLAST）摄取天冬氨酸。静息NSPC已经表达高水平的这种转运体，UK5099处理后没有进一步增加。外源性天冬氨酸或SLC1A3过表达已被证明足以支持缺乏电子传递链（ETC）活性的细胞增殖。为测试MPC抑制后测得的
天冬氨酸增加是否可能是静息NSPC激活的原因，我们在静息诱导期间用不同浓度的天冬氨酸处理NSPC，观察到增殖的pH3阳性细胞数量显著增加。此外，同时用UK5099和5 mM天冬氨酸处理进一步增加了pH3阳性NSPC的比例。除了作为蛋白质中的氨基酸，天冬氨酸还用于核苷酸合成。我们发现，一些核苷酸合成酶在UK5099处理后确实上调，表明天冬氨酸水平升高可能用于促进核苷酸合成。总之，这些数据表明，抑制MPC导致静息NSPC中天冬氨酸水平升高，这可能是GOT活性增加和/或输入增加的结果。这种天冬氨酸的增加足以驱动NSPC激活。
MPC缺陷的NSPC能够通过代谢转变生成神经元
一旦激活，NSPC可以增殖并最终分化为神经元。因此，我们接下来测试了UK5099对已活跃/增殖NSPC的影响。与静息NSPC类似，活跃NSPC在UK5099处理后表现出OCR降低和ECAR增加，表明这些细胞尽管MPC1和MPC2水平低于静息NSPC，但仍使用丙酮酸驱动OXPHOS。非靶向代谢组学显示代谢转变，TCA中间体显著降低，并转向增加天冬氨酸和天冬酰胺的产生，而糖酵解中间体无变化。然而，尽管线粒体代谢发生这些变化，UK5099并未改变已活跃NSPC的增殖率。
神经元分化与OXPHOS基因表达增加相关。由于葡萄糖或乳酸衍生的丙酮酸被认为是分化过程中OXPHOS的主要燃料，MPC介导的丙酮酸输入因此也应在NSPC分化中发挥重要作用。因此，我们测试了活跃NSPC在UK5099存在下是否能分化为神经元。我们发现，在UK5099存在下分化7天后，细胞总数明显减少，表明线粒体丙酮酸可能在分化过程中调节细胞存活或细胞周期退出。然而，出乎意料的是，UK5099处理的NSPC仍能以与未处理NSPC相似的比例产生微管相关蛋白2ab（MAP2AB）阳性神经元。这些数据突出了NSPC的巨大代谢灵活性，当丙酮酸进入线粒体被破坏时，它们似乎使用其他代谢途径，特别是氨基酸代谢，来维持增殖和分化的能量需求。
为确认这些重要发现，我们使用来自Mpc1 fl/fl小鼠和WT对照小鼠的NSPC，并通过电穿孔表达mCherry-Cre的质粒诱导Cre介导的重组，并通过荧光激活细胞分选获得纯转染细胞群。Cre介导的Mpc1缺失后3天，与MPC1 WT NSPC相比，增殖的MPC1 cKO NSPC中MPC1蛋白水平显著降低。与UK5099处理的活跃NSPC类似，Mpc1缺失不影响活跃NSPC的增殖。我们接下来评估了MPC1 cKO NSPC是否能够分化为神经元。虽然我们在分化7天后也发现细胞总数有类似减少，但活跃NSPC中Mpc1缺失不影响向MAP2AB阳性神经元的分化和成熟。MPC1-cKO NSPC甚至比对照NSPC产生略多的MAP2AB阳性神经元（占总细胞数比例）。
为了进一步了解神经元产量增加的原因，我们接下来对活跃的MPC1 WT和MPC1 cKO NSPC进行了RNA-seq。常用的NSPC标记物在两组之间相当，表明尽管缺乏MPC1，MPC1 cKO细胞仍保留了NSPC的主要特征。在差异表达基因中，160个基因上调，34个基因（包括Mpc1）在MPC1 cKO NSPC中下调。上调基因的基因本体（GO）分析显示，参与神经元分化的GO术语显著富集，而下调基因未富集到特定GO类别。总之，这些结果表明，阻断丙酮酸进入线粒体进行OXPHOS并不影响NSPC的神经元分化，这与之前的预测相反。
体内NSPC中Mpc1缺失增加神经发生
我们接下来测试了在成体NSPC中体内敲除Mpc1是否会影响其分化能力，时间点为第一次他莫昔芬注射后30天。在P30时通过Cre介导的Mpc1缺失，导致P60时MPC1 cKO-tdTom小鼠和对照小鼠整个海马组织中Mpc1 mRNA和MPC1蛋白水平显著降低，如qRT-PCR和Western blot所示。MPC2也下调，正如先前在其他MPC1 KO细胞类型中所示。
免疫组织学分析显示，与对照小鼠相比，Mpc1缺失后1个月，MPC1 cKO-tdTom小鼠DG中tdTom+细胞总数显著增加。这种增加是由于DCX+/tdTom+神经母细胞和未成熟神经元数量增加，以及成熟新生神经元数量增加所致。这些数据表明，NSPC中Mpc1缺失并不损害体内新生神经元的生成。相反，NSPC中缺乏MPC1甚至导致新生神经元生成显著增加。
为解决增加的神经发生是否是由于已激活NSPC中细胞自主性的Mpc1 cKO效应，我们进行了立体定向注射，将编码Cre重组酶与GFP荧光团融合的RV注入携带floxed或WT Mpc1等位基因并与tdTom谱系示踪品系杂交的小鼠DG中。如前所述，这种病毒Cre递送策略仅靶向激活的NSPC。这种方法在未改变的微环境中产生MPC1缺陷的NSPC或对照NSPC，所有后代均被tdTom和GFP标记。病毒注射一个月后，在MPC1 cKO-GFP和MPC1 WT-GFP小鼠中均发现了成熟神经元。尽管缺乏MPC1，MPC1 cKO-GFP小鼠中的神经元与MPC1 WT-GFP小鼠中的神经元具有相似的形态，如通过Sho11分析和树突长度测量所评估。同样，总棘突数量没有改变，棘突成熟度正常。这些惊人的发现表明，即使葡萄糖衍生的丙酮酸氧化被破坏，NSPC也能产生正常的成熟新生神经元。这表明NSPC及其后代显示出代谢灵活性，能够补偿丙酮酸输入受损。
Mpc1缺失在老龄小鼠中也能增加神经发生
海马神经发生随年龄增长急剧下降，与2月龄相比，9月龄时循环NSPC减少四倍以上。最近的几项研究表明，这是由于NSPC休眠增加所致。当查询最近一篇比较体内休眠、静息和增殖NSPC的scRNA-seq数据时，我们发现Mpc1和Mpc2在休眠细胞中表达最高，在增殖NSPC中最低。由于Mpc1缺失导致年轻成年小鼠中静息NSPC激活，我们接下来测试了Mpc1缺失对老年动物休眠NSPC是否具有类似效果。在9至11月龄的MPC1 cKO-tdTom小鼠中诱导Mpc1缺失，30天后评估新生神经元数量。与MPC1 WT tdTom小鼠相比，老龄MPC1 cKO tdTom小鼠中tdTom+神经元数量显著增加，表明在老年小鼠中，NSPC在Mpc1缺失后也被激活，导致神经发生增加。
讨论
成体神经发生最重要的调控步骤之一是NSPC决定维持静息还是进入活跃状态。这一决定源于内在和外在指令，这些指令仍未完全阐明。我们在此证明，成体NSPC中静息的维持依赖于线粒体丙酮酸代谢，并需要MPC活性。MPC将丙酮酸输入线粒体，在成体NSPC中高表达，其功能丧失导致静息NSPC激活和神经发生增加。最近的研究表明，在其他干细胞中，如肠道和毛囊干细胞，Mpc1缺失也会增加增殖。此外，肿瘤细胞在过表达Mpc1后增殖减慢，表明可能存在MPC对细胞活性的共同调控。
鉴于干细胞大多是糖酵解性的，而它们分化的后代使用OXPHOS这一普遍观点，此处显示的MPC参与NSPC静息是出乎意料的，因为该载体通常被认为是氧化代谢的标志。我们的结果表明，静息1型细胞呈现出比通常认为的更氧化性的代谢，并且丙酮酸进入线粒体对于维持其静息状态是必要的。相应地，我们和其他人已报道，这些细胞具有精细的线粒体网络，并且可以利用脂肪酸为OXPHOS提供燃料。对这些差异的一个可能解释来自最近一项比较几种代谢蛋白的蛋白质组和转录组水平的研究：Wani及其同事证明，TCA、FAO和OXPHOS蛋白的变化在转录水平上反映不佳，而糖酵解酶在蛋白质和mRNA表达之间显示出更好的相关性。我们关于MPC对静息NSPC重要性的发现，为从代谢角度更好地理解静息维持开辟了不同视角。
线粒体丙酮酸控制1型干细胞增殖的详细分子机制仍有待阐明。尽管MPC抑制后乳酸水平明显改变，但我们的乳酸补充和乳酸脱氢酶抑制实验表明，乳酸浓度升高并非NSPC激活所必需。乳酸产生会触发毛囊干细胞的激活，表明乳酸对激活和增殖的影响取决于干细胞类型。丙酮酸进入线粒体的抑制已被证明可诱导向其他底物（特别是氨基酸）氧化的代谢转变，这反过来会重新连接细胞代谢。我们在阻断线粒体丙酮酸输入时也观察到主要的代谢变化，这导致了静息NSPC的激活。我们表明，抑制MPC会导致细胞内天冬氨酸增加，尽管OCR和TCA代谢物显著减少。天冬氨酸可能有不同来源，因此需要代谢流分析来阐明NSPC在UK5099处理下增加细胞内天冬氨酸水平的详细机制。使用代谢流分析，其他研究表明，在不同细胞类型中，MPC抑制通过线粒体氧化谷氨酰胺或谷氨酸导致天冬氨酸合成增加。这在NSPC中是否也是如此仍有待确定。有趣的是，我们还发现MPC抑制导致Got1表达显著增加和Got2轻微增加，两者是苹果酸-天冬氨酸穿梭系统的关键组分。这些数据表明，静息NSPC在MPC抑制后可能上调苹果酸-天冬氨酸穿梭，以将胞质NADH转运至线粒体用于能量生产，并再生NAD+以平衡细胞NAD+/NADH库。由于已证明在ETC活性下降的情况下，NAD+的循环对于细胞增殖是必要的，苹果酸-天冬氨酸穿梭激活可能对缺乏MPC功能的细胞也很重要。ETC缺陷也可能导致GOT1活性逆转，导致GOT1依赖的还原性天冬氨酸合成，例如，两项最近的研究所示。在缺乏MPC活性的静息NSPC中，ETC预期是功能性的。然而，我们不能排除GOT1活性也可能因为更少的电子进入ETC复合物I和OXPHOS下降而被逆转。
尽管如此，天冬氨酸本身是一种关键的细胞增殖氨基酸，不仅用于蛋白质合成，还用于嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成。外源性天冬氨酸足以维持增殖，即使在缺乏功能性ETC的情况下，并且也是癌细胞增殖的限制性代谢物。此外，天冬氨酸水平已被证明直接影响造血干细胞增殖。我们发现添加外源性天冬氨酸模仿了UK5099对NSPC退出静息的影响，这与先前这些发现一致。天冬氨酸和UK5099的相加效应表明，天冬氨酸摄取和/或天冬氨酸生物合成这两种机制都贡献了细胞内天冬氨酸池。尽管它对NSPC激活有明显影响，但天冬氨酸究竟如何发挥其作用仍有待阐明。一种可能的解释是，天冬氨酸用于嘌呤/嘧啶和天冬酰胺的合成，类似于在造血干细胞中的发现。我们的代谢组学和mRNA表达数据指向这个方向，显示MPC抑制后静息NSPC中天冬酰胺合成酶和天冬酰胺合成增加，以及核苷酸合成酶轻微增加。天冬氨酸和UK5099的相加效应也可能表明，除了增加细胞内天冬氨酸外，MPC抑制可能对静息NSPC的激活还有其他影响。
NSPC静息与激活平衡的转变预计会影响净神经发生，因为产生新神经元是激活的成体海马NSPC的默认命运。相应地，我们发现Mpc1缺失后新生神经元数量显著增加。然而，鉴于普遍接受的观点，即大多数神经元严重依赖葡萄糖和乳酸衍生的丙酮酸进行OXPHOS，这种形态上正常的神经元增加是惊人的，因为人们预期新生神经元在没有丙酮酸氧化的情况下无法正常成熟。这些结果表明，如果它们偏好的代谢途径被阻断，新生神经元可能具有比之前认为的更高的代谢灵活性。与此一致，已证明几种类型的成熟神经元在MPC被抑制时，确实能够通过将代谢转向其他可为OXPHOS提供燃料的底物来维持其功能。我们表明，MPC1 cKO NSPC能够在体外和体内产生成熟神经元。这些发现突显了NSPC用于分化为成熟神经元的一种新形式的代谢可塑性。MPC1 cKO似乎还使NSPC倾向于神经元分化，正如我们的RNA-seq数据所示。这些数据表明，代谢状态可能直接影响命运决定。这种神经元启动是否通过MPC1 cKO NSPC中的表观遗传修饰实现仍有待确定。
海马神经发生在年龄增长时由于NSPC的终末分化和深度静息增加而显著下降。我们的数据表明，MPC缺失也足以唤醒老年小鼠中这些更休眠的NSPC，导致新生神经元数量增加。支持这些发现，我们发现，在最近一项比较不同状态的scRNA-seq研究中，Mpc1在休眠NSPC中表达最高，这与我们体外的静息数据一致。
总之，我们已经证明，NSPC的静息是一种主动维持的状态，需要MPC介导的丙酮酸进入线粒体。MPC失活导致静息NSPC激活，并随后增加神经发生，即使在老年小鼠中也是如此。我们的发现因此描述了一种通过线粒体代谢控制NSPC功能的机制。
材料与方法
动物
所有研究均获得瑞士日内瓦消费与兽医事务部的批准。小鼠与同窝小鼠在标准饲养条件下群居，12小时光照/黑暗循环。Nestin-GFP报告小鼠来自S. Jessberger，hGFAP-CreERT2小鼠来自N. Toni，Mpc1 fl/fl小鼠来自E. Taylor，tdTom fl-STOP-fl小鼠来自I. Rodriguey。所有小鼠均为C57BL/6背景。基因分型使用从趾骨活检提取的DNA进行，使用以下引物：hGFAP-CreERT2: F-CAG GTT GGA GAG GAG ACG CAT CA, R-CGT TGC ATC GAC CGG TAA TGC AGG C; MPC1 fl/fl: F1-CCT ATT CTC TAG AAA GTA TAG GAA CTT CGT CGA, F2-GTG AGC CCA GAG CTA CGA AGG ATC GGC, F3-GGA AAG AAA AAG GTG TCC AAT TTT AGC TCT GCA; tdTom fl STOP-fl: F 5′-CTG TTC CTG TAC GGC ATG G-3′, R 5′-GGC ATT AAA GCA GCG TAT CC-3′, tdTom WT/WT:-F 5′-AAG GGA GCT GCA GTG GAG TA-3′, R 5′-CCG AAA ATC TGT GGG AAG TC-3′。
体内处理
他莫昔芬（100 mg/kg；Sigma-Aldrich）连续五天（P30至P35）腹腔注射以诱导体内重组。他莫昔芬溶解于葵花籽油中。
转录组资源分析
我们查询了可用的scRNA-seq数据中Mpc1的表达。对于NSPC中Mpc1的表达，将Shin等人的原始无监督聚类和伪时间亚组进一步分为三个亚组：S1-S2、S3和S4-S5，分别反映从静息到增殖的状态。
病毒制备
CAG-Cre-GFP病毒如前所述生产。简要来说，使用Lipofectamine 2000在Opti-MEM中将pCAG-GFPcre、pCMV-gp和pCMV-vsvg质粒转染人胚胎肾293 T细胞。转染后48小时，通过0.22 μm过滤器过滤细胞培养基收集病毒。滤液随后通过超速离心（19,400 rpm）浓缩两次。病毒沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用于体外实验和立体定向注射。
细胞培养
如前所述分离7周龄C57/Bl6或Mpc1 fl/fl雄性小鼠海马的成体小鼠NSPC。为进行扩增，细胞在补充有N2、人表皮生长因子（EGF，20 ng/ml）、人成纤维细胞生长因子（FGF）-碱性（20 ng/ml）和肝素（5 μg/ml）的DMEM/F12 GlutaMAX中培养为球体。培养基还含有抗生素-抗真菌剂。每两天更换一次培养基。对于增殖实验，将细胞接种在涂有多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片上，并按上述方法培养。
如前所述诱导静息。将增殖的NSPC接种在涂层的玻璃盖玻片或塑料细胞培养板上。24小时后，将培养基更换为基于DMEM/F12 GlutaMAX、补充有N2、人FGF-碱性（20 ng/ml）、肝素（5 μg/ml）和骨形态发生蛋白4（50 ng/ml）的静息培养基。诱导后72小时，细胞完全静息，用于后续实验。对于UK5099实验，静息完全建立3天，然后洗去细胞，胰蛋白酶消化，并接种在新鲜静息培养基中的涂层盖玻片上。
为进行比较，增殖NSPC以较低密度接种在增殖条件下。通过收集静息NSPC并将其重新接种在增殖条件下3天来逆转静息状态。EdU脉冲通过将静息NSPC与10 μM EdU在37°C孵育1小时，然后在固定前进行。
对于分化实验，将细胞接种在涂有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片或细胞培养板上，并在含有五分之一人EGF和人FGF-碱性（即2 ng/ml）的培养基中培养。3天后，培养基更换为不含任何人EGF和人FGF-碱性的培养基。分化6至7天后，用4%多聚甲醛固定细胞15至20分钟。细胞用PBS洗涤两次，每次10分钟，染色前储存在4°C。
药物和天冬氨酸处理
增殖NSPC用1或10 μM UK5099处理72小时。对于静息实验，NSPC在静息诱导的同时用1或10 μM UK5099、1 μM乳酸脱氢酶A抑制剂和1、2.5或5 mM天冬氨酸处理。对于退出实验，静息NSPC在静息建立后用UK5099处理。
对于分化实验，增殖NSPC用1或10 μM UK5099处理48小时。然后，洗去细胞，并接种在含有五分之一生长因子和指定浓度UK5099的培养基中的涂层盖玻片上。与UK5099处理类似，在静息诱导期间使用1、2.5或5 mM天冬氨酸。
体外病毒感染
将增殖NSPC接种在涂有聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的细胞培养板上。接种后一天，向细胞中加入0.5 μl RV Cre-GFP病毒。病毒感染后两天，将细胞重新接种在增殖培养基中的玻璃盖玻片上。24小时后，培养基更换为静息培养基。静息3天后，用4% PFA固定细胞。
细胞外乳酸测量
静息3天后，收集培养基，300g离心5分钟，并在测量前速冻。乳酸浓度使用含有0.33 M甘氨酸-氨基脲、0.015 M NAD和乳酸脱氢酶（70 U/ml）的缓冲液进行评估。通过测量NAD转化为NADH在340 nm处的吸光度来间接评估乳酸浓度。
代谢燃料通量测定
使用Seahorse XFe96分析仪测量OCR和ECAR。每个孔接种4000个NSPC于96孔Seahorse XF96细胞培养微孔板中，使用增殖培养基。24小时后，诱导静息。静息条件满三天后，用补充有10 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺和1 mM丙酮酸的非缓冲DMEM仔细洗涤细胞，并向细胞中加入180 μl分析培养基。分析前，将板在37°C的无CO2培养箱中平衡1小时。
根据制造商方案进行Mito燃料灵活性测试。记录基线OCR 14分钟，然后如上表所示注射不同组合的抑制剂，同时测量OCR。Mito燃料灵活性测试分别使用UK5099、BPTES和依托莫昔抑制三种主要代谢底物——丙酮酸、谷氨酰胺和脂肪酸的输入。
依赖性计算为：Dependency (%) = (Baseline OCR − target inhibitor OCR) / (Baseline OCR − All inhibitors OCR) * 100
容量计算为：Capacity (%) = [1 − (Baseline OCR − other 2 inhibitors OCR) / (Baseline OCR − All inhibitors OCR)] * 100
灵活性计算为：Flexibility (%) = % Capacity − % dependency
为评估MPC1抑制的效果，在静息NSPC中测量基线OCR和ECAR 14分钟。注射不同药物组合——UK5099、依托莫昔、BPTES、细胞转染与流式分选
使用4D-Nucleofector X Unit EA和P3原代细胞4D-Nucleofector X溶液，将编码mCherry-Cre重组酶的质粒电穿孔至增殖的MPC1 WT和MPC1 cKO NSPC中。NSPC在正常增殖培养基中培养48小时，然后进行FACS分选。细胞经胰蛋白酶消化，重悬于EDTA-Dulbecco's PBS中，冰上保存直至分选。mCherry阳性细胞在MoFlo Astrios EQ细胞分选仪上分选，收集于增殖培养基中或直接于干冰上冻存。
免疫细胞化学
为可视化MPC1和线粒体，将接种在玻璃盖玻片上的细胞用4% PFA和0.2%戊二醛固定15分钟。对于所有其他染色，细胞用4% PFA固定15至20分钟。细胞用PBS洗涤两次，每次10分钟，染色前储存在4°C。细胞在含有0.2% Triton X-100和3%驴血清的Tris缓冲盐水（TBS）封闭液中封闭45分钟，并与指定一抗在封闭液中于4°C孵育过夜：小鼠-pH3（1:2000；Abcam）、兔-Ki67（1:500；Abcam）、兔-MPC1（1:100；Sigma-Aldrich）、兔-TOMM20（1:500；Abcam）、小鼠-Map2b（1:500；Sigma-Aldrich）。细胞在TBS中洗涤三次，每次10分钟，然后与二抗在封闭液中于室温避光孵育至少1小时。细胞在TBS中洗涤两次，每次10分钟。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:5000）染色5分钟，然后用TBS洗涤两次。盖玻片用自制的聚乙烯醇-DABCO基封片剂封片。为检测EdU，遵循制造商方案。
图像采集与分析
所有用于评估MPC1缺失、MAP2AB定量以及MPC1 WT和MPC1 cKO中线粒体形态的图像均使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM780）以40×或63×物镜采集。图像使用Fiji软件分析。树突长度使用Fiji上的“Simple Neurite Tracker”插件测量。所有用于评估增殖的图像均以盲法使用荧光显微镜（Nikon 90i或Leica DMi8）以20×或40×物镜采集。每个盖玻片拍摄10张图像，并使用Fiji以盲法分析。对于DAPI面积覆盖，使用荧光显微镜（Leica DMi8）以10×物镜采集56个拼图。在阈值化图像中测量覆盖面积。对于线粒体分析，使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM780）以63×物镜采集连续Z栈（0.3 μm）。如前所述，使用Fiji中的自由手绘工具测量线粒体长度。
培养NSPC的RNA-seq和qRT-PCR
对于RNA-seq，用pCAGmCherryCre质粒转染MPC1 WT和MPC1 cKO NSPC，并根据mCherry进行分选。分选后直接收集细胞，冻存，用于RNA提取。使用RNeasy micro试剂盒根据制造商方案提取RNA。RNA-seq数据由Alithea Genomics SA生成和分析。
对于体外样本，收集NSPC并速冻于干冰上。使用RNeasy mini试剂盒根据制造商方案提取RNA，然后使用SuperScript IV系统进行cDNA合成。使用PowerSYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR。所用引物如下：Mpc1、Mpc2、Got1、Got2、Asns、Slc1a3、Ppat、Pfas、Paics、Adsl、Atic、Cad、Umps、β-actin。使用β-actin作为管家基因归一化获得的CT值，每个样本基因表达使用比较ΔΔCT法计算。
脑组织qRT-PCR
使用TRIzol试剂法从海马组织中分离总RNA，RNA浓度使用NanoDrop One测定。使用500至1000 ng经脱氧核糖核酸酶处理的总RNA，使用GoScript逆转录酶进行逆转录。qRT-PCR在Bio-Rad CFX Connect光学模块上进行。CT值归一化至β-actin。
所用引物：Mpc1、Mpc2、β-actin。
蛋白提取与Western印迹
海马脑组织和细胞提取物在RIPA裂解缓冲液中匀浆，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在8%至15%聚丙烯酰胺凝胶中分离。蛋白浓度通过Bradford蛋白测定法使用牛血清白蛋白作为标准确定，并使用特异性抗体通过Western印迹分析。
所用抗体：兔-MPC1、小鼠-MPC2、山羊-VDAC、小鼠-HSP70、总OXPHOS抗体混合物、抗兔IgG-HRP、抗小鼠IgG-HRP、抗山羊IgG-HRP。
组织制备与免疫组化
所有实验小鼠在他莫昔芬注射后不同时间点（P33、P38、P60和10至12个月）用戊巴比妥钠深度麻醉，并立即用新鲜4% PFA（0.1 M PBS，pH 7.4）经心灌注。脑在4°C下后固定过夜。使用振动切片机切取50 μm和70 μm冠状切片，并储存在4°C的含0.02%叠氮钠的1× PBS中。对于免疫组化分析，切片在含0.3% Triton X-100和10%驴或山羊血清的PBS中通透1小时，然后在4°C下在轨道摇床上用以下一抗免疫标记过夜：小鼠-NeuN、鸡-GFP、兔-DCX、豚鼠-DCX、兔-Ki67。对于兔-MPC1和大鼠-Ki67染色，抗体在4°C下孵育72小时。一抗孵育后，切片再次用PBS洗涤三次，每次5分钟，然后在室温下用荧光二抗孵育2小时。最后，细胞核用DAPI复染，然后洗涤，用FluorSave试剂封片。
代谢组学分析
对于非靶向代谢谱分析，贴壁细胞用含75 mM碳酸铵（pH用乙酸调至7.4）的溶液洗涤。去除液体后，将培养板置于干冰上冷冻细胞。通过向细胞中加入冰冷的乙腈、甲醇和水的混合溶剂提取代谢物。提取物在分析前于13,000 rpm离心2分钟。
非靶向代谢组学分析通过进样-飞行时间质谱在Agilent 6550 QTOF系统上进行。仪器设置为在负离子化模式下以1.4 Hz全MS扫描，4 GHz高分辨率模式，质量电荷比范围50至1000。溶剂为60:40异丙醇/水，补充1 mM NH4F，pH 9.0，以及10 nM六(1H, 1H, 3H-四氟丙氧基)磷腈和80 nM牛磺胆酸用于在线质量校准。进样顺序随机化。数据以轮廓模式采集，进行质心化，并使用Matlab分析。通过递归在原始数据中填充缺失值。在识别出所有样本的共识质心后，通过精确质量和同位素模式对离子进行推定注释。从HMDB v4.0数据库出发，生成预期离子列表，包括去质子化、氟化以及在这些条件下发现的所有主要加合物。列举了所有在0.001 Da质量容差内匹配测量质量的分子式。由于此方法不使用色谱分离或深度MS2表征，因此无法区分具有相同分子式的化合物。使用RStudio进行主成分分析和组间统计比较。使用MetaboAnalyst 5.0进行通路富集分析。
体内病毒注射
一月龄（P30）重组的MPC1 cKO-tdTom和对照MPC1 WT-tdTom小鼠用5%异氟烷麻醉，置于小动物立体定位框架中，并在手术期间维持2.5%异氟烷。定期测试角膜和脚趾反射以确认麻醉深度。应用Lacryvisc以防止角膜干燥，并在覆盖头骨的皮肤上局部应用利多卡因。在无菌条件下暴露头骨后，在覆盖DG的头骨上钻一个小孔。从前囟（前向后−2 mm，外侧+1.5 mm，颅骨下2.3 mm背腹侧）以100 nl/min的速率单侧注射RV Cre-GFP进入DG（总体积1.5 μl），使用Hamilton注射器和CMA400泵。病毒注射后4周处死小鼠。
共聚焦显微镜采集与图像分析
所有图像均使用Leica共聚焦成像系统（TCS SP8）以20×或63×油浸物镜、Leica Thunder成像系统（DMi8）以20×物镜以及转盘共聚焦成像系统（Nikon Ti2/Yokogawa CSU-W1）以60×和100×油浸物镜采集。为定量重组tdTom阳性细胞与特定标记物，使用从DG起始处开始的连续切片。使用Fiji软件进行tdTom阳性和Ki67阳性细胞与不同标记物DCX和NeuN共定位的定量。为确认Ki67、DCX和NeuN与tdTom的共定位，使用63×放大倍率的单光学切片。
对于组织中MPC1定量，采集单个Nestin-GFP阳性细胞（Ki67阳性或阴性）的Z栈。使用IMARIS软件进行MPC1和GFP信号的定量。首先，使用表面插件进行GFP体积重建。为确认GFP表达细胞中MPC1的信号，使用掩膜插件在GFP阳性细胞中掩蔽MPC1信号。最后，使用表面插件进行掩蔽信号的MPC1体积重建。每组分析18至26个GFP阳性细胞。
对于Sho11分析，使用63×物镜对Cre病毒转染的GFP和tdTom双阳性新生神经元进行成像。以1 μm间隔采集Z栈，并使用Neurolucida软件追踪树突。每组4只小鼠，每只分析15至18个神经元。树突棘密度和棘形态如前所述进行评估，稍作调整。简要来说，使用63×物镜对20至30个Cre病毒转染的GFP和tdTom双阳性新生神经元的树突进行成像。使用Fiji软件分析树突长度和棘数量。棘密度表示为棘数量除以树突长度。棘形态根据在Fiji最大投影上测量的棘头最大直径分为两组。未成熟棘定义为0.25至0.6 μm，成熟棘>0.6 μm。然后对每组小鼠中的每个神经元表示每种类型树突棘的百分比。数据表示为未成熟棘与成熟棘之间的比率。所有图像均以盲法分析。
统计分析
使用Shapiro-Wilk检验测试数据正态性。当样本服从正态分布时，进行非配对Student's t检验比较两组，否则使用非参数Mann-Whitney检验。对于代谢组学数据，校正多重比较的P值。对于超过两组的比较，进行单因素方差分析，然后进行Holm-Sidak多重比较检验。当样本不服从正态性检验时，计算Kruskal-Wallis检验。对于Sho11分析中的树突复杂性，计算曲线下面积，然后进行非配对Student's t检验。所有分析均使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行。
插图软件
对于示意图，使用Biorender软件和Adobe Illustrator。
致谢
感谢E. Taylor和J. Rutter提供Mpc1 floxed小鼠，以及A. de la Rossa启动该项目并生成Mpc1 Flox;GFAP-Cre小鼠。我们还要感谢D. Moore和S. Jessberger在手稿方面提供的有益讨论。
资助：本工作得到以下资助机构支持：瑞士日内瓦大学（J.-C.M.）、瑞士国家科学基金会（项目号31003A_179421，J.-C.M.）和瑞士洛桑大学（M.K.）。
作者贡献：概念化：F.P., V.S., J.-C.M., 和 M.K. 方法论：F.P., V.S., J.-C.M., 和 M.K. 研究：F.P., V.S., S.M., 和 N.Z. 可视化：F.P. 和 V.S. 监督：J.-C.M. 和 M.K. 写作 - 初稿：F.P., V.S., 和 M.K. 写作 - 审阅与编辑：F.P., V.S., J.-C.M., 和 M.K.
竞争利益：J.-C.M. 是 MPC Therapeutics SA（瑞士日内瓦）科学顾问委员会主席。其他作者声明无竞争利益。
数据和材料可用性：评估论文结论所需的所有数据均存在于论文和/或补充材料中。RNA-seq数据可在NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）上获取，登录号为GSE220663。
补充材料
此PDF文件包含：
图S1至S6
参考文献与注释
- A. Denoth-Lippuner, S. Jessberger, Formation and integration of new neurons in the adult hippocampus. Nat. Rev. Neurosci. 22, 223–236 (2021).
- N. Urbán, T. H. Cheung, Stem cell quiescence: The challenging path to activation. Development 148, dev165084 (2021).
- C. H. Ly, G. S. Lynch, J. G. Ryall, A metabolic roadmap for somatic stem cell fate. Cell Metab. 31, 1052–1067 (2020).
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