自然界的外泌体
真核细胞持续分泌微泡、大分子复合物和小分子物质到周围环境的现象早已被发现。外泌体是天然纳米颗粒（或称纳米囊泡）的一种类型，在研究、诊断和治疗等多个领域展现出巨大潜力。这些30-120纳米的小型脂质膜囊泡通过细胞内内体多泡小体与细胞膜融合生成。人体血液、唾液、尿液和母乳等体液中普遍存在外泌体，且所有类型的细胞在体外培养时都会分泌它们。研究表明其具有多种天然功能，包括作为核酸（主要是RNA）、细胞质蛋白和代谢物的运输载体，作用于全身多个细胞、组织或器官。尽管对其形成机制、靶向特性及最终生理活性的研究仍不完善，但已有大量证据证实其在局部或系统性细胞间通讯中的关键作用。
作为工具的外泌体
外泌体研究正因多重因素快速发展：其与抗原呈递细胞及免疫应答的关联性，以及作为强大生物医学工具的诊断和治疗价值备受关注。现有应用包括：免疫治疗试剂开发、工程化遗传构建体载体、疫苗颗粒设计等。文献报道其可用于癌症及神经退行性疾病的诊断和预后，心脏修复等组织水平微通讯领域也取得进展。因其内容物可反映来源细胞的分化、信号传导或调控状态，外泌体被视为重要生物标志物。例如通过监测移植细胞分泌的外泌体，可预测细胞治疗的状态或结果。目前多个治疗领域的临床试验正在进行，典型案例为利用树突状细胞来源的外泌体激活抗肿瘤免疫反应。
外泌体生产制造
规模化生产涉及多个关键技术环节：首先是建立高效稳定的规模化生产体系；其次需避免动物血清等原料中的工艺相关污染物；最终需开发与细胞碎片等杂质的有效分离技术。针对不同应用场景，需选择适当的培养模式，并考虑材料质量体系与生产环境的合规性。当前标准生产流程包含三个阶段：1）目的细胞系的大规模扩增培养；2）含分泌外泌体的培养基收集；3）从其他囊泡、大分子复合物及培养基成分中纯化目标外泌体。
可扩展的外泌体生产
实验室阶段可采用多种培养、收获和纯化方法，但GMP级生产面临重大挑战。当前用于规模化生产的细胞类型涵盖转化细胞系、间充质干细胞到体外原代人类细胞等。主流平台包括：通过大量T-225培养瓶扩增（scale-out）、叠层多孔板培养系统及填充床生物反应器。由于外泌体的特异性产量较低，典型批次生产可能需要数百个T225培养瓶，或采用昂贵的多孔板系统及生物反应器。这些方案常需要多轮细胞传代扩增，收获前可能经历细胞凋亡阶段，导致膜碎片污染。
大规模生产培养基需满足两个关键要求：既支持细胞系高效扩增，又需减少工艺相关污染物并利于外泌体纯化。特别需要注意的是，天然胎牛血清（FBS）本身含有的内源性外泌体会严重污染目标产物。传统培养基（如RPMI1640/10% FBS）体系需采取两种解决方案：立即在细胞扩增后去除血清，或使用市场现有的外泌体耗竭型动物血清。虽然可考虑血清替代培养基（SFM），但并非所有配方都能在目标培养模式下实现高效扩增。此外，特定SFM必须经过验证以确保外泌体的产量和质量。
填充床反应器与中空纤维生物反应器（HFBR）已在生物技术领域应用多年，近年已证实其在外泌体高效规模化生产中的实用性。这类系统提供巨大的生长表面积，支持高密度细胞培养。通过细胞固定化或中空纤维分子量截留，实现代谢废物的及时清除和营养物质的持续供给。填充床反应器可从灌注液中收集外泌体，而其他系统通过保留较大分泌产物（如蛋白质、抗体、病毒）实现产物浓缩。细胞固定化培养可避免传代需求，且多种细胞在汇合后可无显著凋亡生长。某些应用中可实现数月的连续外泌体生产。值得注意的是，HFBR系统中外泌体无法穿过纤维膜，因此循环培养基中可使用标准血清（如GE医疗HyClone特色胎牛血清），不会污染毛细管外空间分泌的外泌体。两种技术的商业化系统均已实现一次性封闭生产。
外泌体分离纯化
收获后的纯化（或分步收集）可通过多种实验室方法实现，主要基于外泌体的尺寸、密度、形态、组成、ζ电位、生化或免疫特性等物理化学特征。现有方法包括：速率/密度梯度离心、体积排阻聚合物（如PEG或特定肽段）聚集沉淀，以及商用纯化试剂盒（如配体包被磁珠吸附色谱法）。每种方法均通过特定物理化学特性将目标外泌体与其杂质分离，但纯化效率及杂质残留类型和数量存在显著差异。在监管环境下的规模化经济纯化显著限制了可选技术范围，目前主流方法为多轮初步离心或微滤后接超速离心或纳米过滤。
结论
外泌体在人体内具有多重重要功能，其在研究、诊断和医疗治疗领域的应用发现正在快速扩展。规模化、符合质量监管要求的生产技术开发正在积极推进中。
参考文献
- John W. Ludlow, Benjamin Buehrer, John J. S. Cadwell. "规模化外泌体生产及其作为肌腱病变治疗剂的潜力"，国际细胞外囊泡协会年会海报展示，2015年4月23-26日
- Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 第144卷, "一次性生物反应器II"
- Rebecca E. Lane等, "外泌体纯化方法分析：基于可调电阻脉冲传感的模型脂质体系统研究", Scientific Reports, 2015年1月6日
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