摘要
山楂在传统医学中用于治疗各种疾病。山楂活性化合物具有抗炎和神经保护作用。鉴于相关研究较少，我们调查了不同运动训练模式及山楂口服摄入对三甲基锡（TMT）神经毒性大鼠海马组织负面影响的作用。通过腹腔注射TMT诱导神经毒性。注射后两周并确认疾病后，实施为期12周的耐力、阻力、联合训练协议和山楂口服摄入。为评估学习和空间记忆，在第12周进行了Morris水迷宫测试和反转测试。我们检查了海马组织中BDNF/Trk-β蛋白的表达，以证实或反驳与神经生成相关的学习和记忆测试。随着β-淀粉样斑块增加、乙酰胆碱酯酶活性增强、炎症加剧和抗氧化剂水平降低，海马中的BDNF/Trk-β蛋白表达减少，并观察到不利的组织变化和极大的神经生成依赖性空间学习和记忆障碍。12周的联合训练与山楂摄入在所有测量的功能和分子变量中均表现出良好的调整。Eosinophilic神经元坏死减少、星形胶质细胞增生减少、可能的突触嵌入增加和小胶质细胞增生增加在TMT+联合+山楂组大鼠的海马组织中被观察到。结合耐力和阻力训练与山楂口服摄入优于单独实施这些干预措施的效果在于，通过增加神经营养因子水平和胆碱能调节来减少神经毒性大鼠海马结构和功能的负面变化。
简介
三甲基锡（TMT）是一种神经毒性有机锡化合物，由于其对神经系统的有害影响而备受关注。TMT最初是为工业应用开发的，但如今广泛用于防污涂料、杀生物剂和各种化学过程，从而释放到环境中。使用TMT的行业工人由于长期接触中毒患者，神经毒性风险增加。值得注意的是，TMT在食物链中积累，尤其是海鲜，对人类健康构成风险。
TMT通过多重机制引起神经毒性。暴露于TMT可导致严重的神经退行性效应，包括认知障碍，特别是与海马组织损伤相关的认知障碍。TMT的神经毒性效应之一是线粒体呼吸链功能障碍，导致大鼠海马认知障碍和细胞凋亡增加。
有毒物质TMT通过破坏TCA循环/电子传递蛋白，通过Bax/caspase-3激活，导致能量缺乏和细胞凋亡。TMT还通过增加谷氨酸水平和改变兴奋性氨基酸转运体（EAAT）表达，特别是在视网膜中，诱导神经元凋亡。自噬通量通过溶酶体功能障碍和Kinesin家族成员5A（KIF5A）下调而中断，导致细胞损伤积累。此外，TMT通过过量ROS生产和蛋白激酶C-delta（PKCδ）介导的脂质过氧化促进氧化应激，加重神经退行性变。
TMT选择性诱导神经元死亡和海马多巴胺受体及转运体下调，这与认知障碍相关。此外，TMT暴露还增加了促炎细胞因子并减少了抗氧化酶水平，导致神经元损伤。TMT增加乙酰胆碱酯酶（ACHE）活性，导致乙酰胆碱水平下降，这对记忆和学习过程至关重要。
另一方面，脑源性神经营养因子（BDNF）/Tropomycin受体激酶β（Trk-β）信号通路对中枢神经系统多种功能以及大脑的生存、可塑性和健康至关重要。与BDNF相关的通路对神经系统的发育、突触可塑性和神经保护至关重要，因此在神经疾病的科研和治疗中具有巨大潜力。此外，BDNF/TrkB和AChE信号通路在认知障碍中有独特的关系。研究表明，AChE和BDNF/TrkB信号之间的联系尚未深入研究，但胆碱能系统的变化可能会改变BDNF的表达，反之亦然，从而导致认知变化。
尽管TMT的神经毒性效应已得到充分验证，但一些研究表明潜在的治疗干预措施，如使用二甲双胍、干细胞疗法、抗氧化剂和抗炎剂，可以减少认知缺陷并增强神经元恢复。这凸显了进一步研究保护策略对抗TMT诱导的神经毒性的必要性。
鉴于认知障碍药物治疗选项有限，运动作为一种重要的非药物干预手段，提高了患有神经系统疾病患者的生活质量和独立性。新兴研究表明，各种形式的运动训练可能作为有效干预手段，改善与神经毒性相关的认知缺陷。
运动不仅增加神经可塑性和神经保护，还减少与神经系统疾病相关的神经炎症和氧化应激的不良影响。
定期有氧运动已被证明可以提高认知功能并减少神经炎症，而阻力训练通过改善突触功能有助于神经保护。结合有氧、无氧和认知训练已被证明在预防与β-淀粉样蛋白神经毒性相关的记忆缺陷方面具有疗效，突出了多样化训练方案的重要性。
虽然运动在改善认知功能方面充满希望，但必须考虑个体对不同训练方式反应的差异性，这需要进一步研究以优化认知康复的运动处方。
除了运动，抗氧化剂是治疗由氧化应激引起的记忆丧失的重要化合物。流行病学研究和动物实验的结果表明，富含类黄酮的饮食对大脑有积极影响，可以减少神经疾病的发生率。
在这方面，山楂属（Crataegus），蔷薇科的一员，包括全球约1000种植物，在北半球许多国家，包括中国、美国、法国、英国和墨西哥广泛种植。该属植物因其在古代世界传统医学中的多种用途而具有显著的生长潜力。山楂是一种广泛使用的传统药物，尤其是在中国，一些种类的果实几乎被食用了一千年。医学文献《本草纲目》记录了其在中国传统医学中的使用。
研究表明，山楂的活性成分如类黄酮、苯丙素和萜类化合物可降低血脂、抗炎和神经保护。山楂的主要活性成分如表儿茶素、officinalic酸和槲皮素通过过氧化物酶体激活受体信号通路起作用。在Crataegus物种中，已经测定了羟基肉桂酸如绿原酸、阿魏酸、香豆酸和芥子酸。其中一些羟基肉桂酸充当抗氧化剂。该物种在不同国家的民间医学中被注册为一种应对记忆丧失的药物。通过不同机制，数项研究调查了该属的神经保护潜力。然而，关于Crataegus抑制乙酰胆碱酯酶的研究论文很少，这是神经疾病发病机制中涉及的机制。因此，山楂可能通过抑制乙酰胆碱酯酶和酪氨酸酶改善海马组织和认知功能。考虑到山楂在减少氧化因素方面的积极作用及其其他有益特性，似乎对控制海马组织神经元的结构变化有影响。然而，需要更多研究来发现山楂与运动训练相结合的分子机制和可能的协同效应，以应对像神经毒性这样的复杂疾病。
因此，本研究旨在调查三种耐力、阻力和综合训练模型以及口服山楂对三甲基锡（TMT）诱导认知障碍大鼠海马组织负向变化的影响。具体来说，我们检测了海马组织中脑源性神经营养因子（BDNF）/肌动蛋白受体激酶β（Trk-β）蛋白的表达，以证实或反驳与神经发生相关的学习和记忆测试。我们还测量了乙酰胆碱酯酶（ACHE）酶活性，以研究不同训练运动和口服山楂的影响，因为中枢神经系统患者的胆碱能调节是防止疾病进展的最常用方法之一。此外，我们报告了特定参数，如嗜酸性神经元坏死、可能的突触内陷、星形胶质细胞增多症和小胶质细胞增多症在海马组织中的表现。
结果
海马组织神经毒性的确认
注射TMT 10天后，观察到行为症状，包括肌肉震颤、体温升高、恶心、癫痫发作、尾巴摆动、攻击性行为和咬伤。此外，为进一步确认神经毒性，使用免疫荧光法检测了大鼠海马中β-淀粉样斑块的形成或缺失。结果表明，对照组（9.85±1.34%）和TMT组（27.23±1.66%）之间β-淀粉样斑块的平均表达存在显著差异（t=-14.054，P=0.001）。基于这些结果，成功诱导了神经毒性（图1）。
图1
注射TMT后，Trimethyltin（TMT）和健康对照大鼠海马中的β-淀粉样表达。
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海马神经发生依赖的空间学习和记忆
单因素方差分析在第一天（第一阶段）可见平台测试结果显示，所有大鼠都能够看到可见平台，且大鼠之间没有观察到差异（F=1.932，P=0.064）。此外，大鼠游泳速度也没有显著差异（F=0.831，P=0.591）（图2a）。
图2
Morris水迷宫测试结果。（a）可见平台测试中大鼠逃避潜伏期和游泳速度的变化。（b）隐藏平台（平台1）上大鼠逃避潜伏期的变化。*表示TMT组与其他组在显著性水平_P_<0.01上的显著差异，#表示TMT+Haw+Com组与其他组在显著性水平_P_<0.001上的显著差异。（c）探测测试中大鼠在隐藏平台象限中花费的时间和穿过隐藏平台位置的次数变化。缩写：健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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空间学习
研究使用Morris水迷宫测试检查了空间学习能力。记录了三天内到达隐藏平台的逃避潜伏期。分析显示，天数、组别以及天数与组别的交互作用对逃避潜伏期有显著影响。具体而言，在检查隐藏平台空间学习测试中组别与天数的交互效应对逃避潜伏期的影响时，天数（F=875.245，P=0.001，η2=0.818）、组别（F=122.643，P=0.001，η2=0.739）以及天数与组别的交互作用（F=9.592，P=0.001，η2=0.307）均有显著影响。进行了配对比较以进一步分析空间学习测试中各组之间的差异。结果显示，TMT组的逃避潜伏期显著高于HC组和其他组（图2b）。此外，接受运动干预、山楂和运动与山楂联合干预的组别的逃避潜伏期时间显著低于TMT组。在第三天（第七次测试）时，TMT+Haw+Com组的逃避潜伏期减少显著高于其他干预组（P<0.001）。随着训练次数的增加，所有接受运动和山楂干预的大鼠找到隐藏平台的时间比TMT组更短，而TMT+Haw+Com组找到平台的延迟时间低于所有组别。
空间记忆
研究调查了12周的训练运动、仅山楂以及两者结合对神经毒素大鼠空间记忆的影响，通过测量探测测试阶段在含有隐藏平台象限中花费的时间（F=16.674，P=0.001）和大鼠穿过的平台次数（F=28.130，P=0.001）来衡量。配对比较显示，与所有组别相比，TMT组在含有隐藏平台象限中花费的平均时间显著较低（除TMT+Swim、TMT+Resi和TMT+Haw组外）（P=0.001）。另一方面，TMT+Haw+Com组在含有隐藏平台象限中花费的时间显著多于所有其他组（P=0.001）。同样，在查看平台交叉次数时，发现TMT组的交叉次数显著少于所有其他组（P=0.001）。相比之下，TMT+Haw+Com组的平台交叉次数高于所有其他组（P<0.01）。较高的平台交叉次数表明保留了记忆（图2c）。
反转测试
Morris水迷宫测试的表现依赖于海马功能。在反转试验中，平台的位置发生变化，允许大鼠适应他们的策略并通过依赖空间线索来搜索新位置。这种类型的学习和记忆受到神经发生变化的影响（图3）。
图3
Morris水迷宫测试中的反转测试。（a）隐藏平台（平台2）上大鼠逃避潜伏期时间的变化。#表示TMT+Haw+Com组与其他组在显著性水平_P_<0.001上的显著差异。（b）探测测试中大鼠在隐藏平台1和2象限中花费的时间和交叉次数的变化。缩写：健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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依赖神经发生的空间学习能力
通过Morris水迷宫测试记录依赖神经发生的空间学习能力，基于到达隐藏平台新位置的逃避潜伏期时间（秒）进行两天四次测试作为依赖神经发生的空间学习测试。在检查组别与天数交互效应对依赖神经发生的空间学习测试中逃避潜伏期时间的影响时，天数（F=680.654，P=0.001，η2=0.724）和组别（F=78.606，P=0.001，η2=0.731）单独以及天数与组别的交互作用（F=6.304，P=0.001，η2=0.179）均有显著影响。
在Morris水迷宫反转测试中，要求大鼠学习不同象限中新平台的位置。房间内的线索保持不变，但大鼠必须整合来自第一个平台的重叠线索以找到第二个平台。这种类型的整合被认为是一种依赖神经发生的记忆。组间配对比较结果显示，TMT组的逃避潜伏期时间（衡量空间学习能力的指标）显著高于HC组和其他组（P<0.001）（图3a）。
此外，发现接受干预如运动、山楂和运动与山楂联合干预的组别的逃避潜伏期时间显著低于TMT组（P<0.001）。在第二天（第十二次测试）时，TMT+Haw+Com组的逃避潜伏期时间显著减少，与包括TMT+Swim、TMT+Resi、TMT+Haw、TMT+Haw+Swim、TMT+Haw+Resi和TMT+Com组在内的其他组相比（P<0.001）（图3a）。
依赖神经发生的空间记忆
空间记忆保留，特别是与第二个隐藏平台象限有关的记忆，依赖于神经发生。在第13次测试中，测量了在第二个隐藏平台象限中花费的时间作为空间记忆保留的指标。此外，还测量了在第一个平台象限中花费的时间。研究发现不同组在依赖神经发生的空间记忆方面存在差异（F=37.712，P=0.001）。
在prop 2实验中观察到不同组在含有隐藏平台1象限中花费时间的差异（F=5.026，P=0.001）。此外，在逆向Morris蓝迷宫测试的探针测试阶段，从平台2（F=105.558，P=0.001）和平台1（F=63.016，P=0.001）穿越的次数显著（图3b）。
空间记忆测试中的配对比较结果显示，TMT组大鼠在包含隐藏平台2的象限中花费的平均时间和穿越次数显著低于其他组（P=0.001）。相反，TMT+Haw+Com组大鼠在包含隐藏平台的象限中花费的时间和穿越次数高于所有其他组（P=0.001）。此外，当检查平台一区域的时间和穿越次数时，发现TMT组大鼠的时间较短且穿越次数较少，与其他组相比。相反，尽管在平台一区域花费的时间较少，TMT+Haw+Com组大鼠的穿越次数高于其他组。更高的平台穿越次数表明记忆得以保留（图3b）。
β-淀粉样蛋白表达
检查12周运动训练和山楂单独及联合对神经毒素大鼠海马组织中β-淀粉样蛋白表达水平的影响（图4a），结果显示不同组在DG（F=125.848，P=0.001）和CA1（F=148.023，P=0.001）区域存在显著差异。
图4
大鼠海马DG和CA1区域的β-淀粉样蛋白表达水平。（a）免疫荧光图像。海马DG（b）、和CA1（c）区域β-淀粉样蛋白表达水平的平均值±标准差。缩写：齿状回（DG）、Cornus Ammonis-1（CA1）、健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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对DG和CA1不同区域的β-淀粉样蛋白表达进行组间配对比较显示，TMT组大鼠在海马两个区域的β-淀粉样蛋白表达显著高于所有接受运动和山楂干预的TMT组和HC组（P=0.001）。12周后，TMT+Haw+Com组大鼠海马DG区域的β-淀粉样蛋白表达低于所有干预组，除了TMT+Com和TMT+Haw+Swim（P=0.001）。需要注意的是，TMT+Haw+Com组大鼠海马DG区域的β-淀粉样蛋白表达水平降低，以至于与HC组没有差异（P=0.670）（图4b）。此外，CA1区域的β-淀粉样蛋白表达水平在12周后显示，TMT+Haw+Com、TMT+Swim和TMT+Haw组显著低于其他组（P=0.001），并且这些组彼此之间没有差异，也与HC组没有差异（图4c）。
BDNF蛋白表达
检查12周运动训练和山楂单独及联合对TMT大鼠海马组织中BDNF蛋白表达水平的影响（图5a），结果显示不同组在DG（F=470.868，P=0.001）和CA1（F=404.236，P=0.001）两个区域的海马存在显著差异。
图5
大鼠海马DG和CA1区域的BDNF蛋白表达水平。（a）免疫荧光图像。海马DG（b）、和CA1（c）区域BDNF蛋白表达水平的平均值±标准差。缩写：脑源性神经营养因子（BDNF）、齿状回（DG）、Cornus Ammonis-1（CA1）、健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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组间配对比较显示，TMT组大鼠海马DG区域的BDNF蛋白表达显著低于其余接受运动、山楂干预的TMT组和HC组（TMT+Resi组除外）（P=0.001）。类似地，在海马CA1区域，TMT组大鼠的BDNF蛋白表达显著低于其余接受运动、山楂干预的TMT组和HC组（TMT+Resi和TMT+Haw+Resi组除外）（P=0.001）。
12周后，TMT+Haw+Com组大鼠海马DG区域的BDNF蛋白表达显著高于其他组（P=0.001），并且这一增加与HC组没有差异（P=0.708）（图5b）。此外，CA1区域的BDNF蛋白表达水平显示，TMT+Haw+Com和TMT+Haw+Swim组显著高于其他组（P=0.001），但这一增加低于HC组（P=0.001）。此外，TMT+Haw+Com和TMT+Haw+Swim组之间没有差异（P=0.063）（图5c）。
Trk-β蛋白表达
检查12周运动训练和山楂单独及联合对TMT大鼠海马组织中Trk-β蛋白表达水平的影响（图6a），结果显示不同组在DG（F=415.859，P=0.001）、CA1（F=250.835，P=0.001）两个区域的海马存在显著差异。
图6
大鼠海马DG和CA1区域的Trkβ蛋白表达水平。（a）免疫荧光图像。海马DG（b）、和CA1（c）区域Trkβ蛋白表达水平的平均值±标准差。缩写：酪氨酸激酶beta（Trkβ）、齿状回（DG）、Cornus Ammonis-1（CA1）、健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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配对比较组间的Trk-β蛋白表达显示，除了TMT+Resi组外，神经毒素组大鼠海马DG区域的Trk-β蛋白表达显著低于其他组（P=0.001）。在海马CA1区域，除了TMT+Resi、TMT+Swim、TMT+Haw和TMT+Haw+Swim组外，其余组的Trk-β蛋白表达显著低于其他组（P=0.001）。12周后，TMT+Haw+Com组大鼠海马DG区域的Trk-β蛋白表达显著高于其他组（P=0.001），以至于TMT+Haw+Com组的这一增加高于HC组（P=0.001）（图6b）。此外，CA1区域的Trk-β蛋白表达水平显示，TMT+Haw+Com组显著高于其他组（P=0.001），并且这一增加高于健康对照组的Trk-β蛋白表达水平（P=0.001）（图6c）。
抗氧化酶、脂质过氧化和AChE活性水平
检查12周运动和山楂单独及联合对TMT神经毒素大鼠海马组织中MDA作为脂质过氧化的水平（F=164.930，P=0.001）、GPx（F=181.068，P=0.001）、CAT（F=33.678，P=0.001）、SOD（F=191.444，P=0.001）和AChE（F=711.091，P=0.001）水平的影响，结果显示不同组在这些酶的水平上存在显著差异。
配对比较组间的MDA水平显示，TMT组大鼠海马组织中的MDA水平显著高于其余接受运动和山楂干预的TMT组和HC组（P=0.001）。因此，TMT+Haw+Com组大鼠海马的MDA水平显著低于其他组（P=0.001）（图7a）。
图7
TMT大鼠海马中MDA（a）、GPx（b）、CAT（c）、SOD（d）、AChE活性（e）的表达水平。缩写：丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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配对比较组间的GPx、CAT和SOD酶水平显示，TMT组大鼠海马组织中的这些酶水平显著低于其他组（P=0.001）。TMT+Haw+Com组中的这些酶水平显著高于其余接受运动和山楂干预的TMT组（P=0.001）。TMT+Haw+Com组的CAT酶水平与TMT+Com组没有差异（图7b-d）。
配对比较组间的AChE活性显示，TMT组大鼠海马组织中的AChE活性显著高于其余接受运动和山楂干预的TMT组和HC组（P=0.001）。所有干预组的海马AChE酶活性水平均有所下降，以至于TMT+Haw+Com组海马中的AChE酶活性显著低于其他组，除了HC组（P=0.001）（图7e）。
神经组织病理学参数
总体而言，基于Kruskal-Wallis非参数检验分析的组织结果和半定量分析显示，不同组在嗜酸性神经元坏死（P=0.001）、推测的突触镶嵌（P=0.001）、星形胶质细胞增生（P=0.001）和小胶质细胞增生（P=0.003）等参数上存在显著差异。
图8
TMT大鼠海马组织的神经组织病理学参数。基于H&E染色（放大倍数×400）的海马组织神经组织病理学参数的4点评分系统（0=正常，1=轻微异常，2=中度异常，3=显著异常）的平均值±标准差（a）。对于TMT大鼠海马中的嗜酸性神经元坏死（b）、推测的突触镶嵌（c）、星形胶质细胞增生（d）和小胶质细胞增生（e）。缩写：健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。
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根据Bonferroni修正后的后续检验，在嗜酸性神经元坏死的神经组织病理学参数中，我们观察到TMT、TMT+Swim和TMT+Haw组相较于HC组该参数的增加（P=0.001）。在TMT+Haw+Com、TMT+Resi和TMT+Haw+Swim组中，嗜酸性神经元坏死显著减少，与TMT、TMT+Swim和TMT+Haw组相比（P=0.001）。此外，Com组的嗜酸性神经元坏死低于TMT+Swim组（P=0.025）（图8b）。
此外，未观察到TMT组和HC组在推测的突触镶嵌参数上有显著差异。在TMT+Haw+Com、TMT+Com、TMT+Haw+Resi和TMT+Haw组中观察到该参数显著增加，与TMT组相比。此外，这些组相对于HC组也有显著增加（图8c）。
我们的结果在组间成对比较星形胶质细胞增生中显示，TMT组和HC组之间没有显著差异，但在TMT+Haw+Resi、TMT+Resi和TMT+Haw+Swim组中观察到12周后与TMT组相比显著增加。此外，TMT+Haw+Com组的星形胶质细胞增生低于TMT+Haw+Resi、TMT+Resi、TMT+Haw+Swim和TMT+Haw组。所有干预组（TMT+Haw+Com除外）的星形胶质细胞增生均高于HC组（图8d）。
在小胶质细胞增生的统计分析中，唯一的显著差异是在TMT+Haw+Com组与TMT+Resi、TMT+Haw+Swim和TMT+Swim组之间，未观察到其他组之间的显著差异（图8e）。
讨论
TMT的神经毒性效应显著，影响认知功能并引发神经退行性疾病，特别是对海马体。研究表明，TMT暴露会导致线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡，导致类似于阿尔茨海默病的认知障碍。在检查TMT对照组大鼠的海马组织后，我们发现这些大鼠海马组织中的β-淀粉样斑块增加，推测的突触镶嵌减少，嗜酸性神经元坏死增加。
此外，由于TMT大鼠海马组织的负面变化，TMT大鼠海马中的脂质过氧化水平也增加，这些变化除了影响突触可塑性外，还会影响产生新神经元的能力。
初步的组织培养实验研究表明，β-淀粉样纤维对神经元具有高毒性，在暴露24小时内会导致神经元完全死亡。在这种情况下，细胞死亡的机制似乎是因β-淀粉样的氧化作用而诱发的细胞凋亡。β-淀粉样蛋白通过不同的机制引起毒性。这些机制包括它们被小胶质细胞吸收，最终引发炎症，产生活性氧和突触损伤。
相反，小胶质细胞是对抗入侵病原体和其他类型脑组织损伤的主要防御屏障，在诸如神经退行性疾病、创伤和肿瘤等致病条件下被激活，聚集在受损区域并清除受损细胞的残骸。但在检查本研究中TMT大鼠的海马组织时，我们没有观察到小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的显著变化。
另一方面，TMT暴露改变了神经递质动力学，特别是降低了谷氨酸的摄取，这对于突触可塑性至关重要。由此产生的神经退行性疾病和氧化应激进一步阻碍了突触功能，导致认知障碍。
在进行Morris水迷宫测试后，TMT大鼠出现学习和记忆障碍。我们还使用反转测试来研究依赖神经发生的记忆和学习。一般来说，Morris水迷宫测试的表现取决于海马功能，它使大鼠能够利用房间空间地图中的视觉线索找到隐藏在水面下的逃生平台。改变隐藏平台的位置（反转试验）给大鼠提供了机会，通过重叠空间线索来改变策略，寻找平台的新位置。这种类型的学习和记忆对神经发生的变化敏感。在我们的研究中，由于TMT对照组大鼠海马中BDNF/Trk-β蛋白表达水平低，这组大鼠在反向学习和记忆测试中无法找到救援平台的位置，这些结果证实了与神经发生相关的认知障碍。
TMT暴露与阿尔茨海默病病理之间的BDNF/TrkB减少相似之处表明，TMT可以用作研究神经退行性过程的有用模型。王等人进行的一项研究表明，剥夺BDNF/Trk-β会导致炎症细胞因子增加并激活JAK2/STAT3通路，从而调节C/EBPb/AEP信号传导。在阿尔茨海默病患者的大脑中发现BDNF水平降低，并且这种降低与上述通路呈负相关。因此，有人认为BDNF可能在对抗阿尔茨海默病的发展中起到保护作用。给予BDNF已被证明对受伤动物的学习和记忆有有益效果，并且在阿尔茨海默病模型上的研究表明，BDNF对β-淀粉样蛋白毒性具有神经保护作用。
相反，虽然TMT的神经毒性效应已被充分记录，但一些研究表明潜在的保护策略，例如使用抗氧化剂和抗炎剂，可以减轻这些不良后果。在本研究中，我们调查了三种耐力、阻力和综合训练模型，以及口服山楂对TMT大鼠海马组织产生的负面影响。我们的研究结果显示，耐力+阻力训练结合口服山楂摄入对依赖海马功能和神经发生的记忆和学习产生了显著影响。因此，与TMT+Swim、TMT+Resi、TMT+Haw、TMT+Com、TMT+Resi+Haw和TMT+Com组相比，观察到TMT+Com+Haw组的逃生潜伏期显著缩短。此外，该组大鼠在记忆测试中表现更为成功，在含有平台的象限中游泳时间更
长。尽管平台位置发生了变化，在反转测试中，TMT+Com+Haw组的大鼠通过更好地重叠空间标志，能够在更短的时间内找到平台的新位置。在确认TMT+Com+Haw组大鼠的认知功能时，该组海马组织的分子结果与其他组相比显示，随着β-淀粉样水平的降低、抗氧化水平的提高和海马组织脂质过氧化的减少，TMT+Com+Haw组大鼠海马DG和CA1区域的所有三个区域的BDNF/Trk-β水平均有所增加。TMT+Com和TMT+Haw+Swim组在减少β-淀粉样蛋白水平和增加BDNF方面也取得了成功，但TMT+Resi和TMT+Resi+Haw组未能增加BDNF表达。TMT+Haw+Com组大鼠海马中的Trk-β表达水平高于其他接受运动和山楂干预的TMT组。此外，TMT+Haw+Com组的Trk-β水平在DG和CA1区域高于HC组。
运动长期以来被认为是通过引起局部变化来调节炎症的有效手段，这些变化使身体从炎症状态转变为抗炎或神经保护状态。
定期锻炼对预防认知功能障碍和大脑皮层及海马退化有积极影响，并能延缓记忆丧失和增强抗氧化活性。此外，定期锻炼可以帮助预防和改善阿尔茨海默病等神经系统疾病，通过减少β-淀粉样斑块。运动通过各种机制刺激神经营养因子的表达并激活大脑中的突触可塑性，包括增大海马体或胼胝体的大小、增强血流、改变轴突和树突以及促进神经发生。运动后脑内神经营养因子表达的增加，特别是BDNF，显著提高了海马齿状回和大脑皮层中多巴胺D2受体的表达。
据报道，有氧运动可以激活线粒体生物发生和血管生成。它还导致PGC-1、AMPK、鸢尾素和BDNF等蛋白质的表达，从而增强大脑功能。此外，有氧运动有助于激活脑组织中的神经胶质细胞，减少慢性炎症并改善中枢神经系统功能。阻力训练以其通过激活肌动蛋白分泌维持肌肉质量和力量的能力而闻名。它还可以通过抑制海马中的脂质过氧化和激活乙酰胆碱来预防认知功能障碍。然而，目前尚不清楚阻力训练是否对减少β-淀粉样斑块或激活增强大脑功能的因素产生积极影响。据报道，阻力训练激活了肌动蛋白分泌，并且通过抑制脂质过氧化和激活海马中的乙酰胆碱来预防认知障碍。
在我们的研究中，TMT+Swim组在减少DG区域的β-淀粉样蛋白方面表现优于TMT+Resi组，但这些运动的组合在减少β-淀粉样蛋白方面更为成功。耐力游泳训练在CA1区域减少了比TMT+Resi和TMT+Com组更多的β-淀粉样蛋白。结合耐力和阻力训练在预防肌肉减少症、保持老年健康和激活心肺功能方面起着关键作用，同时对激活大脑相关代谢功能及其肌动蛋白分泌具有平行效果。
先前的研究表明，耐力训练通过激活BDNF/Trk-β钙/钙调蛋白刺激蛋白激酶II（CaMKII）途径改善认知功能。另一方面，抗阻训练通过IGF-1/IGF-1R和AKT中间途径增强认知功能。此外，这两种类型的训练都被发现通过增加突触素I和突触素的表达来增强学习和空间记忆。因此，可以得出结论，耐力和阻力训练各自通过不同的分子途径对认知功能产生积极影响。然而，需要进一步研究以验证这些发现并提供更确凿的证据。
山楂不仅是极好的抗氧化剂来源，还为运动训练提供了益处。山楂含有重要的类黄酮，具有抗菌和抗氧化特性，还能刺激抗体的产生。在山楂果实中，酸含量主要由柠檬酸组成，其次是苹果酸和奎宁酸。抗坏血酸是人类必需的营养素，我们的身体无法自行合成，它在预防与氧化应激相关的疾病（如癌症和心血管问题）方面发挥至关重要的作用，充当抗氧化剂。Crataegus物种含有不同的羟基肉桂酸，如绿原酸、阿魏酸、香豆酸和芥子酸。其中一些羟基肉桂酸也具有抗氧化特性。
Crataegus物种，通常称为“山楂”，在不同国家的民间医学中被记录用于对抗记忆力减退。然而，迄今为止，仅发表了两篇关于Crataegus抑制胆碱酯酶的论文，这是阿尔茨海默病发病机制的一种机制，而不是TMT。在这项研究中，通过耐力、阻力、综合训练和山楂调节了TMT大鼠海马组织中的AChE酶活性，这些干预措施的组合在降低其AChE酶活性方面更为成功。
因此，在本研究中，山楂可能通过抑制AChE和酪氨酸酶改善了TMT大鼠的海马组织和认知功能。我们的结果显示，具有强抗氧化活性的山楂可能是增强记忆以应对TMT神经毒性效应的合适候选物。基于上述原因，结合耐力和阻力训练以及口服山楂摄入对暴露于TMT的大鼠海马的分子和组织方面都产生了积极影响。这些干预措施还有助于减少TMT对海马组织的副作用。通过改善分子方面，有可能使海马结构正常化。值得注意的是，迄今为止尚未进行过关于不同类型运动训练和口服山楂摄入对暴露于TMT的大鼠海马结构变化的影响的研究。然而，本研究的结果表明，联合运动与口服山楂摄入可以显著促进暴露于TMT的大鼠海马结构的重建。
最后，我们的研究有几个局限性。首先，使用动物模型是一个问题，因为它们的解剖结构和行为限制了普遍性，使得将结果外推到人类变得有问题。此外，特定的运动似乎没有遵循人类行为的规范标准，临床使用的山楂配方可能与研究中使用的有很大不同，这可能使其无效。此外，行为评估仅限于一组任务，其他与神经毒性相关的非认知功能可能被忽略。此外，仅基于大脑结构变化的认知评估只提供了部分信息，因为缺乏伴随的神经化学变化的信息。
材料和方法
实验程序
哈马丹Bu Ali Sina大学的动物护理和使用委员会批准了研究方案（代码：IR.BASU.REC.1401.019）。在这项调查中，使用了80只6周龄、体重在180至200克之间的雄性Wistar大鼠。这些大鼠由哈马丹医科大学提供。动物被安置在透明聚碳酸酯笼子中，在常规实验室环境中饲养，温度为23±1°C，光照周期为12:12小时（从早上8点开始），并自由获取食物和水。
在适应实验室条件一周后，大鼠被随机分为十组（每组n=8）：健康对照（HC）、假手术（SH）、三甲基锡（TMT）、三甲基锡+游泳耐力训练（TMT+Swim）、三甲基锡+山楂（TMT+Haw）、三甲基锡+山楂+游泳耐力训练（TMT+Haw+Swim）、三甲基锡+阻力训练（TMT+Resi）、三甲基锡+山楂+阻力训练（TMT+Haw+Resi）、三甲基锡+综合训练（TMT+Com）、三甲基锡+山楂+综合训练（TMT+Haw+Com）。图9显示了实施研究方案的过程示意图。
图9
实施研究方案的过程。
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TMT由于其易于管理和相对较短的神经退行性症状发作时间，可以用作阿尔茨海默病的诱导剂。TMT的主要靶标是海马，并且对锥体神经元有毒性作用。结构损伤在TMT注射后2-3天开始，并持续数周。在本研究中，TMT以8 mg/kg的剂量腹腔注射到大鼠体内。注射TMT 10天后，检查了大鼠的行为症状和海马中β-淀粉样的表达水平。根据研究，神经退行性疾病的临床症状包括肌肉震颤、体温升高、恶心、癫痫发作、尾巴抽搐、攻击性行为和自残。
准备含山楂的食物
山楂果实在被识别和收集自伊朗西部扎格罗斯山脉地区后，在Bu Ali Sina大学植物标本馆确认了编号8034。为了制备含山楂的特殊颗粒，首先将山楂果实放置在一个封闭环境中晾干一周。然后用专用香料研磨机将干燥的山楂果实磨成粉末，并按重量比6.25%的比例将所得粉末与Behparvar动物饲料公司提供的标准大鼠饲料混合，并用水混合直至成分完全融合。将所得面团倒入漏斗中并切成大鼠饲料颗粒。然后将颗粒放置在一个封闭环境中，干燥后在研究协议开始时给予食用山楂食物的组别。
使用反相高效液相色谱法（HPLC）鉴定山楂的活性化合物。根据我们之前的研究，取50克干燥山楂果粉末，与80%乙醇溶剂混合在Erlenmeyer烧瓶中。为了防止溶剂蒸发，我们用封口膜密封烧瓶。将所得溶液用Whatman滤纸过滤三次，并通过在47°C孵育器中放置以蒸发多余乙醇，直到获得干燥提取物。接下来，我们使用配备RP C18柱的Agilent 1260系统分离了山楂提取物的成分。样品随后用包含溶剂A（0.1%甲酸）和溶剂B（乙腈）的梯度系统以1.0 ml/min的流速清洗。清洗过程结束后，通过将其保留时间与标准品比较确定样品中存在的化合物。这是使用分别在280 nm、300 nm和340 nm波长下的二极管阵列检测器（DAD）检测完成的。为了估计每种化合物的含量，使用了其峰面积和相应标准品的校准曲线。通过将样品中每种化合物的峰面积与其校准曲线进行比较，可以确定该化合物的含量或浓度（图10）。
图10
高效液相色谱法（HPLC）分析山楂提取物的成分。
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运动方案
耐力训练
耐力训练的形式为游泳，为期12周，每周5天。大鼠在一个特殊的游泳池中游泳，游泳池带有水波发生器（30-33°C），第一周（5-15分钟）、第二周（20分钟）、第三周（30分钟）、第四周（45分钟）以及第五至第十二周（60分钟）。前九周每天一次训练课程，第十周每天两次训练课程，间隔四小时休息，第十一周每天三次训练课程，间隔三小时休息，第十二周每天四次训练课程，间隔两小时休息。
阻力训练
阻力训练采用爬梯形式，为期12周，每周5天。本研究使用的梯子长1米，共有26级台阶，与地面呈85度角。阻力训练方案的第一周是为了让大鼠熟悉爬梯，附加在大鼠尾巴上的负载量按体重百分比计算，第二周为30%，第三至第五周为70-90%，第六至第八周为100-110%，第九和第十周为120-130%，第十一和第十二周为140-150%的体重。每次训练课程包括3组，每组4次重复，每次重复之间休息30-60秒，每组之间休息120-150秒。
综合训练
综合计划每周进行2天阻力训练和3天耐力训练，按照耐力和阻力训练计划进行。
行为测试
在这项研究中，行为测试在大鼠进行12周运动训练后进行。这些测试在一个隔音测试室中进行了7天，使用Morris水迷宫装置和信号采集处理系统（Any-maze 7.48软件，Stoelting Co开发）。迷宫测试池为白色圆形水箱，直径122厘米，深度50厘米。顶部安装了一个摄像头，用于跟踪和记录大鼠在水箱中的游泳路径。水箱中注入22±2°C的水，深度约为30±1厘米。水迷宫储水库分为四个相等的象限：东北（NE）、西北（NW）、西南（SW）和东南（SE）（北、南、东和西）。此外，在每个象限的墙上放置了一系列不同的视觉线索，并一直保留到实验结束。这些视觉标记作为大鼠的提示。为了尽量减少研究人员存在可能带来的任何潜在偏差，他们在实验开始前保持在视线之外。这确保了研究人员的位置不会影响测试结果。总体而言，本研究在受控环境中利用行为测试来评估大鼠在运动训练后的游泳行为。
行为测试使用Stoelting Co开发的专有Any-maze 7.48软件进行记录。
第一天（第一次测试）进行了可见平台测试
一个圆形塑料平台高出水面1厘米，随机放置在一个象限中。每只大鼠从四个起始位置之一轻轻放入水面，面向水箱壁。一旦大鼠被释放到水中，计算机跟踪程序即被激活，每只大鼠有60秒的时间寻找平台。每次试验结束时，允许每只大鼠在平台上停留10秒钟。大鼠的游泳路径在计算机上可视化，记录找到平台所需的时间作为逃避潜伏期和大鼠的游泳速度。完成一次试验后，用毛巾擦干每只大鼠并将其放回笼子。在此阶段，每只大鼠从四个起始象限随机释放入池中，间隔15-20分钟。
第1至3天（第2至7次测试）进行了隐藏平台测试（空间学习测试）
在隐藏平台测试中，每天进行两次测试。每次测试包括将大鼠放入水中四次。平台被放置在东南（SE）象限下的浑浊水中。从四个象限中随机选择大鼠并将它们释放到池中进行四次试验。每次试验之间有15-20分钟的间隔。在每次试验期间，给大鼠60秒的时间寻找隐藏的平台。如果大鼠在此时间内找不到平台，则由研究人员用手引导爬上平台，并在每次试验结束时允许在平台上停留10秒。之后，记录逃避潜伏期（找到平台所需的时间）以供进一步分析。最后，用干毛巾和电热器温暖每只大鼠，然后将其放回笼子，直到下一次实验。
第四天（第八次测试）进行了探测测试
在这个阶段，我们将每只大鼠放在一个新的起始位置，以考察其空间探索能力，这样就可以通过移除池中的平台来评估大鼠对平台位置的偏好。每只大鼠被释放到水中一次，时间为60秒，面对水箱壁。起点是西北象限（NW），它是距离SE象限最远的象限。水迷宫中的距离、游泳速度和穿越平台的次数由追踪软件记录。然后，在干燥和加热后，将大鼠返回笼子。
反向测试（空间学习测试2）在第5和第6天（第9至12次测试）进行
反向实验在第5和第6天进行。平台被放置在西北象限（NW）中间（而不是东南象限）。根据隐藏平台实验的描述，进行了反向测试阶段。
探测测试在反转测试后的第七天（第十三次测试）进行
反转测试后24小时按照先前描述的方式进行探测测试。在此步骤中，还计算了在先前平台位置（SE）游泳和穿越平台的时间。
组织准备
在我们的研究中，使用氯胺酮（剂量为80-100 mg/kg）和赛拉嗪（剂量为10-20 mg/kg）的组合麻醉大鼠，确保它们完全无意识且感觉不到疼痛。然后，使用100 ml生理盐水和250 ml 4%多聚甲醛在0.1 mg磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中进行灌注。此过程有助于固定和保存组织以进行组织学和分子研究。随后，去除动物颅骨，并小心提取海马。然后，为了进行神经组织病理学和分子研究，将提取的海马存放在10%福尔马林溶液和-80°C下，以保持组织完整性直到进一步分析。
海马神经组织病理学研究
为了研究海马的组织学，在福尔马林中固定样本24小时后，进行固定、脱钙和组织处理。制备厚度为5 μm的组织切片后，进行苏木精和伊红（H&E）染色。然后检查神经组织病理学参数（嗜酸性神经元坏死、推测的突触镶嵌、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生）。使用光学显微镜（Olympus，400×）评估神经组织病理学参数。采用结构化的4点评分系统对结果进行量化，从而进行系统性和客观的组织样本分析。评分标准如下：评分为0（正常）：表示观察到的组织没有病理变化，所有细胞结构完整且功能正常。评分为1（轻微异常）：评分为1表示轻度偏离正常的组织学特征。这些变化可能包括细胞形态或密度的轻微改变，但整体组织仍保留大部分正常特征。评分为2（中度异常）：评分为2表示组织中度异常。在此水平上，明显的变化存在，例如细胞死亡增加、细胞形状改变或神经元密度降低，表明对组织完整性有显著影响。评分为3（显著异常）：评分为3表示严重的病理变化。这可能涉及广泛的嗜酸性神经元坏死、明显的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生，表明海马体内存在重大损害和功能障碍。使用这种评分系统不仅有助于清晰传达结果，还允许在不同样本和条件下进行比较，提高结果的可重复性和可靠性。
免疫荧光检测海马组织DG和CA1区域的β-淀粉样蛋白和BDNF/Trk-β蛋白
如前所述，从大鼠大脑中取出海马组织，并在10%福尔马林中固定。下一步，根据组织制备步骤进行染色，它们在不同比例的酒精中脱水并通过二甲苯澄清。用石蜡包埋样品后，使用旋转式切片机从所有模具中切出5 µm厚的切片。脱水后，玻片在65°C下与50%甲醛和2X柠檬酸钠缓冲液孵育2小时，然后用100 µm硼酸钠缓冲液（pH = 8.5）洗涤两次。为了使DNA变性，样品在37°C下与2N HCl孵育，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。样品用Triton-X 100（0.3%）和山羊血清（10%）在PBS中封闭30分钟。最后，样品在2至8°C下与β-淀粉样蛋白多克隆抗体（E-AB-70168, Elabscience）、BDNF（ab108319, Abcam）和Trk-β（sc-377218, Santa Cruz Biotechnology）的一抗孵育一夜。下一步，玻片在37°C下与连接荧光FITC的二抗（ab6785, Abcam）孵育90分钟。然后，为了染核，玻片在15分钟内与6-4-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育。压片后，使用荧光显微镜（Olympus BX50）检查玻片。最后，使用Image J软件版本1.5，通过检查捕获图像中的绿色像素密度来测量蛋白质。这种方法依赖于标记抗体发出的荧光强度与组织切片中特定蛋白质丰度相关的原理。通过应用适当的阈值技术，软件将荧光信号与背景噪声隔离，从而准确测量像素强度。所得数据反映了目标蛋白质的浓度，提供了对其表达水平的可靠和定量评估。
研究海马中脂质过氧化物、抗氧化酶和AChE活性水平
为了评估抗氧化酶和脂质过氧化物水平，称取100 mg海马组织，与特定量的PBS（100 mmHg，pH 4.7）匀浆。样品随后解冻并储存在2至8°C之间。在后续步骤中，向样品中加入一定量的PBS（pH 7.4）。约100 mg组织与1 ml PBS缓冲液彻底匀浆，然后以4000至6000 rpm的速度离心20分钟。制备好组织匀浆液后，将其转移到单独的微量离心管中，并置于-80°C冰箱中保存。
使用ELISA试剂盒测量海马中的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）酶的水平。MDA的范围为7.813–500 ng/ml，GPX为31.25–2000 pg/ml，CAT为31.2–2000 mU/ml，SOD为15.6–1000 pg/ml。
使用Ellman等人开发的方法测量AChE酶的活性。该方法涉及使用分光光度计测量硫代胆碱的生成速率。以下是测量步骤：（1）将海马组织在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中匀浆。（2）然后在4°C下以14,000 rpm离心5分钟。（3）从所得上清液中取出0.2 ml并加入比色杯中。（4）向比色杯中加入2.8 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液和100 µl Ellman试剂（0.01 M；5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸））。（5）接下来，向混合物中加入20 µl底物（乙酰硫代胆碱碘化物）。（6）将混合物在30°C下孵育2分钟。（7）孵育后，使用分光光度计在412 nm波长下测量反应产物（硫代胆碱和5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）反应形成）的生成速率。通过测量硫代胆碱的生成速率，该方法可以量化海马组织中的AChE酶活性。
统计分析
收集数据后应用描述性和推断性统计。使用Levene检验确定方差的同质性，使用Shapiro-Wilk检验确定数据分布的正态性。使用双因素ANOVA检验检查空间学习测试中的天数*组别交互作用。使用Kruskal-Wallis检验（Bonferroni修正后检验）确定组织质量结果和海马神经组织病理学分析的组间平均差异，而单因素ANOVA检验（Tukey事后检验）用于确定研究中定量变量的组间平均差异。所有结果均以均值±标准差表示，P<0.05被认为具有统计学意义。所有数据分析均在SPSS软件版本26中进行。
数据可用性
本研究期间生成的所有数据均已分析并发布在手稿中。如有合理请求，原始数据将由通讯作者提供。
致谢
伊朗国家科学基金会（INSF）支持了这项研究，批准代码为4003775。
资金
本研究未获得任何资金支持。
作者信息
作者及所属机构
- Bu-Ali Sina大学体育科学学院运动生理学系，伊朗哈马丹
Maryam Keshvari & Ali Heidarianpour
- 沙希德·贝赫什提医科大学胃肠病学和肝病研究中心，德黑兰，伊朗
Farzaneh Chehelcheraghi
作者贡献
M.K.和A.H设计了这项研究；M.K.执行了研究并撰写了论文。M.K. A.H和F.CH分析了数据。最终发布的版本由所有作者负责。
通讯作者
通讯作者为Ali Heidarianpour。
伦理声明
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
伦理批准
本研究中的所有方法和程序均按照ARRIVE指南（ Ali Sina大学哈马丹动物护理和使用委员会获得（代码：IR.BASU.REC.1401.019）。
其他信息
出版商说明
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版权声明
(全文结束)
