摘要
衰老是大多数神经退行性疾病的主要风险因素，但脑部不同细胞类型的衰老进程仍不清楚。本研究利用31名18-94岁捐赠者的死后前额叶皮质组织单核RNA测序数据，构建了人脑细胞类型特异性转录组衰老时钟。研究覆盖73,941个高质量细胞核，发现主要细胞类型（如小胶质细胞）的转录组特征：老年样本小胶质细胞出现炎症反应基因（FOXP1、TLR2、CD163）上调，稳态标记基因（CX3CR1、P2RY12、P2RY13）下调。基于各细胞类型的衰老时钟可准确预测实际年龄，识别生物相关通路，并在独立数据集中验证其普适性。研究发现阿尔茨海默病和精神分裂症患者存在细胞类型特异性年龄加速现象，提示这些疾病的衰老轨迹异常。该成果证明通过细胞类型特异性转录组时钟可量化人脑生物衰老，为神经退行性疾病的易感性机制研究提供新工具。
1 引言
衰老伴随的分子变化导致脑部细胞功能衰退，是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的主要风险因素。传统基于bulk组织的衰老时钟缺乏细胞类型分辨率。本研究首次利用单核RNA测序技术，构建人脑主要细胞类型（少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等）的高分辨率衰老模型。通过31例死后前额叶皮质样本（18-94岁）的单核测序，开发了可验证的细胞类型特异性衰老时钟，并在阿尔茨海默病和精神分裂症数据集中检测到特定细胞类型的衰老加速现象。
2 结果
2.1 人脑衰老队列的单核RNA测序
研究纳入31名捐赠者的前额叶皮质样本（年轻组18-39岁，n=8；中年组40-59岁，n=7；老年组60-94岁，n=14），获取73,941个高质量细胞核。无偏聚类识别出19个细胞簇，涵盖所有主要细胞类型（少突胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞、小胶质细胞、抑制性神经元、兴奋性神经元），且各细胞类型在各年龄组均有代表。
2.2 小胶质细胞和星形胶质细胞的衰老转录组变化
比较不同年龄组的差异基因表达发现：
- 小胶质细胞：老年组炎症反应基因（FOXP1、TLR2、CD163）显著上调，稳态标记基因（CX3CR1、P2RY12、P2RY13）下调（p<0.05）。
- 星形胶质细胞：老年组反应性星形胶质化相关基因（TPST1、SAMD4A、CNN3、STAT3、SORBS1）表达上调。
GO分析显示，老年组星形胶质细胞的蛋白错误折叠通路富集，少突胶质细胞的伴侣介导蛋白折叠通路富集，兴奋性神经元的蛋白质翻译通路富集。
2.3 人脑细胞类型特异性转录组衰老时钟开发与评估
采用ElasticNet回归模型，基于5折交叉验证构建三种模型：
- 单细胞模型：使用单细胞基因表达值
- 简单伪bulk模型：按细胞类型平均表达
- 自举伪bulk模型：随机抽样细胞进行平均（少突胶质细胞200个，其他类型50-100个）
结果显示：
- 单细胞模型：各细胞类型预测相关系数0.74-0.83（MAE 10.2-12.2年）
- 自举伪bulk模型：相关系数提升至0.78-0.89（MAE 8.5-11.2年）
- 简单伪bulk模型表现较差（相关系数低至0.4，MAE高达18年）
非细胞类型特异性模型显示：
- 全细胞伪bulk模型相关系数0.9（MAE 8年）
- 神经胶质细胞水平模型：自举伪bulk模型相关系数0.8 vs 简单模型0.2
2.4 时钟基因捕捉细胞类型特异性的生物学相关衰老通路
各时钟模型特征基因分析显示：
- 小胶质细胞：细胞因子生成（SLC1A3、FOXP1、MS4A6A）通路富集
- 少突胶质细胞/星形胶质细胞：突触传递负调控通路富集
- 兴奋性神经元：突触传递正调控通路富集
- FKBP5基因在所有模型中呈正相关（r=0.7），与认知功能衰老相关
2.5 独立单核RNA测序数据集验证
在Fröhlich等（2024）数据集（n=33，26-84岁）中：
- 单细胞模型：相关系数0.22-0.54，MAE 7.6-10年
- 自举伪bulk模型：相关系数0.56-0.78，MAE 7.1-15.6年
在Velmeshev等（2023）数据集（n=12，19-54岁）中表现较差：
- 单细胞模型：相关系数0.15-0.3
- 自举伪bulk模型：除抑制性神经元和OPC外无显著相关性
特征基因表达分析显示：
- 训练数据集：70%-99%基因方向一致
- Fröhlich数据集：单细胞模型40%-80%，自举模型8%-40%
- Velmeshev数据集：单细胞模型15%-40%，自举模型几乎无显著关联
2.6 神经系统疾病中的衰老加速
在精神分裂症数据集：
- 除小胶质细胞外所有模型显示显著加速衰老
- 小胶质细胞模型预测年龄相对延迟
在阿尔茨海默病数据集：
- 少突胶质细胞和小胶质细胞模型显示显著年龄加速
- 其他细胞类型趋势不显著
3 讨论
本研究构建的高分辨率人脑衰老图谱具有以下创新性：
- 开发了首个细胞类型特异性的单核转录组衰老时钟
- 揭示了小胶质细胞和星形胶质细胞在衰老中的炎症特征
- 在阿尔茨海默病和精神分裂症中检测到细胞类型特异性衰老加速
与表观遗传时钟相比，单核RNA测序具有更高的细胞分辨率。虽然单细胞模型在独立数据集表现受限，但自举伪bulk模型通过降低转录组噪声提升了稳健性。未来需优化样本制备标准，增加种族多样性。
4 实验方法
伦理声明
研究遵循赫尔辛基宣言和匈牙利布达佩斯医学研究伦理规则，经匈牙利卫生部和区域伦理委员会批准（IV/2627-1/2021/EKU）。
人脑组织采集
样本来自Semmelweis大学人脑库，31例捐赠者前额叶皮质组织（PMI 2-12小时），-80℃保存。
单核分离与测序
采用Chromium Next GEM平台进行单核RNA测序，每个样本8,500个细胞核。
数据分析
使用Cell Ranger 7.0.0比对GRCh38基因组，Seurat 4.3.0进行分析（过滤标准：1200-100,000读数，800-12,000基因，线粒体比例<5%）。
衰老时钟建模
采用ElasticNet回归（α=0.5）基于35,578个基因构建模型，进行5折交叉验证。自举伪bulk模型生成100个样本（细胞数：少突胶质细胞200，其他50-100）。
独立验证
在Fröhlich等（2024）和Velmeshev等（2023）数据集验证，采用Spearman相关性分析特征基因表达一致性。
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