1. 引言
过去几十年间，微生物组研究取得了显著进展，在科学界和公众领域均引发广泛关注。人体微生物组是由古菌、细菌、真菌和病毒等微生物群落构成的复杂生态系统，包含万亿级微生物及其产生的核酸、蛋白质、脂质、多糖和代谢物等分子。这些微生物群落与人体宿主协同进化，在维持健康方面发挥着关键作用。因此，微生物组平衡的破坏可能诱发或加剧多种疾病1-5。此外，微生物组研究的应用已超越人类健康领域，在可持续农业中发挥重要作用，土壤微生物组直接影响植物健康、作物抗性和产量。医疗保健和农业产业已开始重视微生物组分析的潜力，但获得准确洞见取决于选择合适的技术，如选择宏基因组学方法或16S/ITS/23S rRNA测序6,8。
2. 为何研究微生物组
微生物组分析具有多种应用价值，适用于人类健康、动物健康和环境生物技术等领域。通常这些行业会采用16S rRNA分型和宏基因组学来研究微生物群落及其影响。
1. 人类健康与临床研究
人体微生物组与癌症、肥胖症、神经退行性疾病等多种健康状况相关。这种关联性使得研究人员能够识别与帕金森病和炎症性肠病(IBD)等疾病相关的微生物特征，为早期诊断和个性化治疗提供依据9,12。
2. 动物健康与兽医学应用
兽医学中的微生物组研究加深了对动物疾病的理解，牲畜研究可改善动物健康以提高生产率并减少抗生素使用。将微生物组科学整合到兽医程序中，为调控动物健康提供了独特技术，特别是通过调节肠道微生物群13,14。
3. 农业科技与环境生物技术
土壤微生物组研究对于实现可持续农业至关重要，其能够增强作物活力并抵御病虫害。此外，宏基因组学有助于识别参与环境污染物降解并在生物修复中起作用的微生物种群6,15,16。
3. 微生物组分析技术
尽管微生物组研究具有巨大价值，但在临床应用中建立标准化方法和转化技术将面临广泛领域的重大挑战。以下部分详细介绍了常用的微生物组研究方法。
1. 16S rRNA分型
16S rRNA基因测序技术在微生物组分析中广泛使用，通过靶向微生物DNA的保守区域，提供微生物群落多样性和身份鉴定的宝贵信息。原核生物核糖体由大亚基(50S)和小亚基(30S)组成，30S亚基的RNA成分由16S rRNA基因编码。该基因存在于细菌和古菌中，因其结构和细胞功能活性被称为"分子钟"，可实现系统发育识别和物种分化。现代微生物组分析使用16S rRNA基因测序具有成本效益，可对样本中的细菌和古菌群落进行无需培养的调查。当研究人员需要了解细菌群落结构时，常采用此技术。其简便性和经济性支持高通量研究，从而实现对微生物多样性的初步估算。同样，ITS基因可用于揭示真菌群落，18S基因可用于真核生物物种分析。然而，16S rRNA基因测序无法描述微生物群落的活性或代谢潜力，在传统测序中具有较低的分类分辨率（但参见下文：3. 微生物组分析中的长读长测序）。在传统测序中，仅对16S基因的V3-V4可变区进行测序，可能缺乏足够的序列变异来区分物种或菌株，例如区分大肠杆菌的致病菌株与共生菌株14,17,18。
2. 宏基因组学
宏基因组学通过测序样本中所有微生物基因，克服了16S rRNA测序的限制，提供高分辨率的微生物组特征。宏基因组学捕获来自多样微生物群落的遗传物质，揭示功能基因和代谢通路，以理解微生物代谢潜力和生态系统功能。宏基因组学提供了海量信息，使其适用于涵盖微生物多样性、代谢通路和/或微生物互作等领域的综合研究，从生态学到人类健康再到工业生物技术。该技术比16S测序资源消耗更大，但其提供的功能性信息深度使该技术成为深入微生物组研究的关键。这种方法还可用于研究病毒群落，因为它不依赖特定基因。尽管宏基因组学已将微生物群组成与许多疾病相关联，但对这些关联的机制信息提供有限。为弥补这一差距，功能元组学方法如元转录组学、元蛋白质组学和代谢组学正被日益频繁地应用，以进一步加深对微生物组与健康相互作用的理解19,21。
3. 微生物组分析中的长读长测序
Oxford Nanopore Technologies等公司提供的新一代长读长测序技术，通过提供更精确和完整的微生物特征描述，极大推动了微生物组分析的发展。长读长测序优于短读长技术，因为它可以恢复全长基因，提高复杂微生物群落中的分类鉴定和功能分辨率。例如，使用长读长测序进行16S分析可测序整个可变区(V1-V9)，从而提供更高分辨率。这对需要更高分辨率的应用特别有用，如详细的分类鉴定、微生物活动功能分析以及微生物群落动态研究22-24。长读长测序在环境和农业微生物组中的应用具有多项优势，包括改进的组装质量、揭示复杂的微生物互作、增强的宏基因组组装基因组恢复能力、精确的物种和菌株级别分类以及新型物种和抗生素耐药菌的发现，支持可持续实践25-27。尽管仍存在需要高测序深度等障碍，持续的技术发展预计将进一步提升长读长测序在微生物组研究中的实用性。
4. 如何选择正确的测序技术？
测序方法的选择取决于研究目标、样本类型和所需深度。16S rRNA靶向扩增子测序适用于初始群落分析，因其能以较低成本高效代表微生物物种。要获得更深入理解，应使用宏基因组学，提供分类组成和功能潜力的高分辨率数据。然而，它不适用于特定微生物多样性或生态系统功能研究。宏基因组学在复杂微生物环境如人类肠道微生物组或土壤系统中特别有用。长读长测序适用于需要全面准确基因组数据的情况，特别是测序基因组重复区域、识别结构变异以及执行单倍型解析的全长基因组装。尽管成本更高，长读长测序因其一致性和准确性提供高分辨率的微生物组分析。测序策略的选择对微生物组研究的结果和结论有重大影响，可能促进或阻碍微生物生态学和人类健康领域的进展14,17,27。
5. 结论
微生物组研究为人类健康、动物护理、农业和环境生物技术等多个领域提供了宝贵洞见。测序方法的选择（无论是16S rRNA分型、宏基因组学还是长读长测序）取决于研究目标。16S测序适用于群落分析，宏基因组学提供更深入的功能分析，而长读长测序为复杂微生物群落提供详细的基因组数据。理解这些方法及其应用对于推动研究和实现特定行业目标至关重要。通过采用微生物组分析，研究人员可以开拓创新、健康改善和可持续发展的新机遇。随着微生物组研究的持续发展，这些技术对于揭示微生物生态系统全部潜力至关重要。
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