SMPDL3B：肌痛性脑脊髓炎中的新型生物标志物和治疗靶点
背景：
酸性鞘磷脂酶磷酸二酯酶样3B（Sphingomyelin phosphodiesterase acid-like 3B, SMPDL3B）正在成为肌痛性脑脊髓炎（Myalgic Encephalomyelitis, ME）潜在的生物标志物和治疗靶点。ME是一种复杂的多系统疾病，以免疫功能障碍、代谢紊乱和持续性疲劳为特征。本研究探讨了SMPDL3B在ME病理生理学中的作用及其临床相关性。
方法：
这项病例对照研究在两个独立队列中进行：一个加拿大队列（249名ME患者，63名对照）和一个挪威复制队列（141名ME患者）。使用ELISA和流式细胞术测量血浆和膜结合型SMPDL3B水平；通过qPCR分析_SMPDL3B_和编码磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）的_PLCDX1_基因表达；体外评估二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂——维格列汀、沙格列汀和利格列汀对膜结合型及可溶性SMPDL3B的影响。
结果：
与对照组相比，ME患者的血浆SMPDL3B水平显著升高，并且与症状严重程度相关。流式细胞术显示单核细胞表面的膜结合型SMPDL3B减少，同时_PLCDX1_表达增加，血浆中PI-PLC和SMPDL3B水平升高。这些发现表明，ME中的免疫失调可能与PI-PLC对膜结合型SMPDL3B增强切割有关。性别差异明显，女性ME患者的血浆SMPDL3B水平更高，这一效应受雌激素影响。体外实验表明，雌二醇上调SMPDL3B表达，提示其存在激素调节机制。维格列汀和沙格列汀被测试是否能够独立于其作为DPP-4抑制剂的功能，通过抑制PI-PLC来恢复膜结合型SMPDL3B并减少其可溶性形式。
结论：
SMPDL3B作为ME严重程度和免疫失调的关键生物标志物，其活性受激素和PI-PLC调节。维格列汀和沙格列汀通过抑制PI-PLC保留膜结合型SMPDL3B并减少其可溶性形式的能力，表明了一种新的治疗策略。这些发现值得开展临床试验，以评估它们缓解ME免疫功能障碍和症状负担的潜力。
背景
肌痛性脑脊髓炎（ME），也称为慢性疲劳综合征（Chronic Fatigue Syndrome, CFS），是一种病因不明的致残性多系统疾病，全球范围内影响数百万人，女性患病率较高（男女比例为4:1）。ME以持续性疲劳、运动后不适（Post-Exertional Malaise, PEM）、自主神经功能障碍、睡眠障碍、认知功能受损以及免疫功能障碍为特征。尽管其对生活质量有深远影响，但目前尚无特定的生物标志物或诊断测试可用，这反映了对其潜在病理生理学理解的局限性。环境触发因素如病毒和细菌感染或化学暴露被认为与疾病发作有关，但驱动疾病进展的机制仍不清楚。
免疫功能障碍是ME的一个标志性特征，患者经常表现出T细胞反应改变、自然杀伤（NK）细胞活性受损以及细胞因子生成失调，通常表现为促炎性细胞因子水平升高。与此同时，越来越多的证据表明代谢异常（尤其是脂质代谢异常）是该病病理的重要贡献者。能量生产、脂质信号通路和线粒体功能的紊乱与疲劳、认知功能受损及其他ME症状密切相关。
方法
研究人群
该病例对照研究利用两个独立的前瞻性队列来调查SMPDL3B在ME病理生理学中的作用。加拿大队列包括249名ME患者（208名女性，41名男性）和63名久坐健康对照（HC）（33名女性，30名男性）。HC纳入标准包括：①年满18岁；②自认为具有欧洲血统的高加索人；③报告生活方式久坐（每周中等强度运动少于两小时）；④无ME个人或家族史。对照组根据年龄和性别分布频率匹配至ME患者组。
所有参与者均在新冠疫情前招募。ME患者根据加拿大共识标准进行诊断。所有参与者均为18岁以上并自认为具有欧洲血统的高加索人。该研究获得CHU Sainte-Justine机构审查委员会批准（协议编号#4047），所有参与者提供书面知情同意书。所有程序遵循伦理指南和人体研究法规。
为了验证结果，从挪威Haukeland大学医院获取了一个由141名ME患者组成的挪威队列样本（119名女性，22名男性），这些患者均根据加拿大共识标准确诊。这些样本收集于2014年至2017年间的一项先前研究中（ClinicalTrials.gov NCT02229942, 2014–2017）。参与者按照该研究的协议提供知情同意。为解释潜在生物学因素对ME流行率、症状表现和临床结果的影响，进行了性别分层分析。
血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）的收集
经肘前静脉穿刺采集加拿大队列参与者的外周血样本，使用含EDTA的试管防止凝血。全血在215×g离心10分钟，然后将血浆分装并储存在−80°C直至进一步分析。剩余部分用平衡盐溶液稀释，铺在淋巴细胞分离介质上，在400×g离心30分钟。收集所得的PBMC环，用完全RPMI 1640培养基洗涤并在250×g离心7分钟。最终的细胞沉淀重悬于含有40%胎牛血清（FBS）、10%二甲基亚砜（DMSO）和1%抗生素-抗真菌混合液的冷冻保存溶液中，随后在液氮中储存以备进一步分析。
参与者健康状况、ME症状和疾病严重程度的评估
使用标准化问卷评估参与者的健康状况和症状严重程度。加拿大队列参与者完成36项简明健康调查表（SF-36）、多维度疲劳量表（MFI-20）和Depaul症状问卷（DSQ）。SF-36提供身体和心理健康状况的概述；MFI-20评估五个领域的疲劳情况，包括总体疲劳、体力疲劳、活动减少、动机降低和精神疲劳，总分用于确定疾病严重程度；DSQ评估症状频率并分为四个因素：神经内分泌、自主神经和免疫功能障碍、认知功能障碍、运动后不适和睡眠障碍。挪威队列中的疾病严重程度由调查医生基于标准化临床评估确定，包括疲劳量表和试验特定问卷评分。
血浆SMPDL3B和PI-PLC水平的测定
使用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Cat. ABX585223，Abbexa Ltd，英国剑桥）按照制造商说明定量血浆SMPDL3B水平。所有样本均进行双重复分析以确保准确性，并取平均值用于分析。PI-PLC水平使用商业ELISA试剂盒（Cat. MBS038525-96，MyBioSource，美国圣地亚哥）测量，同样按照制造商说明操作。
SMPDL3B、_PLCXD1_和_IL-6_基因表达的定量PCR分析
使用TaqMan探针通过定量PCR（qPCR）评估_SMPDL3B_、PLCXD1（编码PI-PLC）和_IL-6_的相对基因表达。使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）提取PBMCs中的总RNA，按照制造商说明操作。通过Nanodrop分光光度计（TM1000，Thermo Fisher Scientific）评估RNA浓度和纯度。使用1 µg总RNA和All-In-One 5× MasterMix（Cat. G592，Applied Biological Materials，加拿大里士满）合成互补DNA（cDNA）。
qPCR反应在10 µL体积内进行，使用TaqMan Universal Master Mix（Thermo Fisher Scientific）、目标特异性TaqMan检测（SMPDL3B: Hs00205522_m1，PLCXD1: Hs00895227_m1，IL-6: Hs00174131_m1，GAPDH: Hs02786624_g1）以及QuantStudio 3实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）。循环条件为50°C保持2分钟，95°C保持10分钟，随后进行40个循环的95°C保持15秒和60°C保持1分钟。基因表达使用比较Ct法（2^−ΔΔCt）计算，相对于_GAPDH_标准化。所有反应均进行双重复，包含阴性对照（无核酸酶水）以排除污染。
流式细胞术检测膜结合型SMPDL3B
解冻并清洗加拿大队列的一部分参与者（27名ME患者和9名HC）的冷冻保存PBMCs，过夜孵育于含有10% FBS和1%抗生素-抗真菌混合液的RPMI 1640培养基中，每个患者和健康对照分别使用3百万个细胞（1.5百万用于染色，1.5百万用于未染色部分）。细胞用1:25稀释的单克隆抗SMPDL3B抗体（LS-C132144，LifeSpan BioSciences Inc.，美国林伍德）染色，并使用Alexa Fluor 488标记的二抗（Cat. A11029，1:50稀释，Thermo Fisher Scientific）检测。包含同型对照以考虑非特异性结合。样品使用BD Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）分析，使用FlowJo软件（v10.10，FlowJo LLC，美国俄勒冈州阿什兰）量化平均荧光强度（MFI）。分析过程中考虑了活细胞和双峰排除，仅包括单个活细胞。使用QIFIKIT定量分析试剂盒（Cat. K007811-8，Dako，丹麦哥本哈根）进行校准。
Western blot
用Diarylpropionitrile（DPN，Tocris，英国布里斯托尔）处理Jurkat细胞，这是一种选择性雌激素受体β（ERβ）激动剂，处理时间为18小时以评估雌激素介导的SMPDL3B调节。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，通过Bio-Rad Protein Assay Dye（Cat. 5000006，Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）测定蛋白质浓度。蛋白质通过10% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜（Bio-Rad）上，并用10%牛血清白蛋白（BSA）在PBS-Tween 0.2%中封闭。膜在4°C下孵育过夜，加入SMPDL3B抗体（Proteintech，美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。第二天，使用温和剥离缓冲液（15 g/L甘氨酸、1 g/L SDS和0.01% Tween 20）剥离膜，新鲜缓冲液中孵育两次，每次10分钟，随后用1X PBS和1X TBST各洗两次。接着膜孵育过夜，加入β-actin抗体（Cat. Sc47778，1:1000稀释，Santa Cruz Biotechnology，美国德克萨斯州达拉斯），随后加入HRP标记的山羊抗兔二抗（Cat. 31462，1:5000稀释，Thermo Fisher Scientific）。使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad）可视化蛋白条带。
LPS刺激TLR4的体外实验
从四名ME患者和四名健康对照中分离PBMCs，依据膜结合型SMPDL3B水平低于健康受试者进行选择。细胞在0.4、1和2 µg/mL的脂多糖（LPS，TLR4激动剂，Cat. L7895-1MG，Sigma-Aldrich）刺激下培养4小时。刺激后，提取一部分细胞的RNA进行RT-qPCR以评估IL-6和PLCXD1表达。另一部分使用含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解，收集上清液用于ELISA法测量SMPDL3B水平。
PI-PLC药理抑制剂的体外实验
初步搜索FDA或加拿大卫生部批准的分子中没有发现合适的PI-PLC抑制剂候选物。然而，进一步探索发现维格列汀（Vildagliptin），一种此前报道在微摩尔浓度下抑制_Bacillus cereus_ PI-PLC的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂，是一个有希望的候选物。为研究这一潜力，我们使用健康个体分离的PBMCs开展了体外实验。此实验设置使我们能够直接评估维格列汀及相关DPP-4抑制剂对SMPDL3B调控的影响。选择结构相似的沙格列汀是因为其可能具备抑制PI-PLC活性的能力，而分子结构不同的利格列汀则作为阴性对照。
PBMCs用递增浓度（25、50和100 µM）的维格列汀（Cat. SML2302-50MG，Sigma-Aldrich）、沙格列汀（Cat. 23697-10，Cayman Chemical’s，美国密歇根州安娜堡）和利格列汀（Cat. SML3619-10MG，Sigma-Aldrich），全部重新溶解在DMSO（Cat. D2650-100 mL，Sigma-Aldrich）中。未经处理的细胞仅接受载体（DMSO）。PBMCs接种在12孔培养板中，每孔1.3 × 10^6个细胞。经过18小时处理期后，收获细胞和培养基用于进一步分析。为评估其对_SMPDL3B_基因表达的影响，提取处理过的PBMCs总RNA，并使用RT-qPCR定量_SMPDL3B_和_PLCXD1_基因的相对表达。此外，通过荧光标记的抗SMPDL3B抗体染色细胞，随后进行流式细胞术分析，评估其对膜结合型SMPDL3B的影响。最后，通过ELISA测量培养基（RPMI 1640）中的可溶性SMPDL3B水平。
结果
研究参与者的临床和人口统计数据
加拿大和挪威队列的临床和人口统计特征总结在表1中。研究设计如图1所示。两个队列中的性别分布反映了ME在女性中更高的患病率，加拿大队列中女性占83%，挪威队列中女性占84%。鉴于性别是影响免疫反应和疾病易感性的关键生物学变量，其在ME中的考虑至关重要。加拿大队列中，ME患者与HC之间在BMI或年龄方面没有显著差异。同样，加拿大和挪威ME队列之间的病程也没有显著差异。然而，加拿大队列比挪威队列显著年长（p < 0.0001，补充图S1）。加拿大ME队列（n = 249）、加拿大健康对照组（HC，n = 63）和挪威ME队列（n = 141）中几种合并症的患病率详见补充表S2。在加拿大ME队列中，最常见的合并症是过敏（38.2%）、纤维肌痛（35.7%）和焦虑（31.3%），其次是抑郁（30.9%）。甲状腺功能减退症占比为2.4%。加拿大的HC组相较于ME组大多数合并症的患病率较低，其中过敏最常见（27.0%），其次是焦虑（12.7%）和抑郁（11.1%）。HC组中未见纤维肌痛病例。在挪威ME队列中，过敏也非常普遍（39.7%），其次为其他合并症（18.4%）、焦虑（9.9%）、抑郁（8.5%）、甲状腺功能减退症（5.7%）和纤维肌痛（7.8%）。
图1 实验研究设计示意图
讨论
ME是一种复杂疾病，其特征为慢性疲劳、PEM、自主神经功能障碍、睡眠障碍、认知障碍和广泛性疼痛。其病理生理学仍知之甚少，诊断依赖于临床评估，缺乏客观生物标志物。最近的研究表明，免疫失调和慢性炎症在疾病进展中起关键作用。血浆SMPDL3B水平升高与疾病严重程度和较差的健康相关问卷（SF-36、MFI-20、DSQ）评分相关，强化了其临床相关性。这种关联在加拿大和挪威队列中一致，支持其稳健性和普适性。
鉴于免疫扰动在ME中的既定作用，我们的研究结果表明膜结合型SMPDL3B可能调节TLR4信号传导，并通过影响这一炎症途径导致症状严重性。这一机制与先前证据一致，即SMPDL3B通过改变膜流动性调节巨噬细胞和树突状细胞中的TLR4信号传导，从而影响免疫反应。与此一致，我们证明了当膜结合型SMPDL3B水平降低时，ME患者的PBMCs在TLR4激活后表现出更强的细胞因子反应，例如IL-6，进一步加强了其在ME相关慢性炎症中的作用。针对TLR4的治疗，如低剂量纳曲酮和锂，已显示出通过路径抑制缓解症状的前景。
此外，膜锚定型SMPDL3B的丢失还可能损害TLR3信号传导，从而限制Ampligen在ME患者中的疗效。鉴于TLR3在抗病毒免疫和免疫稳态中的作用，它代表了ME的另一个潜在治疗靶点。Rintatolimod（Ampligen），一种选择性TLR3激动剂，已在该背景下进行了研究，III期试验显示响应率因病程长短而异。然而，我们的研究并未直接评估这种关系，需要进一步研究以确定SMPDL3B水平是否影响治疗响应。
SMPDL3B还是一种脂质修饰酶，催化鞘磷脂转化为神经酰胺，这对细胞膜和信号传导至关重要。ME患者膜锚定型SMPDL3B的减少可以解释最初Naviaux小组报告的血浆神经酰胺水平较低的现象，包括观察到的性别差异，因为女性的神经酰胺减少比男性更显著，导致血浆鞘磷脂水平较高。这种神经酰胺代谢的性别特异性模式与我们的发现一致，即患有ME的女性比男性表现出更高的循环SMPDL3B水平，表明较少的膜结合型，进一步支持SMPDL3B在性别相关的鞘脂代谢变化中的作用。Muilwijk等人证明鞘脂浓度在男性和女性之间随年龄而有差异，女性的水平随时间增加得更快。虽然年轻女性往往比同龄男性具有较低的鞘脂浓度，但这些水平超过老年男性。同样，关于SMPDL3B在前列腺癌和卵巢癌中作用的研究表明，性别特异性调节机制，包括与雌激素受体的相互作用。雌激素已被证明可以调节鞘脂途径，我们的体外实验表明雌二醇调节SMPDL3B水平。因此，我们的发现与已知的鞘脂代谢和ME病理生理学中的性别相关差异一致。
我们研究的一个关键机制见解是SMPDL3B在其可溶性和膜结合形式之间的分布改变。ME患者表现出单核细胞和淋巴细胞上的膜结合型SMPDL3B减少，特别是在可溶性形式循环水平较高的患者中。这种减少与磷脂酶C（PI-PLC，由_PLCDX1_基因编码）表达增加相关，后者已知能切割膜结合型GPI蛋白如SMPDL3B，表明增强的PI-PLC活性驱动SMPDL3B脱落，导致可溶性SMPDL3B水平升高，可能加剧炎症。我们首次提供了药理抑制PI-PLC使用维格列汀和沙格列汀在免疫细胞中恢复膜结合型SMPDL3B的证据。值得注意的是，我们选择这些DPP-4抑制剂并非基于其对DPP-4的酶抑制作用，而是基于维格列汀在微摩尔浓度下抑制_Bacillus cereus_ PI-PLC的能力。通过结构相似性，我们将这一概念扩展到沙格列汀，并确认其在抑制PI-PLC和保留/恢复膜结合型SMPDL3B方面的功效，而作为阴性对照的利格列汀证实了这一效果不是由DPP-4抑制介导的。由于对_Bacillus cereus_ PI-PLC的抑制是在微摩尔浓度下实现的，改进的药物配方，包括透皮方法，可能允许更低、更有针对性的剂量，具有更好的生物利用度。如果在随机对照试验中得到验证，PI-PLC抑制可能代表ME的一种新颖免疫调节策略，提供一种恢复免疫稳态的靶向方法。尽管其他调控机制，如转录控制、翻译后修饰或其他蛋白酶的脱落，也可能影响膜结合型和可溶性SMPDL3B蛋白水平，但我们的研究结果强调了PI-PLC介导的切割是ME中免疫失调耗竭膜结合型SMPDL3B的关键驱动因素。
我们的研究有几个优势，包括使用两个独立队列和结合临床、分子和机制分析的多方面方法。这使我们能够揭示SMPDL3B分布的改变及其在ME免疫失调中潜在作用。然而，我们承认研究的一个局限性是我们队列中的性别不平衡，显著的女性主导符合ME的既定流行病学。这限制了本研究中强有力的性别特异性分析。尽管我们的探索性分析揭示了性别间SMPDL3B水平的潜在差异，例如患有ME的女性单核细胞上更高水平的膜结合型SMPDL3B和男性ME患者中较低的SMPDL3B基因表达，但由于男性参与者的代表性不足和由此产生的统计功效不足，这些发现应谨慎解读。这与更广泛的研究一致，表明ME在患病率、症状表现和潜在生物学机制（包括激素影响）方面存在显著的性别差异。未来具有均衡性别比例或专门性别分层设计的研究对于明确阐明SMPDL3B在ME病理生理学中的潜在性别特异性角色，并确定观察到的趋势是否在足够有力的队列中成立，至关重要。
值得注意的是，我们确定维格列汀和沙格列汀是通过抑制PI-PLC恢复膜结合型SMPDL3B的有前途的治疗方法，这是一个新发现，可能导致新的治疗策略。然而，有一些重要的局限性需要注意。横断面设计阻止了因果关系的结论，纵向研究需要确定SMPDL3B耗竭是否促成疾病进展或由慢性炎症引起。此外，尽管我们对PBMCs的关注提供了对免疫失调的洞察，但它可能无法捕捉到其他免疫细胞类型或组织中SMPDL3B的调控。鉴于SMPDL3B的更广泛作用，其耗竭也可能影响其他器官系统，需要进一步研究。最后，我们的队列主要是高加索人，这可能限制了我们发现的普适性，突显了未来研究中更多样化队列的需求。
结论
我们的研究结果表明，SMPDL3B可能在ME病理生理学中发挥核心作用，可能促成慢性炎症和疾病严重程度。然而，需要进一步研究以确定这些关联是否具有因果关系。这些发现表明，SMPDL3B既可以作为疾病严重程度的生物标志物，也可以作为治疗干预的靶点。通过解决当前理解中的空白并优化针对SMPDL3B的治疗策略，我们可以朝着开发更有效、个性化的ME治疗方法迈进。
(全文结束)
