摘要
硒是人类和动物健康必需的微量元素，其膳食缺乏会导致代谢紊乱。硒富集酵母可作为人体硒补充替代方案。本研究旨在评估传统酵母酿酒酵母ATCC 7090与非常规酵母粘红酵母CCY 20-2-26的硒生物积累、转化及纳米颗粒(SeNPs)生成能力。通过RP-HPLC-ICP-MS和UHPLC-ESI-Orbitrap-MS技术鉴定硒化合物并表征细胞内纳米颗粒。在培养基硒浓度为10 mg Se4+/L时，酿酒酵母细胞含硒量达1559 μg Se4+/g，显著高于粘红酵母的1202 μg Se4+/g。酿酒酵母细胞中检出多种已知硒化合物，而粘红酵母仅发现两种。硒纳米颗粒尺寸分布范围分别为：酿酒酵母60-180 nm，粘红酵母40-260 nm。尽管两种酵母纳米颗粒尺寸均处于治疗范围(≤200 nm)，但粘红酵母颗粒均匀性较差。酿酒酵母生物质中硒纳米颗粒含量为13 µg/g，粘红酵母为9 µg/g。研究凸显了两种酵母在生产富硒膳食补充剂和纳米材料方面的生物技术潜力。
引言
硒是人类、动物及微生物必需的微量元素，其缺乏已成为欧洲、亚洲和非洲部分地区的重要健康问题。硒通过合成硒蛋白发挥抗氧化功能并调节甲状腺激素代谢。有机硒形式如硒甲硫氨酸(SeMet)和硒半胱氨酸(SeCys)在生物体内具有重要功能。酵母特别是酿酒酵母作为模式生物，在生物技术领域具有基因组特征明确、复制周期短、耐受极端pH和渗透压等优势。近年来非常规酵母粘红酵母在代谢硒方面的应用潜力逐渐受到关注。本研究首次系统比较了酿酒酵母ATCC 7090与粘红酵母CCY 20-2-26的硒积累与形态分布特性，采用RP-HPLC-ICP-MS等技术表征生物质中硒的形态分布。
材料与方法
材料与试剂
实验使用亚硒酸钠(Na₂SeO₃)、硝酸(67-69%)、碘乙酰胺(IAM)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris缓冲液组分、蛋白酶、溶解酶、二硫苏糖醇(DTT)等试剂。培养基YPD购自BLT(波兰)，Milli-Q超纯水系统(德国默克)，认证参考物质SELM-1购自加拿大国家研究理事会。
酵母菌株与培养条件
实验使用美国模式培养物集存库(ATCC)的酿酒酵母ATCC 7090和斯洛伐克酵母菌种保藏中心(CCY)的粘红酵母CCY 20-2-26。YPD液体培养基(2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸粉，pH 4.8)用于制备酵母接种物。实验组培养基补充10 mg Se4+/L的亚硒酸钠溶液，经121℃高压灭菌15分钟后接种，28℃、150 rpm振荡培养24小时。
总硒含量测定
取0.2g酵母生物质样品，经浓硝酸(2.5mL)预孵育过夜后，添加1mL双氧水，在DigiPrep系统按程序消解(65℃，240分钟)。消解液稀释至4% HNO₃浓度后，采用ICP-MS在优化仪器条件下测定总硒含量。通过四级浓度标准加入法确定定量硒含量，每个样品三重测定并包含空白和认证参考物质SELM-1。
硒化合物形态分析
硒半胱氨酸(SeCys)和硒甲硫氨酸(SeMet)测定采用反相HPLC-ICP-MS联用技术。样品经三次水超声提取(1h)后离心，沉淀重悬于0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)，先后加入DTT和IAM进行还原烷基化反应。添加蛋白酶溶液37℃孵育过夜后，经2kDa滤膜过滤，采用Agilent 1200 HPLC系统联用7700 ICP-MS分析。色谱条件：Acclaim C8柱(4.6×250mm)，流动相A为0.2%甲酸，B为0.2%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱(流速0.9mL/min)。
硒纳米颗粒分析
通过四步酶解提取法分析硒纳米颗粒：水提取(1h超声)、溶解酶消化(4%溶解酶，17h)、蛋白酶消化(4mg/L蛋白酶，17h)、SDS提取(4% SDS，1h)。采用Agilent 7900 ICP-MS检测，结合单纳米颗粒应用模块分析尺寸分布。商用150nm硒纳米颗粒悬液作为验证标准。
结果
酵母硒积累
在未添加硒的对照组中，酿酒酵母和粘红酵母生物质含硒量分别为9.2和7.6 µg Se4+/g。添加10mg Se4+/L后，酿酒酵母积累量达1559 µg Se4+/g，粘红酵母为1202 µg Se4+/g(p<0.05)。结果证实酿酒酵母具有显著更强的硒积累能力。
硒氨基酸生物合成
RP-HPLC-ICP-MS分析显示，酿酒酵母以无机硒为主(峰强度>1.2×10⁵ cps)，粘红酵母则呈现更多硒化合物峰(10-20 min)。酿酒酵母SeMet含量为28 µg/g，SeCys为9 µg/g，均显著高于粘红酵母(9.5 µg/g和4.5 µg/g)。
硒纳米颗粒表征
添加硒后，酿酒酵母细胞沉淀部分硒含量增至680 µg Se/g，粘红酵母为202.5 µg Se/g。单粒子ICP-MS分析显示，酿酒酵母形成更均匀的纳米颗粒(平均100.2 nm，SD=34.02)，而粘红酵母尺寸分布更广(平均121.1 nm，SD=61.56)。酿酒酵母离子态硒(54 µg Se/g)和纳米颗粒(13.0 µg Se/g)含量均高于粘红酵母(29 µg Se/g和9.0 µg Se/g)。
讨论
酿酒酵母(1559 µg Se/g)的硒积累量显著高于粘红酵母(1202 µg Se/g)，与先前研究中酿酒酵母ATCC MYA-2200积累3000 µg Se/g的结果相印证。硒甲硫氨酸含量在两种酵母中存在显著差异(28 vs 9.5 µg/g)，可能与酿酒酵母更强的硒代蛋氨酸合成能力有关。通过UHPLC-ESI-Orbitrap-MS鉴定出多种新型硒化合物，如谷胱甘肽-2,3-二羟基丙酰硒半胱氨酸和甲硫基硒谷胱甘肽，这些发现拓展了硒代谢的认知。酿酒酵母形成更均匀的纳米颗粒(60-180 nm)可能与其细胞壁结构和硒转化能力有关，而粘红酵母较大的尺寸波动(40-260 nm)暗示其纳米颗粒形成机制存在差异。
结论
研究证实酿酒酵母ATCC 7090和粘红酵母CCY 20-2-26均能积累并转化硒为多种化学形态，其中酿酒酵母表现出更强的积累能力(1559 µg Se/g)和更均匀的纳米颗粒形态(189.3 nm)。通过形态分析发现谷胱甘肽衍生物等新型硒化合物，为评估其生物利用度提供依据。两种酵母在硒纳米颗粒形成效率和尺寸分布上的差异提示其具有不同的代谢适应机制。这些发现为开发新型富硒膳食补充剂和抗氧化疾病治疗提供了理论基础。
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