摘要
背景
中风是全球主要健康问题，其中脑梗死占病例的62%。尽管急性期治疗已取得进展，但运动功能障碍等功能性损伤仍然普遍存在。本研究探讨了人源诱导多能干细胞(iPSC)衍生的大脑皮层神经元在雌性缺血性中风小鼠模型中促进神经再生和运动功能恢复的潜力。
方法
使用玫瑰红光血栓形成法诱导脑梗死，随后将iPSC衍生的皮层神经元移植到梗死区域附近。通过脚故障测试和圆筒测试评估行为恢复。进行组织学分析以评估移植物整合和神经突延伸。
结果
脚故障测试显示，与对照组相比，移植组的精细运动功能有显著改善。然而，在评估粗大运动功能的圆筒测试中未观察到恢复。观察到移植细胞的神经突沿皮质脊髓束延伸，在68%的移植小鼠中轴突投射到达脊髓。此外，神经突生长延伸至丘脑、上丘和前庭核，表明整合到多个神经回路中。组织学分析显示，16.4%和47.3%的移植细胞分别表达CTIP2和SATB2，表明存在深部和浅层皮层神经元。
结论
本研究表明，iPSC衍生的皮层神经元沿皮质脊髓束延伸轴突，并能在中风后促进精细运动功能恢复。然而，仍需进一步研究来验证功能性连接和长期安全性。这些发现为开发针对中风患者的细胞疗法提供了有希望的途径。
背景
中风是全球重大健康挑战，世界卒中组织2022年全球卒中事实报告指出，每年有1220万新发病例和650万死亡病例。脑梗死占所有中风的62%，每年影响约760万人。常见后遗症包括精细运动障碍、构音障碍和瘫痪，严重影响日常生活。尽管急性期治疗的进步降低了脑梗死相关死亡率，但后遗症和功能障碍的患病率仍然很高。因此，迫切需要促进脑梗死后功能恢复和神经再生的治疗方法。
细胞移植疗法已成为治疗脑梗死的有前景方法，有可能促进神经回路重建和功能恢复。已研究了包括间充质干细胞和神经干细胞在内的多种细胞类型用于中风治疗的潜力。然而，长期移植物存活率低、功能性整合有限以及行为恢复结果不一致等挑战仍然存在。虽然一些研究表明移植的神经元可以延伸轴突并建立突触连接，但这些连接在多大程度上能转化为有意义的运动恢复仍不清楚。
多能干细胞技术的最新进展促进了脑类器官的创建——这种三维脑模型组织密切模拟人类大脑复杂的神经回路和细胞组织。这些类器官作为移植皮层神经元的潜在来源很有前景，已被证明在移植后能够存活并延伸神经突。几项研究报道了成功的细胞植入和神经突延伸，但这些移植是否能有效恢复脑损伤后的运动功能仍不清楚。本研究将人源诱导多能干细胞(iPSC)衍生的脑类器官移植到雌性小鼠脑梗死模型中，以评估神经行为和移植物的神经突延伸情况。
方法
iPSCs的维持
人源iPSC系(S17)是从龙沙公司(Lonza，瑞士巴塞尔)购买的外周血单核细胞使用仙台病毒载体建立的。iPSCs在Matrixome(iMatrix，日本大阪)上使用Ajinomoto(日本东京)的StemFit培养基培养。传代时，使用含250 µM EDTA的0.5× TrypLE Select(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher Scientific公司)将iPSCs解离成单细胞，8分钟后以每孔1-1.5×10⁴个细胞的密度重新接种到6孔板中，培养基为添加了10 µM Y-27,632(FUJIFILM Wako Pure Chemicals，日本大阪)的StemFit培养基。每7天传代一次，在传代后的第2、4、5和6天更换培养基。
人iPSCs的分化
人iPSC衍生的类器官使用Kitahara等人描述的改良SFEBq技术生成。在开始分化前一天，使用不含溶液C但添加了5 µM SB431542(转化生长因子β抑制剂，英国布里斯托TOCRIS Bioscience公司)的StemFit培养基处理iPSCs。为解离，使用含250 µM EDTA的0.5× TrypLE Select处理iPSCs 10分钟以优化无饲养层培养条件。
将解离的细胞以每孔9,000个细胞的密度接种到低细胞粘附V底96孔板(Sumitomo Bakelite，日本东京)中，分化培养基含50 µM Y-27,632。分化培养基包含DMEM/F-12 GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)并补充20%(v/v)KnockOut血清替代物(KSR)、5 µM SB431542和3 µM IWR1e(Wnt抑制剂，Calbiochem公司)。每三天更换一半培养基直至第15天。SFEBq培养从第0天开始。
第18天，将细胞聚集体转移到90毫米无涂层培养皿(Sumitomo Bakelite，日本东京)中，使用补充了1%(v/v)N-2补充剂(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、1%(v/v)化学成分确定的脂质浓缩物(CDLC；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、0.25 µg/ml两性霉素B(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的DMEM/F-12 GlutaMAX进行培养。类器官在50 rpm的轨道摇床上培养，环境为20% O₂和5% CO₂，以避免需要40% O₂。从第18天到第38天，每3或4天完全更换一次培养基。
第38天，使用含250 µM EDTA的0.5× TrypLE Select处理类器官10分钟进行解离，随后以每孔30,000个细胞的密度重新接种到低细胞粘附V底96孔板中以形成神经球。新制备的神经球未经冷冻直接用于移植。
流式细胞术
第41天进行流式细胞术分析。解离的细胞使用LIVE/DEAD®可固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和FITC偶联的抗TRA-2-49抗体(Merck公司)染色，随后用4%多聚甲醛(PFA)固定30分钟。固定后，细胞使用Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences公司)透化30分钟，用抗体进行胞内染色，并用Perm/Wash缓冲液冲洗。使用的主要抗体包括：PAX6(Alexa647偶联PAX6，BD Biosciences，562249)、KI67(Alexa488偶联KI67，BD Biosciences，561165)、SOX1(PerCP-Cy5.5偶联SOX1，BD Biosciences，561549)、OCT4(Alexa647偶联OCT4，BD Biosciences，560329)、CTIP2(FITC偶联，Abcam，ab123449)、β-TUBIII(Alexa647偶联TUJ1，BD Biosciences，560394)。使用FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞)分析染色样品。
动物
所有动物实验均按照京都大学动物实验指南和实验室动物护理和使用指南(华盛顿特区国家研究委员会)进行。本研究使用12周龄雌性SCID小鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl，Clea Japan, Inc.，日本东京)。选择雌性小鼠进行主要研究，因为它们在脑梗死诱导后比雄性小鼠存活率更高。小鼠饲养在12小时光照/黑暗循环条件下，可自由获取食物和水。
小鼠缺血性中风模型的创建
使用玫瑰红光血栓形成法创建缺血性中风模型。使用盐酸美托咪啶(0.75 mg/kg)、咪达唑仑(4 mg/kg)和布托啡诺(5 mg/kg)的混合物腹腔注射麻醉小鼠，并在颅骨上做皮肤切口以暴露脑梗死诱导部位。以10 µL/g的剂量腹腔注射玫瑰红。给药后10分钟，使用LED照明设备(CL6000 LED，Zeiss，德国奥伯科亨)照射颅骨10分钟。照射区域涵盖喙侧和尾侧前肢运动皮层，从bregma后方2.0 mm到前方4.0 mm，从中线向外侧0.5 mm到3.5 mm。MRI检查未观察到脑梗死的动物被排除。
iPSC衍生神经球的移植
中风诱导一周后，使用相同的三麻醉混合物再次麻醉小鼠。准备含1.5×10⁵个细胞/µL的神经球用于移植。在bregma外侧2 mm、前方1 mm处进行直径约2 mm的颅骨切除术。将移植注射器插入大脑2 mm深，然后回撤1 mm，以0.1 µL/s的速率递送1 µL神经球。注射器停留1分钟后拔出。47只动物被分配到移植组并接受细胞移植，24只被分配到对照组并注射用于细胞移植的相同培养基。未进行随机化；然而，为最小化分配偏差，由相同操作者交替进行细胞给药组和对照组的手术。
行为分析
在脑梗死前和梗死后每两周进行两次行为测试，以评估运动功能恢复。所有行为分析均由对实验分组不知情的观察者进行。
脚故障测试
将小鼠放置在11 mm × 11 mm的金属丝网网格上。记录小鼠在3分钟行走过程中前肢穿过网格的次数作为错误次数。故障率计算为故障步数除以总步数。使用公式评估左右肢体之间的不对称性：(故障步数)/(总步数)，使用左右两侧之间的差异确定不对称分数。
圆筒测试
将小鼠放置在直径15 cm、高28 cm的透明圆筒中。记录从初始位置(双爪着地)站立时首先接触圆筒壁的爪子。测试持续10分钟或完成20次试验。不对称指数计算为(右侧爪接触次数)/(右侧爪接触次数 + 左侧爪接触次数)。
磁共振成像(MRI)
脑梗死诱导后7天内对小鼠进行颅内MRI检查。使用与中风模型创建相同的三麻醉混合物混合物麻醉小鼠。使用0.5特斯拉MRI扫描仪(Bruker BioSpin GmbH，德国赖因施泰滕)获取T2加权MRI图像(TR = 2000 ms, TE = 55 ms, 层厚 = 1 mm)。
安乐死和灌注固定
在观察期间变得衰弱的动物被安乐死并解剖。未发现动物因移植物影响而死亡。健康动物观察12周。77只动物中有71只纳入最终分析。观察期结束后，小鼠用戊巴比妥(300 mg/kg)安乐死，并用4%多聚甲醛进行心脏灌注。大脑在4%多聚甲醛中后固定24小时，然后转移到30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。使用冷冻切片机将脑切片切成40 μm厚，储存在防冻溶液中，置于-30°C直至进一步处理。
免疫染色
对于体外分析，脑类器官或神经球冷冻后使用冷冻切片机切成10 μm厚。荧光免疫染色操作如下：脑切片在Target Retrieval Solution(pH 6)(Agilent公司)中75°C孵育15分钟以促进抗原修复。使用的主要抗体及稀释比例如下：CTIP2(Abcam，ab18465，1:500)、FOXG1(TAKARA，M227，1:500)、KU80(Abcam，ab80592，1:500)、人核抗原(Merck，MAB1281，1:500)、SATB2(Abcam，ab51502，1:200)和SOX1(R&D，AF3369，1:200)。次日，切片与稀释比为1:400的二抗孵育，然后封片。对于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)染色，切片用0.3%过氧化氢(H₂O₂)处理15分钟，并与人NCAM(Santa Cruz，sc-106)一抗在1:1000稀释度下过夜孵育。使用1:1000稀释的生物素偶联二抗，随后应用A和B溶液。DAB反应浓度为10 mg/ml。反应后，切片用苏木精复染并封片。
图像分析
对于移植物体积测量，使用ImageJ软件测量六分之一切片中的DAB染色区域。通过将测量面积乘以切片厚度计算体积。对于细胞计数，使用共聚焦显微镜(CQ1，YOKOGAWA，日本东京)捕获图像，并使用Cell Path Finder软件进行分析。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州拉霍亚)进行。数据以平均值±标准差(S.D.)表示。未进行先验功效分析。移植组选择更大的样本量以确保计划进行的组织学和行为数据相关分析有足够的统计功效。根据先前研究，对照组的样本量被认为足以检测主要行为终点的差异。本工作已按照ARRIVE 2.0指南报告。
结果
通过类器官诱导大脑皮层神经元
使用基于SFEBq的方法从iPSCs生成脑类器官。第35天进行的免疫染色显示类器官中存在玫瑰花结样结构，表明存在神经祖细胞，这由FOXG1、SOX1和PAX6的表达所证实。这些结构周围的细胞表达CTIP2(皮层深部神经元的标志物)，而SATB2阳性细胞(指示皮层浅层神经元)缺失。选择仅含玫瑰花结样结构的类器官，在第38天解离并重新聚集形成神经球。此程序促进了皮层神经元同质群体的产生。第41天的流式细胞术分析显示，60.6±10.2%的细胞表达增殖标志物KI67，37.5±12.2%的细胞对PAX6、SOX1和KI67三重阳性，将它们鉴定为皮层神经元祖细胞。此外，31.2±3.9%的细胞对神经元标志物β-TubIII和CTIP2双阳性，对应皮层深部神经元。未检测到OCT4或Tra-2-49阳性细胞。第42天的免疫染色确认了神经球的均匀结构。
中风模型的建立和细胞移植
使用玫瑰红光血栓形成法在12周龄雌性小鼠上诱导脑梗死(第-7天)。照射区域范围为右侧半球从bregma后方2 mm到前方4 mm，涵盖尾侧和喙侧前肢区域。梗死后一周，梗死区域在MRI T2加权图像上显示为高信号，与照射区域相对应。梗死从脑表面延伸约1.5 mm，表明大脑皮层所有层均受影响。根据MRI图像计算的平均梗死体积为22.1±11.4 mm³(n=71)。梗死后4周的苏木精-伊红(H&E)染色切片显示梗死部位皮层萎缩和瘢痕组织形成。第42天的神经球(含1.5×10⁵个细胞)在梗死后7天(第0天)使用立体定位装置移植。坐标为bregma外侧2 mm、前方1 mm、从脑表面腹侧1 mm。
细胞移植改善中风后精细运动功能
脚故障测试用于评估精细运动功能，而圆筒测试在12周期间评估粗大运动功能。在脚故障测试中，脑梗死后，梗死对侧的故障率增加，左右两侧成功率之间的差异变得明显。细胞移植组(n=47)与对照组(n=24)相比表现出运动功能的逐渐改善，在12周时观察到显著改善。在圆筒测试中，两组小鼠在脑梗死后也表现出功能障碍。然而，在12周的随访期间，移植组和对照组之间未观察到显著的行为改善或差异。
移植物在宿主大脑中存活并成熟
移植后12周的H&E染色证实移植细胞在移植部位成功植入。在12周终点时，未观察到任何移植动物形成肿瘤或畸胎瘤。移植物体积测量为13.5±8.0 mm³(n=47)。免疫组织化学分析显示，用人类核标志物KU80染色的人源细胞数量为7.6±4.7×10⁷。在人源细胞中，16.4±15.2%表达CTIP2，47.3±27.2%表达SATB2。此外，22.2±15.8%的细胞对早期神经分化标志物SOX1呈阳性，而6.9±5.8%表达增殖标志物KI67。
移植神经元沿皮质脊髓束延伸长距离轴突
使用人特异性神经细胞粘附分子(hNCAM)染色评估来自移植物的神经突延伸。在接受细胞移植的动物中，89%表现出沿皮质脊髓束(CST)的轴突延伸，在68%的病例中，这种延伸到达脊髓。除CST外，在89%、83%和74%的移植动物中分别观察到向同侧丘脑、上丘和内侧前庭核小细胞部分(MVePC)的神经突延伸。值得注意的是，仅观察到少量移植物衍生纤维进入红核。在确认神经突延伸后，我们评估了神经突生长与行为结果之间的相关性。在大脑脚中hNCAM+纤维面积比(hNCAM+面积除以总面积)与脚故障测试中行为改善率之间鉴定出显著的正相关。值得注意的是，在移植物中CTIP2阳性细胞数量与大脑脚中hNCAM+纤维面积比之间也观察到正相关。另一方面，在锥体交叉水平的延髓中hNCAM+纤维面积比与行为改善之间未确认正相关。
讨论
脑梗死的细胞移植疗法已得到广泛研究，几项临床试验评估了其潜在疗效。然而，相对较少的研究专门调查了移植细胞重建神经回路的能力。在本研究中，我们将人iPSC衍生的大脑皮层神经元移植到雌性小鼠缺血性中风模型中，并观察到神经突沿皮质脊髓束延伸。此外，接受移植的动物在脚故障测试中表现出精细运动功能的显著改善。组织学分析显示，功能恢复与移植物的神经突生长和CTIP2阳性神经元的存在相关，表明移植的神经元有助于CST重组。
本研究的一个关键发现是移植后神经元的成熟。最初，60.6±10.2%的供体细胞Ki67阳性，表明活跃增殖，而移植后分析显示增殖细胞显著减少(6.9±5.8%)。CTIP2阳性细胞的比例从移植前的31.2±3.9%下降到移植后的16.4±15.2%。值得注意的是，虽然供体群体中不含SATB2阳性细胞，但47.3±27.2%的移植细胞在移植后为SATB2阳性。这些发现与正常大脑发育一致，在正常大脑发育中，CTIP2阳性深部神经元首先生成，随后是SATB2阳性浅层神经元。虽然CTIP2阳性神经元通常投射到基底神经节和脊髓等皮层下区域，但SATB2阳性神经元通过胼胝体投射形成皮层-皮层连接。因此，CTIP2阳性神经元的存活对CST重建至关重要。我们的发现表明，尽管终末期CTIP2阳性神经元对CST重组至关重要，但它们在移植后的存活仍然是一个挑战。我们承认仅基于CTIP2表达将这些细胞鉴定为真正的皮质脊髓运动神经元是一个局限性。未来研究应纳入更广泛的分子标志物面板和生理评估，以确认其精确的亚型身份。同时，增殖祖细胞的存在存在致瘤风险，需要优化分化策略以在移植中平衡安全性和有效性。尽管在我们研究的12周期间未观察到肿瘤，但长期致瘤性研究至关重要。未来的治疗应用可能需要更严格地纯化终末期神经元，例如通过荧光激活细胞分选，以减轻此风险。
本研究的另一个关键发现是脚故障测试显示的精细运动功能的显著改善。尽管取得了这些进展，但在圆筒测试中未观察到粗大运动功能的显著恢复。这种差异凸显了将临床前发现转化为临床应用的关键挑战。脚故障测试评估熟练的肢体放置，可能无法完全代表人类中风患者中看到的广泛运动障碍，如步态受损或姿势控制受损。因此，应谨慎解释我们发现的临床意义。从神经解剖学角度看，这种测试特定的恢复可能由先前报告解释，表明啮齿动物中风模型中的自发恢复主要依赖于代偿通路而非真正的皮质脊髓修复，并且皮层通路在自发中风后恢复中作用有限。我们研究中观察到的有限行为恢复可能是由于对红核脊髓束和网状脊髓束等对粗大运动功能恢复至关重要的锥体外系运动通路参与不足。虽然观察到沿CST的显著神经突延伸，但只有少量纤维投射到红核，表明红核脊髓回路参与最小。未来研究不仅应调查增强与这些替代运动通路连接的策略，还应纳入更广泛的行为测试，以模拟人类运动功能的不同方面，从而最大化功能恢复。
有趣的是，我们还观察到向对侧大脑皮层、上丘和丘脑的神经突延伸，这与正常解剖投射一致。这些发现表明移植的神经元响应宿主脑信号以重建多个神经回路。然而，这些新形成的连接是否有助于功能恢复仍不清楚。关键的是，我们的研究仅提供相关数据，缺乏移植神经元与宿主回路之间功能性突触整合的直接证据。未来使用跨突触追踪、光遗传学和体内电生理学的调查将有必要阐明其功能影响并确认突触功效。此外，虽然观察到的投射主要遵循预期的解剖通路，但不能排除异常或适应不良连接的可能性。不适当的连接可能会干扰现有回路或导致意外副作用。因此，对于该方法的临床转化，长期评估功能结果和潜在不良影响至关重要。
虽然我们的研究突显了iPSC衍生神经元用于中风恢复的潜力，但必须考虑几个局限性。12周的观察期可能不足以充分捕捉神经元整合和功能成熟。此外，基于性别的中风病理和恢复差异可能影响了结果，因为先前的研究主要使用雄性啮齿动物。我们的研究仅使用雌性小鼠，因为在此模型中术后存活率更高。然而，鉴于性别对中风结果和神经可塑性的公认影响，这种对单一性别的关注限制了我们发现的普遍性。未来研究必须包括两性，以确保该治疗策略的更广泛应用和可转化性。此外，个体间神经突延伸模式的变异性表明移植结果可能受尚未完全理解的移植物-宿主相互作用的影响。
结论
总之，我们的发现表明人iPSC衍生的皮层神经元可以整合到受影响的脑区域，沿皮质脊髓束延伸轴突，并有助于运动恢复。然而，需要进一步研究以优化移植方案，增强功能性整合，并评估长期安全性。解决这些挑战对于建立神经元移植作为中风恢复的可行治疗策略至关重要。
数据可用性
本研究未生成或分析任何数据集。
缩略语
iPSC：诱导多能干细胞
KSR：KnockOut血清替代物
CDLC：化学成分确定的脂质浓缩物
PFA：多聚甲醛
MRI：磁共振成像
DAB：3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐
H&E：苏木精和伊红
hNCAM：人特异性神经细胞粘附分子
MVePC：内侧前庭核小细胞部分
致谢
感谢Kelvin Hui博士对本手稿的批判性阅读。我们还要感谢Tomoka Ashida女士、Rika Takaichi女士、Kaori Fukushima女士、Seiya Baba先生和Aya Iwata女士的技术支持。
基金
本研究得到日本医疗研究开发机构(AMED)资助(JP25bm1223005 to J.T.)。
作者信息
作者和所属机构
- 日本京都大学iPS细胞研究所临床应用部，京都，日本
山下 北斗、菊池 哲弘、小高 祐作、土居 大辅、池田 恵美、高桥 淳
- 日本京都大学研究生院医学研究科神经外科，京都，日本
山下 北斗
- RACTHERA有限公司神户研究中心，兵库，日本
小高 祐作、池田 恵美
贡献
HY：构思与设计、数据收集与组装、数据分析与解释、手稿撰写；TK：数据分析与解释、手稿撰写；YK：数据收集；DD：数据收集；MI：数据收集；JT：构思与设计、资金支持、行政支持、数据分析与解释、手稿撰写及手稿最终批准。
通讯作者
通讯作者：菊池 哲弘或高桥 淳。
伦理声明
伦理批准和参与同意
本研究已获日本京都大学伦理委员会批准，项目名称为"脑皮层损伤小鼠和大鼠的神经元细胞移植"(批准号：19-114-5)，批准日期为2021年2月24日。
用作iPSCs来源的外周血单核细胞是从龙沙公司购买的。作者确认已获得人细胞收集的初始伦理批准，并且供体已提供知情同意。
出版同意
不适用。
竞争利益
J.T.获得Sumitomo Pharma Co., Ltd.的协作研究资助。其他作者声明无竞争利益。
临床试验编号
不适用。
【全文结束】
