摘要
骨缺损是全球数百万人面临的主要临床问题，治疗面临供体部位并发症、免疫排斥和有限整合等挑战。外泌体是内源性分泌的细胞外囊泡，具有作为无细胞疗法的潜力。源自间充质基质细胞（MSCs）、骨髓细胞和其他细胞的外泌体传递骨形态发生蛋白、生长因子和免疫调节微小RNA，启动成骨通路。这些外泌体刺激并协调血管化和骨形成。工程化策略如载荷优化、表面功能化和细胞预处理进一步增强了治疗前景。外泌体疗法的临床转化在制造标准化和监管路径方面仍面临障碍。
亮点
- 外泌体传递成骨蛋白（BMP-2、RUNX2）、促血管生成因子（VEGF、FGF-2）和免疫调节分子（miR-21、TGF-β），实现全面的骨愈合。
- 表面功能化、基因修饰和载荷优化技术提高了外泌体靶向特异性和治疗效果。
- 水凝胶-陶瓷复合材料、静电纺纳米纤维和3D打印支架提供可控的外泌体释放和骨再生所需的机械支持。
- 无细胞外泌体疗法降低了免疫原性，消除了与细胞疗法相关的风险，包括肿瘤形成和血管阻塞。
背景
骨缺损影响全球数百万人。在骨再生过程中，人体必须协调多个过程，形成新骨、生长血管并管理免疫反应。现有治疗方法虽然有效，但存在明显劣势。多种方法如腓骨瓣、自体骨移植、同种异体移植、干细胞疗法和牵张成骨术已用于治疗骨缺损。然而，这些技术的障碍包括复杂的外科技术、替代来源有限、潜在感染、肿瘤形成和伦理问题。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的骨再生疗法，包括脱矿骨基质（DBM）和重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2，商品名Infuse®），已被证明在临床上有效。rhBMP-2的临床应用因其高成本和安全问题受到限制，包括异位骨形成、炎症反应，以及某些报告中可能增加的癌症风险。脱矿骨基质（DBM）也存在重要缺陷：其质量可能在批次间存在差异，临床结果往往不一致，且存在疾病传播的残余风险。
相比之下，外泌体疗法提供了一种无细胞替代方案，与干细胞移植相比，免疫排斥和肿瘤形成风险更低。外泌体在生理平衡的比例下自然携带广泛的成骨、促血管生成和免疫调节分子。生物工程的进步使外泌体的大规模修改和生产成为可能，进一步降低了与重组生长因子疗法相比的成本并提高了安全性。
外泌体治疗方法在不同器官系统中显示出高再生潜力，在心肌梗死后的心血管修复、中风和脊髓损伤的神经再生、肝组织再生、急性肾损伤后的肾脏恢复以及糖尿病溃疡的加速伤口愈合中已有成功的临床前和临床应用记录。在骨再生的特定背景下，通过分析2013年至2025年PubMed数据库中结合"外泌体"和"骨再生"术语的出版物，可以看出研究兴趣呈指数级增长（图1）。最近六年（2019-2025年）的出版物占总数的92%。这一快速增长趋势和外泌体在骨再生中的高潜力表明，临床证据和转化路径方面存在显著差距，需要进行审查和分析。
国际细胞与基因治疗学会（ISCT）现在建议使用"间充质基质细胞（MSCs）"一词，而不是"间充质干细胞"。这一术语变化在再生医学中尤为重要，因为它突出了MSCs多样化的免疫调节特性。这些特性包括调节巨噬细胞极化（M1/M2）、平衡Th1/Th2和Th17/Treg等T细胞亚群，以及促进有助于软骨修复和软骨下骨重塑的抗炎微环境。
据我们所知，本综述首次整合了外泌体生物学、工程策略、递送平台和骨再生的临床转化路径。它为理解外泌体疗法在骨骼组织工程中的潜力提供了清晰的框架。本文综述并分析了外泌体的生物学、工程和装载策略、先进递送系统、临床前证据及其在骨组织再生中临床转化的挑战。
综述
外泌体提取和生产
外泌体是细胞释放到环境中的微小囊泡（30-150纳米）（图2）。它们在细胞内称为多泡体的特殊隔室内形成，多泡体与细胞膜融合后释放它们。这一过程不同于直接从细胞表面出芽的微囊泡。对于治疗用途，外泌体通过差速超速离心、尺寸排阻色谱或切向流过滤等方法收集。三种主要的基于尺寸的外泌体分离方法各有优缺点。差速超速离心因其简单和相对便宜而最常用，但它速度慢、效率较低，不适合大规模使用。尺寸排阻色谱在保持外泌体天然结构和功能方面更好，但速度慢且只能处理有限体积。超滤更快且产量更高，但膜污染和囊泡损失等问题可能导致结果不一致。为克服这些障碍，杂交方法如切向流过滤（TFF）与尺寸排阻色谱（SEC）的整合提高了成本效益和产量。微流体平台，包括级联脉冲过滤，更具前景，因为它们可以在30分钟内从血液中分离出纯化的外泌体。总体而言，这些发展表明正转向更集成和基于微流体的方法，可能超越传统技术的限制。
来源细胞类型至关重要：骨髓MSCs倾向于产生具有强成骨潜力的外泌体，而脂肪来源的MSCs产生的外泌体具有更好的免疫调节效果。这使得为骨再生疗法选择合适的来源变得重要。如表1所示，骨髓MSC来源的外泌体表现出更强的再生潜力，而脂肪组织MSC来源的外泌体更多与免疫调节功能相关。外泌体识别和表征应遵循更新的MISEV2023指南，这些指南为EV命名法、分离和表征提供全面标准。这些建议包括检测规范标记物如CD9、CD63和CD81，以及确认不存在细胞污染物，包括钙网蛋白、GM130和细胞色素c。
分子载荷和治疗机制
外泌体载荷分类包括三个功能类别，如图3所示：维持骨形成的成骨蛋白、促进血管化的促血管生成因子以及创造有利愈合环境的免疫调节分子。鞘磷脂使膜更刚性，而胆固醇保持其柔韧性并控制通过的物质，帮助囊泡在循环和与靶细胞相互作用期间保持完整。溶血磷脂酸（LPA）支持成骨细胞的生长和成熟，鞘氨醇-1-磷酸（S1P）促进骨形成同时减少骨分解。富含胆固醇的膜区域改善细胞摄取并在压力下保护外泌体。成骨微小RNA，如miR-22-3p和miR-196a，增强分化和矿化，而阻断miR-182-5p促进骨形成。外泌体脂质如神经酰胺和胆固醇在囊泡生物发生、膜稳定性和摄取中起结构作用。
长非编码RNA（lncRNAs）（大于200个核苷酸）通过改变基因表达模式和作为miRNA的分子海绵等机制发挥作用。它们可能通过外泌体帮助转移到细胞中，以确定基因表达模式。MALAT1是一种在外泌体中发现的长非编码RNA，含有干细胞，通过与抑制骨细胞生长的miR-143竞争来诱导骨形成。在类似情况下，HOTTIP通过Wnt通路诱导骨细胞增殖，MEG3调节涉及骨去除的过程。骨再生领域中另一种调节性外泌体分子是环状RNA（circRNAs）。circRNA_0001105通过吸收miR-143-3p来阻止其对骨基因的抑制，从而诱导骨形成。circRNA_0000437通过VEGF通路辅助血管形成。
外泌体发挥作用的一个关键方式是将受体细胞转变为成骨细胞。它们通过携带转录因子、信号分子和调节RNA来实现这一点。此外，外泌体可以诱导表观遗传修饰，导致成骨基因网络的持续激活。
先进递送系统
水凝胶
水凝胶是骨再生中外泌体递送的良好材料，因为它们是富含水的三维结构，与骨的天然细胞外基质（ECM）非常相似。水凝胶的机械强度有限，在新骨形成阶段无法提供伤口稳定性。由于伤口稳定性对新骨形成至关重要，水凝胶-陶瓷复合系统已成为首选方法（表2）。
陶瓷和复合支架
羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP）等陶瓷支架具有成骨传导结构支持和有利于细胞整合和外泌体保留的可控孔隙率。将陶瓷与水凝胶或其他聚合物结合，将陶瓷的机械强度与水凝胶的可控释放特性融合在一起（图4）。pH响应材料利用骨重塑部位的酸性环境来触发靶向释放。温度响应聚（N-异丙基丙烯酰胺）允许在体温下凝胶化的可注射递送。静电纺纳米纤维可以在核心-壳结构中包封外泌体，而3D打印梯度支架可实现外泌体的精确空间定位。
纳米纤维和静电纺材料系统
静电纺纳米纤维系统具有大表面积、可调节的纤维尺寸和排列以及能够模拟天然组织结构的优点。
将外泌体整合到纳米纤维系统中的三种主要策略包括后制造表面结合、混合静电纺丝和同轴静电纺丝。后制造表面结合在纤维制成后将外泌体附着到纤维上，减少了它们暴露于破坏性加工条件的机会。然而，这种方法可能导致较弱的附着和更快的释放。在混合静电纺丝中，外泌体直接混合到聚合物溶液中，然后进行纤维形成。同轴静电纺丝使用双针系统。这种方法还可以生产具有多个隔室的纤维，以容纳具有不同释放速度的不同治疗剂。聚合物核心可以作为缓慢稳定外泌体释放的储库，而外壳可以被修饰以促进细胞附着、生长或分化。纤维的表面化学控制外泌体如何结合、装载和释放，通过静电吸引或配体特异性结合等过程。纤维的直径和曲率影响外泌体附着，纤维排列影响细胞和外泌体如何相互作用。可生物降解聚合物允许与骨愈合阶段一致的定时释放。
三维生物打印应用
3D生物打印允许在模块化支架结构中控制外泌体的空间分布。生物打印装载外泌体的材料与活细胞生成平台，将细胞疗法和无细胞外泌体递送协同整合。高分辨率打印技术如双光子聚合可以构建亚微米尺寸的支架，以严格控制外泌体装载和递送。
增强功效的工程策略
工程策略使用表面修饰、生产细胞的基因工程、仿生表面工程、载荷优化、细胞预处理和合成生物学方法。
化学修饰通过共价键将靶向分子连接到外泌体表面蛋白上，使用已建立的偶联方法。这些程序基于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯反应，准备靶向分子上的羧基和外泌体表面蛋白上的伯胺基之间的稳定酰胺键，使用非常高效和选择性环加成反应化学准备坚固连接的点击化学策略，以及基于马来酰亚胺官能团和半胱氨酸残基或其他含硫醇分子之间的反应性的马来酰亚胺-硫醇偶联程序。
亲和素-生物素系统特别受欢迎，因为它们允许在外泌体分离后模块化添加各种靶向分子，而无需对细胞进行基因重新工程。脂质插入是一种更简单的方法，其中外泌体与含有靶向基团的修饰脂质一起孵育。可以通过优化和选择最合适的孵育和锚定序列条件来定制插入效率。
骨靶向表面修饰是提高骨骼应用中药物递送系统治疗性能的高级方法。过去广泛研究了几类骨靶向剂，包括双膦酸盐、四环素衍生物和具有选择性骨骼定位机制的骨靶向肽（图5）。
通过将含氮双膦酸盐阿仑膦酸盐与外泌体表面结合是这种靶向方式的一个例子，因为它对结合骨矿化表面具有很大偏好。与未经靶向的递送系统相比，阿仑膦酸盐结合增加了骨靶向，从而在骨质疏松的实验模型中获得更好的治疗效果，具有更高的生物利用度和减少的全身暴露程度。
这种增加靶向的潜在机制是通过双膦酸盐部分螯合骨基质中的钙离子，形成在骨骼位置不会迅速被清除的稳定复合物。
生产细胞的基因修饰可以在外泌体形成过程中添加靶向分子和治疗载荷。CRISPR、病毒载体和转染等方法增强蛋白质或miRNA含量和细胞弹性。
细胞膜包覆通过防止免疫清除来增强外泌体靶向并延长系统循环，提高在靶部位的积累。
天然外泌体受限于其载荷容量和装载效率。
外泌体可以通过基因或化学方法设计为专门到达骨组织。例如，骨髓干细胞特异性适配体可以引导外泌体进入骨髓，双膦酸盐可以帮助它们结合骨中的羟基磷灰石，脂质连接肽可以引导它们到达靶细胞。治疗分子可以通过电穿孔、超声处理、挤压、孵育或皂苷辅助装载等方法装载到外泌体中（图6）。
电穿孔对核酸和水溶性药物有效，尽管它可能导致聚集，这可以通过使用海藻糖缓冲液减少。超声处理和挤压可以通过暂时打开膜并让其再次闭合以实现缓慢释放来装载蛋白质和小分子。孵育适用于脂溶性分子，但通常给出较低且不太一致的结果。装载的成功取决于载荷类型、所选方法和实验条件。
细胞预处理方法包括环境修饰、药物处理和基因改善，共同提高外泌体产量、治疗载荷含量和生物活性。低氧预处理（1-5% O₂持续24-72小时）通过上调VEGF、HIF-1α和促血管生成miRNA增强外泌体的促血管生成潜力。通过循环应变、剪切应力或振动的机械刺激增加外泌体中的BMP-2、RUNX2和成骨miRNA。三维培养系统，如球体、类器官和生物材料支架，可以通过增加细胞-细胞接触和引导自然细胞分化来提高外泌体质量。添加生长因子或代谢调节剂可以进一步增强载荷含量。锂氯化物和丙戊酸等药物刺激成骨信号并帮助装载治疗因子，而BMP-2或VEGF补充增加促骨和促血管载荷。地塞米松或抗TNF-α等抗炎剂改善外泌体的免疫调节特性，而二甲双胍或雷帕霉素等代谢调节剂支持细胞健康，延长寿命并增加外泌体产量（图7）。
外泌体工程中的机制和免疫学问题
天然外泌体具有低免疫原性，但对其工程化可能会改变其行为。这些修饰可能会破坏其分子网络，产生可能触发免疫反应的新抗原，或改变其生物分布模式。工程化外泌体也可能以不同方式通过身体移动，以新方式被细胞吸收，或在天然外泌体通常不会积累的组织中积累。工程化外泌体的免疫学问题已有具体证据记录。与天然囊泡相比，电穿孔修饰的外泌体表现出改变的表面蛋白谱，可能触发补体激活和增强巨噬细胞摄取。电穿孔修改的装载程序创建了暂时的膜孔，可能会永久改变囊泡表面特性，而基于超声处理的方法可能导致膜损伤和颗粒聚集。生产细胞的基因修饰带来额外风险，因为病毒载体介导的工程可能会引入可能触发宿主免疫反应的外来遗传元素。
为减轻这些风险，已开发出几种基于证据的策略。通过剂量递增研究对修饰参数的系统优化可以建立在保持治疗效果的同时的最大可耐受修饰比例。全面的临床前安全评估协议应包括补体激活测定、细胞因子分析和长期生物分布研究。替代方法，如使用孵育技术的温和装载方法，可能比电穿孔减少膜损伤。
当前研究的一个主要限制是缺乏对工程化外泌体的系统毒理学评估。CRISPR编辑和病毒载体修饰等基因工程方法引发插入突变的风险。临床前研究报道了可能导致异常基因表达或恶性转化的整合事件。CRISPR修饰的生产细胞需要基因组分析以检测可能影响外泌体载荷的脱靶改变，而基于病毒载体的修饰需要评估整合模式和复制能力。重复给药后的免疫原性研究不足，尽管有证据表明频繁给予基于囊泡的产品可能刺激补体激活和适应性免疫记忆，可能随着时间推移降低治疗效果。脱靶生物分布进一步使安全评估复杂化，因为外泌体往往在肝脏、脾脏和肺部积累，增加了意外组织反应的可能性。解决这些差距将需要在大型动物模型中进行系统的剂量递增和长期安全研究，将生物分布成像和免疫监测纳入临床前协议，以及为基于细胞外囊泡的治疗制定标准化的毒理学测试指南。建立标准化的毒理学协议，包括剂量-反应研究、安全范围和验证的监测测定，对于监管批准和安全临床转化至关重要。
临床前证据和动物模型
临床前研究表明，基于外泌体的疗法可以增加骨形成和血管生长。然而，分离方法、储存和结果评估的差异使得研究之间的结果难以比较。大多数随访期仅为8至12周，这对于评估长期安全性来说太短。啮齿动物的愈合方式与人类不同。使用年轻和健康的动物降低了临床相关性，因为它不能反映真实患者的复杂状况，包括其他疾病、药物和生活方式因素。这些限制表明需要标准化的临床前协议和大型动物研究。啮齿动物颅骨缺损模型通常被使用，因为它们成本效益高且易于处理。然而，它们的颅骨骨结构和密度与人类有很大不同。啮齿动物颅骨更薄、愈合更快，并且缺乏人类颅骨中存在的板障结构，这限制了它们的转化价值。犬、羊和猪颅骨缺损等大型动物模型在密度、厚度和重塑行为方面更接近人类颅骨。这些相似性允许更准确地评估移植物整合、血管化和生物力学稳定性。此外，大型动物模型允许评估与临床相关的缺损大小和愈合时间线，更好地反映人类骨再生。因此，未来的临床前研究应越来越多地纳入大型动物颅骨缺损模型，以弥合小型动物实验与人类临床应用之间的差距，从而加强基于外泌体的骨再生疗法的转化路径。
工程化外泌体带来了额外的安全问题，在短期动物研究中难以评估。天然外泌体具有低免疫原性，但修饰可以改变其特性，触发免疫反应或损害其膜。基因工程可能导致炎症、自身免疫反应或异常组织形成。这些问题可能在几个月或几年后出现，在8至12周的研究中仍未被发现。重复剂量的影响以及修饰的遗传物质进入宿主细胞DNA的可能性也未得到充分研究，使得在临床使用前需要更长的安全评估（表3；图8）。
与替代方法的比较分析
MSCs携带包括肿瘤形成、同种异体设置中的免疫排斥以及静脉给药时血管阻塞在内的风险。相比之下，外泌体疗法免疫原性较低，且缺乏与细胞聚集体相关的血管输送并发症。
重组生长因子疗法，最著名的是BMP-2和PDGF，是加速骨再生的标准临床方法，FDA已批准用于某些应用，如脊柱融合和骨折修复。外泌体转移的生长因子具有生理平衡的浓度区间，通过屏蔽递送和长期释放增强生物活性，副作用比重组蛋白疗法少。骨再生的基因疗法通常使用病毒载体、脂质体转染或电穿孔将BMP-2或VEGF等基因直接递送到靶细胞。相比之下，基于外泌体的递送通过自然细胞途径携带治疗性mRNA和miRNA，有助于减少与病毒载体和永久性基因修饰相关的安全风险。
临床转化
差速超速离心（dUC）仍然是分离外泌体最常用的方法。然而，它有一些缺点，包括回收率低、脂蛋白污染和可能的囊泡聚集。外泌体研究中的标准化挑战已通过最近的MISEV2023指南部分解决，这些指南提供了有关EV命名法、分离方法和表征协议的最新建议，以确保不同实验室和临床环境中的可重复性。尺寸排阻色谱（SEC）可以通过基于尺寸将它们与蛋白质分离来产生更纯净的外泌体制备物，提供比超速离心更高的特异性，同时保持其结构和活性。切向流过滤（TFF）是一种可扩展的方法，可以连续处理大量体积，对外泌体造成最小损伤。外泌体识别包括检测特定标记物（CD9、CD63和CD81）和不存在钙网蛋白、GM130或细胞色素c等细胞污染物。使用纳米颗粒追踪分析（NTA）测量其大小和浓度。通过透射电子显微镜（TEM）检查形态，使用动态光散射（DLS）检查尺寸均匀性。纯度通过颗粒-蛋白质比率评估，每微克蛋白质超过1×10¹⁰颗粒的值被认为质量高。安全测试包括测量内毒素水平，静脉使用应低于每公斤体重5 EU，以及按照药典标准进行无菌检查。在美国，FDA将所有外泌体监管为生物产品。在欧洲，未广泛修改的外泌体被视为生物药物，与美国系统类似。然而，如果它们被高度修饰，EMA可能将其分类为先进治疗医药产品（ATMPs），并因此要求更严格的批准程序。解决这些监管挑战需要实施特定的操作框架。良好生产规范合规需要具有验证的分离和表征程序的受控细胞培养环境。质量控制框架必须纳入用于标记物检测、污染评估和形态评估的标准化方法。无菌协议应遵循药典标准，进行适当的内毒素测试。标准化需要建立关于量化方法的共识，强调颗粒计数和蛋白质含量而不是基于质量的测量。监管协调需要一致的分类框架，区分最小操作和广泛修改的产品。
经济因素可能成为外泌体基骨再生临床转化的重要障碍。大规模生产可能需要大量投资于GMP设施和专门的纯化系统，使成本可能高于标准药物。超速离心和SEC等分离方法通常需要熟练员工和昂贵设备。储存可能会增加额外费用，因为外泌体通常需要冷冻保护剂、低温冷冻机和冷链分配系统。为了提高经济可行性，应调查几种方法：开发更有效的分离方法，建立集中制造以实现规模经济，实施自动化工作流程以降低劳动力成本，以及开发稳定配方以减少储存复杂性。将外泌体疗法与rhBMP-2等已建立的治疗方法进行比较的经济分析对于证明商业可行性和医疗系统采用至关重要。
在PubMed、Scopus、Web of Science和ClinicalTrials.gov中使用"外泌体"、"细胞外囊泡"、"骨再生"、"骨修复"、"骨增强"和"临床试验"等术语进行搜索，覆盖截至2025年8月14日的出版物，发现没有关于基于外泌体的骨再生的人体临床试验报告。这突显了对标准化协议的迫切需求，由MISEV2023框架指导，以确保可重复性和监管合规。缺乏临床试验反映了几个障碍。制造标准化仍然是主要挑战，因为当前的分离方法缺乏可扩展性和可重复性，批次间变异性影响一致的剂量。监管不确定性仍然是一个主要障碍。外泌体根据是否最小修改或广泛工程化而被不同分类。这创造了不可预测的批准路径并增加了研究成本。经济障碍也起作用，因为符合GMP的生产设施和漫长的监管过程需要大量投资，而对天然衍生囊泡的知识产权保护仍然有限。为克服这些挑战，需要国际协作以建立标准化协议和共享参考材料，而监管科学倡议应提供关于外泌体分类和批准路线的更明确指导。剂量标准化是外泌体研究中的关键挑战，因为研究通常使用不一致的报告单位，阻碍了比较分析。当前文献在测量方法上表现出变异性，包括蛋白质含量、颗粒数量和外泌体总重量，这些方法之间没有建立相关性。这种不一致性在表3中呈现的临床前研究中很明显，不同研究小组使用不同的指标和浓度报告剂量。缺乏标准化的效力测定加剧了这一挑战，因为治疗活性可能取决于超出简单蛋白质或颗粒定量的多种因素。解决这一标准化差距需要开发纳入定量测量和与治疗应用相关的功能评估的共识报告标准。
未来展望
器官芯片技术提供了更接近人类骨环境的微工程平台，比2D培养或动物模型更接近。最近的骨芯片系统甚至复制了骨质疏松和健康骨生态位，允许科学家在受控环境中检查成骨。将外泌体整合到这些模型中可以更精确地评估其再生能力和安全性，从而促进个性化骨再生疗法的发展。未来的研究重点必须包括对装载技术（如电穿孔和超声处理）后膜完整性的长期稳定性研究，因为当前文献缺乏关于延长稳定性概况的综合数据。
结论
外泌体可以通过诱导新骨生长、改善血液供应和平衡免疫反应来帮助骨再生。在将它们用于患者之前，我们需要更好的方法来大规模生产它们。未来的研究应集中在使它们更有效、降低成本和进行强有力的临床试验上。如果采取这些步骤，外泌体可能成为修复受损骨骼的安全先进选择。
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