摘要
肿瘤微环境中的细胞间通信对治疗结果有重大影响。特别是高度侵袭性癌症，如胶质母细胞瘤，通过开发对治疗的抵抗力或渗透周围组织以逃避放射治疗而从有效的细胞通信中受益。隧道纳米管(TNTs)等微小膜隧道可作为肿瘤细胞的有效通信工具。通过这些结构，细胞可以构建一个大型网络，使它们能够尽快对环境做出反应并适应，从而对抗治疗。在本研究中，我们调查了化疗药物对U87 MG细胞中TNT网络的影响，以确定它们是否影响TNT的数量，进而影响可能的治疗结果。药物对TNT稳定性的影响可能与其对肌动蛋白和微管蛋白的作用有关，这些是膜结构的已知稳定剂。因此，我们还分析了U87 MG细胞中TNT的细胞骨架含量，并研究了肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B(CytoB)对TNT形成和网络的影响。本研究中，CytoB减少了TNT的数量，表明肌动蛋白作为细胞骨架成分，对于开发TNT网络是必需的。相比之下，化疗药物替莫唑胺(TMZ)和阿糖胞苷(AraC)不影响TNT和肌动蛋白含量。由于TNT网络与某些肿瘤的治疗抵抗性增加密切相关，我们认为目前胶质母细胞瘤治疗中缺乏对TNT的抑制是一个主要问题，应成为未来进一步研究的目标。
背景
隧道纳米管(TNTs)是直径在纳米范围内的微小膜连接，连接远距离的细胞。这些细长的连接（长度可超过100 μm）是细胞间直接快速传递信息或货物的有效通信工具。它们最早在2004年在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中被描述。自发现以来，它们已在多种细胞系中被发现，包括2D细胞培养和组织中的癌细胞和正常细胞。研究表明，TNTs可以运输多种类型的货物，包括钙信号、死亡信号、细胞器、病毒等。TNT研究显示，这些膜隧道在不同细胞类型中表现出显著的形态和功能多样性。然而，由于它们在促进细胞间快速交换方面的优势特性，从而确保细胞对其环境的良好适应性，TNTs被认为在癌症治疗中起着至关重要的作用。特别是在具有高度异质性的癌症中，不同细胞亚克隆的相互作用和合作可以通过创建耐药微环境而导致治疗失败。研究表明，TNTs可以形成大型耐药网络，并转移促进治疗抵抗的货物，如线粒体、p-糖蛋白或miRNAs。另一方面，几份报告表明，纳米颗粒也可以通过TNTs转移，因此也可以考虑将TNTs用作药物递送系统。TNTs可能为癌症治疗提供新思路，特别是对于胶质母细胞瘤等非常侵袭性的癌症，其中对新治疗方法的需求很高。
胶质母细胞瘤是最常见和最恶性的脑肿瘤，中位生存期少于15个月。这种癌症的侵袭性是由于其高度异质性、大基因组改变、对周围健康组织的高浸润率以及对治疗产生抵抗力的强能力所致。胶质母细胞瘤的标准治疗首先是尽可能手术切除肿瘤组织，然后进行放疗和同时使用替莫唑胺(TMZ)进行化疗。胶质母细胞瘤的特征是其浸润性生长模式进入周围健康脑组织，这使得完全手术切除具有挑战性。在放疗过程中，健康组织区域内的浸润性肿瘤细胞可能接受亚最佳辐射剂量，使它们能够存活并继续生长。因此，化疗代表了一种重要的补充治疗方式，有可能更全面地靶向分散的肿瘤细胞。对于胶质母细胞瘤的化疗，通常使用烷化剂如TMZ。然而，肿瘤经常在原发肿瘤附近复发，且对治疗的抵抗力增强。单个细胞之间的相互作用，特别是TNTs实现的有效细胞通信，可能导致对治疗产生抵抗力的问题。
TNTs可能是理想的治疗靶点这一假设在文献中被广泛讨论。然而，到目前为止，关于TNTs的知识非常有限。它们在不同细胞类型中的巨大多样性使得更难确定这些膜结构的关键点。因此，它们与癌症的关系及其对新治疗途径的前景在很大程度上仍然未知。为了更清楚地了解TNTs的作用，有必要了解通过TNTs的通信如何受到不同治疗情况的影响，例如不同类型的辐射或使用不同的化疗药物。
本研究调查了化疗药物对U87 MG胶质母细胞瘤细胞系中通过TNTs的细胞通信的影响。我们使用了胶质母细胞瘤治疗中常用的药物TMZ，并选择阿糖胞苷(AraC)作为第二种化疗药物来分析其对通过TNTs的细胞通信的影响，原因有二。首先，据报道，AraC在1 μM浓度下孵育24小时后可抑制白血病细胞中的TNTs，其次，AraC也在胶质母细胞瘤治疗的背景下进行研究，因为这种化疗药物也能穿过血脑屏障。两种选择的化疗药物都会破坏DNA复制。TMZ导致DNA甲基化，而AraC充当错误的DNA构建块。我们还使用了细胞松弛素B(CytoB)来调查TNTs是否可以在U87 MG细胞中被抑制，并检查肌动蛋白在TNTs中的作用。CytoB是一种肌动蛋白聚合抑制剂，CytoB对TNT的抑制已在许多其他细胞系中得到证实，因此它的使用除了活细胞显微镜图像外，还允许对TNTs中肌动蛋白的作用得出结论。此外，我们对TNTs的细胞骨架进行了活细胞共聚焦显微镜检查，以检查微管蛋白和/或肌动蛋白是否存在于TNTs中。我们更喜欢活细胞成像，因为细胞固定会导致许多TNT断裂，从而扭曲TNT网络，如先前研究所示。
结果
TNTs的细胞骨架含量
我们进行了活细胞显微镜检查，以检查U87 MG细胞中TNTs的细胞骨架含量。为此，我们同时标记了细胞的质膜、微管蛋白和肌动蛋白，如方法部分所述。在三个独立实验中，总共分析了85个TNTs的细胞骨架含量。
显微镜图像显示，肌动蛋白和微管蛋白信号并不总是在微小的TNTs中可见。图1(a)显示了示例性共聚焦图像，揭示了U87 MG细胞TNTs中肌动蛋白和微管蛋白的片段化存在。肌动蛋白在(58±8；平均值±标准差)%的TNTs中可检测到，而微管蛋白在(24±10)%的TNTs中可检测到。含有微管蛋白的TNTs数量显著较少(双样本t检验(N=3):P=0.01)。分析显示，所有含有微管蛋白的TNTs也含有肌动蛋白。因此，(24±10)%的TNTs同时含有两种细胞骨架成分，而(34±12)%的TNTs仅含有肌动蛋白。TNTs中的细胞骨架含量与位于细胞内部的其余细胞骨架相比要低得多；因此，需要图像处理如对比度增强，才能使TNTs中的细胞骨架含量可见。TNTs中荧光的减少表明，与细胞内部相比，TNTs中细胞骨架成分的存在减少。细胞骨架含量的信号强度在不同TNTs之间以及沿着TNTs的长度上有所变化。在分析中，如果在TNTs的任何位置都能检测到信号，则将TNT视为肌动蛋白或微管蛋白阳性。
CytoB对TNT网络的影响
在我们的研究中，我们分析了CytoB对U87 MG细胞TNT网络的影响。我们使用CellMask™橙色质膜染色剂标记U87 MG细胞，然后将药物以0.05 μM、0.5 μM和5 μM的浓度加入，并获取共聚焦活细胞视频。
CytoB导致TNT连接减少，因为连接细胞的数量以及每个细胞的连接数量随着CytoB的加入而减少。这种效应在CytoB浓度越高时越强。该效应在1小时的最早时间点就存在，表明网络破坏的快速机制。在最高浓度下，1小时后仅有(29±9)%的细胞连接，与对照样品(58±16)%相比，显著减少了两倍(双样本t检验；P=0.0120)。在对照样品中，连接细胞的百分比增加到(74±10)%。相比之下，在所有处理样品中，网络无法恢复。10小时后，与对照组相比，所有添加的CytoB浓度均显示出显著减少(双样本t检验；0.05 μM: P=0.0396；0.5 μM: P=0.0015；5 μM: P<0.001)。
此外，我们还通过确定高度连接细胞的数量和复杂连接的比例来评估TNT网络的复杂性。CytoB处理导致高度连接细胞数量显著减少(双样本t检验；P=0.0061)，在最早时间点(对照:(25±11)%，5 μM:(3±4)%)。与对照相比，使用0.5 μM和5 μM处理的样品无法增加高度连接细胞的数量。0.05 μM样品显示出轻微恢复。此外，两种较高浓度在后期时间点倾向于抑制复杂连接。可以得出结论，CytoB在浓度高达0.5 μM时降低了TNT网络的复杂性。这种效应随着CytoB浓度的升高而增强。在最低浓度下，可以看到立即效应，该效应在后期时间点至少部分逆转。
TMZ和AraC对TNT网络的影响
在证明某些药物可以持续改变网络后，我们想知道某些化疗药物是否可能产生类似效果。我们选择了TMZ作为胶质母细胞瘤治疗的标准护理药物，以及AraC作为有前景的新药物，该药物已在其他癌细胞系中用于修改TNT网络。使用TMZ浓度为1 μM、10 μM和100 μM，AraC浓度为0.1 μM、1 μM、10 μM和100 μM。
AraC和TMZ不影响U87 MG细胞中的TNT网络。根据重复测量的双向方差分析，无论是在连接细胞的数量还是在每个细胞的连接数量方面，均未观察到显著差异。在成像开始时，连接细胞的比例在(40±12)%到(67.0±2.1)%之间变化，与化疗处理无关，在AraC处理中变异性更高。10小时后，所有测量条件下，这一比例增加到70%至83%。在10小时时间点，连接细胞的比例已达到平台期，在评估长达24小时的样品中没有可见变化（对照和AraC 100 μM）。连接每个细胞的分析显示了相同的趋势。
此外，对于任一药物在任何浓度下，均未发现网络复杂性的明显改变。对于AraC，在3小时的10 μM处理和10小时的100 μM处理中，复杂连接比例的时间过程中可见两个峰值。根据双样本t检验，这些峰值与对照组显著不同(P=0.0418和P=0.0194)。然而，重复测量的双向方差分析显示，对于TMZ或AraC处理，在复杂连接比例或高度连接细胞数量方面均无显著差异。
讨论
本研究的首要目标是阐明体外U87 MG细胞之间TNT连接的细胞骨架含量。我们发现肌动蛋白比微管蛋白更常见，但两种蛋白质仅在一部分TNTs中以低浓度存在。我们怀疑浓度太低，信号可能会消失在背景中，几乎无法测量。结合其小直径和大长度，这表明TNTs是脆弱的膜结构，细胞质含量低。在本研究中，我们还测试了CytoB是否减少胶质母细胞瘤细胞中的TNTs数量，这已在几种其他细胞类型中报道，并且通常用于抑制TNTs。我们的结果显示，U87 MG胶质母细胞瘤细胞中的TNTs也被CytoB抑制，所有浓度在治疗的第一小时内即出现抑制，且0.5 μM和5 μM浓度具有可持续的效果。浓度越高，效果越强。因此，我们的结果与其他关于TNTs的报道一致，表明肌动蛋白对这些膜结构很重要。
肌动蛋白聚合抑制剂如CytoB对TNTs的抑制表明，肌动蛋白在TNT形成、稳定性或沿TNTs的可能运输机制中起着重要作用，这已在不同细胞类型中的许多研究中进行了调查。然而，需要进一步研究以更深入了解肌动蛋白或其他细胞骨架成分在胶质母细胞瘤TNTs中的作用。负责运输各种货物的微管蛋白的作用，尤其需要在胶质母细胞瘤细胞中进行探索。
我们相信CytoB不适合作为TNT抑制剂用于进一步研究TNTs的功能，因为它对细胞骨架有强烈影响，这对于细胞形态、迁移和增殖无疑是必要的，因为CytoB也用作微核技术中的细胞分裂阻滞剂。因此，单独使用CytoB会强烈影响细胞行为，这可能导致关于通过TNTs的细胞通信的错误结论。因此，在胶质母细胞瘤的进一步TNT研究中仍然缺乏TNT抑制剂。
此外，我们还认识到TNT网络表现出大的自然波动。图3、4和5中的大误差条（标准差）表明单个测量变化很大。我们想强调的是，对照曲线（黑线）是十一次独立测量的结果，这些测量是为了更好地表征TNT网络中的基线波动。即使在这里，标准差也很大，并且不显著低于进行三次独立实验的其他测量。因此，我们假设TNT网络自然高度可变。这种高自然变异性可能会掩盖小效应。尽管如此，CytoB处理导致的TNT网络减少是显而易见的，因此有可能测量TNT网络中的此类影响。
本研究的第二个主要目标是调查化疗药物对胶质母细胞瘤细胞中TNT网络的影响。我们的结果显示，化疗药物TMZ和AraC不影响U87 MG细胞中的TNT网络。TMZ通常使用，AraC也在胶质母细胞瘤治疗中进行研究。两种药物都可以克服血脑屏障，这是胶质母细胞瘤治疗的主要标准。TMZ和AraC都会破坏肿瘤细胞中的DNA复制，从而阻断DNA修复和细胞分裂。AraC通常用于治疗急性髓系白血病(AML)。TNTs也涉嫌在AML治疗中促进化疗耐药，因此也在该疾病的背景下进行研究。研究发现，AraC减少了原发性AML细胞和AML细胞系中TNTs的数量。这些结果表明，使用AraC治疗AML也有效地抑制了肿瘤细胞的细胞通信，表明AraC作为治疗AML的化疗药物很有前景。本研究的结果表明，AraC似乎不能有效抑制U87 MG细胞中TNT网络的形成。
我们的结果还显示，TMZ（胶质母细胞瘤治疗中最常用的化疗药物）不影响U87 MG胶质母细胞瘤细胞中的TNTs。Valdebenito及其同事的一项研究甚至表明TMZ增强了较大尺寸的膜连接形成。然而，他们的分析是在比本研究更低的放大倍数下进行的，可能捕获了明显大于TNTs的其他膜结构。尽管如此，目前尚不清楚膜连接（如上皮桥、微管或TNTs）如何相互关联，这些都涉及胶质母细胞瘤细胞中的细胞通信。因此，我们可以得出结论，TMZ似乎不会阻止通过微管或TNTs的膜隧道中的细胞通信。这可能导致治疗抵抗和预后不良。
我们认为，这些结果表明，当前胶质母细胞瘤治疗中，TMZ未能沿TNTs等膜结构下调细胞通信可能是主要问题之一。然而，这一假设需要通过进一步研究TNTs等膜结构在癌症进展中通过细胞通信的实际作用来证明。胶质母细胞瘤细胞中的TNTs是在细胞相互远离时形成的。此外，TNTs经常在细胞的迁移前沿被发现。因此，细胞迁移和通过TNTs的细胞通信似乎是相关的，因此TNTs可能促进细胞侵袭性。为了证明这一假设，需要进一步的TNTs活细胞研究。
此外，我们的发现揭示了不同细胞类型中TNTs的多样性。AraC减少了AML细胞中TNTs的数量，但我们没有看到AraC对U87 MG细胞中TNT网络的影响。这表明我们需要意识到，关于一种细胞类型中TNTs的发现不一定适用于其他细胞类型中的TNTs。AraC对U87 MG细胞中TNTs缺乏抑制的潜在解释可能是AML细胞和胶质母细胞瘤细胞之间观察到的TNT形成类型不同。TNTs在AML细胞中通过丝状伪足生长形成，而在胶质母细胞瘤细胞中则通过细胞运动形成。这些观察表明，TNT形成的潜在机制可能在AML和胶质母细胞瘤细胞之间有所不同。
治疗组和对照组之间每个视野的细胞数量没有显著差异。对照组中的细胞数量随时间略有增加（从1小时后的40±11个细胞到24小时后的62±17个细胞），而处理组中的细胞数量几乎保持不变，表明细胞毒性效应。这表明观察到的缺乏效应并非由于细胞脱落导致的细胞数量减少而人为造成。此外，我们使用了广泛的浓度范围，并且在整个实验过程中药物都存在于培养基中。因此，缺乏观察到的效应可能并非由于使用了不适当的药物浓度或暴露时间。
当然，本研究并非没有局限性。首先，它使用单一细胞系，不能充分代表胶质母细胞瘤的异质性。然而，本研究的主要目标是提供关于TNT介导的细胞通信的基本机制见解，而不是直接调查临床相关性。需要进一步研究来验证本研究的发现，包括使用更能反映胶质母细胞瘤异质性的患者来源的胶质母细胞瘤细胞进行实验。
结论
总之，本研究表明，化疗药物TMZ和AraC不会抑制U87 MG胶质母细胞瘤细胞中的TNT网络。我们假设，目前使用的化疗药物对胶质母细胞瘤细胞（如U87 MG细胞）中通过TNTs的细胞通信的一致抑制缺乏可能导致治疗抵抗。尽管我们的结果表明AraC和TMZ对TNT形成没有显著影响，但仅凭这一发现不足以确认TNT介导的细胞间交换是肿瘤细胞存活和抵抗治疗的机制。需要额外的实验来证实这一假设。例如，将未经处理的细胞与经化疗药物处理的细胞共培养，或进行涉及TNT相关基因的遗传敲除的功能实验，可以证明TNTs如何促进化疗抵抗。这将强调研究可能直接靶向TNTs的治疗策略的重要性。
此外，我们的结果显示，肌动蛋白聚合抑制剂CytoB减少了U87 MG胶质母细胞瘤细胞中TNTs的数量。因此，我们可以得出结论，肌动蛋白聚合对胶质母细胞瘤细胞中的TNTs至关重要。然而，CytoB强烈影响细胞的细胞骨架，因此对细胞行为和外观有重大影响。因此，我们建议CytoB不适合用于进一步的TNT研究。我们相信TNTs在肿瘤微环境中细胞相互作用中起着至关重要的作用。然而，TNTs在癌症进展中的参与仍然未知。需要进一步研究来确定TNT介导的细胞通信的临床相关性，特别是通过研究增强的TNT网络与患者预后、治疗抵抗或其他临床有意义的结果之间的相关性。通过更多地了解这些似乎不受当前化疗药物影响的膜结构，我们可能会找到新的治疗方法，并防止胶质母细胞瘤治疗中治疗抵抗的发展。
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