摘要
神经系统损伤是现代神经学和神经外科领域尚未解决的重要问题，迫切需要寻找刺激神经保护和再生的新方法。我们此前已证明人骨髓间充质基质细胞（MSCs）分泌组在脑出血模型中能刺激大鼠存活、减轻神经功能缺损并减少脑损伤体积。该技术的主要缺点是需要将分泌组浓缩5-10倍才能达到可观的药理活性，这提高了生产成本并延缓临床转化。本研究构建了多种基因改造MSC培养物，包括永生化MSCs、BDNF和uPA过表达MSCs以及VHL表达受抑制的MSCs，并评估其分泌组在脑出血模型中的药理活性。结果表明，永生化MSCs分泌组的神经保护活性与原代MSCs相当，但仍需10倍浓缩。而同时过表达BDNF和uPA并抑制VHL的MSCs分泌组无需浓缩即可显著减少脑损伤体积。单独过表达BDNF/uPA或抑制VHL的分泌组则无此效果甚至产生毒性作用，这可能源于基因改造MSCs分泌组中各生长因子比例失衡，例如血脑屏障通透性增加或神经元凋亡。研究证实基因改造MSCs分泌组可增强或改变治疗活性，这为生物药物开发提供了新途径。
关键词：骨髓间充质基质细胞；分泌组；基因改造细胞培养物；人端粒酶逆转录酶（hTERT）；脑源性神经营养因子（BDNF）；尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）；Von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（VHL）；脑出血（ICH）
1. 引言
寻找刺激神经组织再生的方法是神经药理学和再生生物医学的核心未解难题[1-3]。我们此前发现人MSCs分泌组（含多种生长因子、细胞因子、基质蛋白和细胞外囊泡）在脑出血模型中可促进大鼠存活、减轻神经功能缺损并减少脑损伤体积[4]。MSCs分泌组的显著缺点包括生产细胞寿命短（MSCs在培养中传代次数有限）、供体间特性差异[5-8]，以及需要5-10倍浓缩才能达到药理活性[4,9]。克服这些限制的可能途径是通过基因改造MSCs以延长细胞寿命、稳定分泌组成分或增加关键活性成分（如生长因子、miRNA等）含量。
hTERT在MSCs中的过表达可延迟细胞衰老，将其活性使用时间延长至38-45次群体倍增（25-30代），且不会改变分泌组组成和生物学活性，还能防止衰老相关分泌表型（SASP）出现至30次倍增[10-12]。但永生化MSCs（iMSCs）分泌组是否可替代原代MSCs（pMSCs）用于脑出血后神经保护尚属未知。验证iMSC分泌组药理活性是本研究目标之一。
为提高MSC分泌组的生物活性，本研究采用两种策略：（1）通过基因递送直接表达BDNF和uPA；（2）通过抑制VHL增强HIF-1a稳定性来促进内源性促血管生成因子产生。选择BDNF和uPA作为靶点，是因为BDNF是刺激神经元存活和再生的主要神经营养因子[13,14]，而uPA具有促进血管生成、轴突生长等多重作用[15,16]，且我们此前证明BDNF和uPA在脑出血模型中具有协同神经保护作用[17]。
VHL是HIF蛋白家族的负调控因子，抑制VHL可导致HIF-1a稳定和VEGF、促红细胞生成素等促血管生成因子表达增加[20-23]。已有研究表明肿瘤细胞中VHL抑制可通过HIF分子组成型激活增强促血管生成因子表达[24-26]，其中部分因子具有明确神经保护活性[27,28]。我们推测诱导多种生理比例互补的生长因子可能比直接过表达单一重要因子更具优势。本研究旨在评估提高MSC分泌组药理特性的策略在脑出血模型中的神经保护效果。
2. 结果
2.1 基因改造iMSCs可提高其分泌组生长因子含量
为提高iMSCs分泌组中BDNF、uPA等促神经保护因子的含量，我们构建了多种遗传修饰载体。通过直接基因递送过表达BDNF和uPA，通过shRNA介导的VHL抑制提高HIF-1a稳定性和促血管生成因子表达（图1）。此前研究显示未基因改造的iMSCs分泌组含0.73±0.16 ng/mL BDNF、1.65±0.29 ng/mL uPA、0.66±0.19 ng/mL VEGF和2.93±0.57 ng/mL HGF（n=3）[10]。
在评估基因改造MSCs分泌组生长因子含量前，需要确定四环素/多西环素诱导系统产生重组蛋白/RNA的最佳浓度。多西环素浓度梯度（0、20、80、200、500 ng/mL）诱导显示，80-500 ng/mL浓度时BDNF和uPA产量达到平台期。200 ng/mL多西环素处理时，BDNF含量从0.74±0.14 ng/mL提升22倍至16.22±4.07 ng/mL，uPA含量提高2倍至4.26±0.78 ng/mL（p<0.05；n=3；单因素方差分析）[29]。
比较组成型和诱导型表达系统的效率发现，诱导型BDNF和uPA表达量显著高于组成型（图3A，表1）：诱导型BDNF分泌组含19.3±4.2 ng/mL，而组成型含4.9±1.3 ng/mL（p<0.005；n=3；t检验）；诱导型uPA为4.9±0.98 ng/mL，高于组成型的3.3±0.83 ng/mL（p<0.05；n=3；单因素方差分析）。
抑制VHL的shRNA表达系统中，诱导型表达的shRNA水平比组成型高2.9-5.3倍（p<0.05；n=3；单因素方差分析），但VEGF和HGF表达仅轻度增加（1.2-1.3倍）。有趣的是，基因改造iMSCs的增殖速率显著下降，组成型表达组尤甚，这限制了其实际应用的可能性。
2.2 iMSC和pMSC分泌组在脑出血模型中具有等效神经保护作用
10倍浓缩的iMSC分泌组（iMSC10x）在脑出血模型中的神经保护效果与pMSCs分泌组相当[4,9]。iMSC组实验动物在14天实验期间存活率达100%，而对照组（注射10倍浓缩DMEM-LG培养基）10天时存活率为83%（6只中5只存活），17%大鼠出现轻度神经功能缺损。iMSC10x组平均脑损伤体积为134（66；161）mm³，显著低于pMSC组的121（78；147）mm³和对照组的188（159；256）mm³（p<0.05；n≥6；秩和检验Dunn校正）。
2.3 BDNF/uPA过表达联合VHL抑制增强iMSC分泌组神经保护作用
hTERT过表达虽延长iMSCs寿命并稳定分泌组组成，但像pMSCs分泌组一样仍需10倍浓缩才能产生明显神经保护作用。为增强分泌组的神经保护活性，我们构建了多种基因改造MSC系。在未浓缩状态下，iMSCs共表达BDNF+uPA（cBU）和抗VHL shRNA（cSh）1:1混合分泌组（含3.25±0.45 ng/mL BDNF、2.28±0.40 ng/mL uPA、0.59±0.15 ng/mL VEGF和2.61±0.31 ng/mL HGF）显示最显著效果：存活率提升至100%（5只中5只），脑损伤体积减至104（86；125）mm³，而对照组存活率为80%（5只中4只），平均脑损伤体积为187（151；226）mm³。未浓缩的iMSC分泌组虽提升存活率但未影响损伤灶体积（165（153；213）mm³）[表1]。
同时过表达BDNF+uPA并抑制VHL的iMSCs分泌组（iBU+iSh组合）表现出相似神经保护效果（存活率100%，存活大鼠损伤体积108（99.3；174）mm³）。但单独使用BDNF+uPA过表达或抗VHL shRNA的分泌组则效果不显著甚至有毒性。单独诱导表达BDNF+uPA的iMSCs分泌组（含19.32±4.2 ng/mL BDNF、4.94±0.99 ng/mL uPA、0.65±0.19 ng/mL VEGF和2.67±0.59 ng/mL HGF）反而降低存活率至60%（5只中3只存活），损伤灶体积增加至232（210；238）mm³。组织学分析证实上述MRI结果（图5）。
3. 讨论
人MSCs是组织再生和修复过程的强效刺激因子，其分泌组具有作为生物药物平台的潜力[34,35]。但原代MSCs（pMSCs）作为分泌组来源存在供体短缺、细胞衰老快、分泌组组成异质性以及生物安全性控制等缺点[33]。现有研究显示永生化MSCs（iMSCs）分泌组具备进入临床应用前景[33,36,37]。iMSCs可克服上述局限且其分泌组组成稳定性已得到验证[10]，但永生化MSCs分泌组是否保留神经保护能力尚未明确。
hTERT过表达将MSCs培养时间从8-20代延长至至少30代[10]。iMSCs和pMSCs分泌组经10倍浓缩后，在脑出血模型中单次注射即可刺激实验动物存活并减少脑损伤体积。这使iMSCs成为生物制药领域有潜力的分泌组来源，特别是随着细胞治疗和无细胞疗法应用领域的快速扩展[33,38,39]。
浓缩MSCs分泌组存在成分比例改变、生产成本增加等缺点[40,41]。本研究通过基因改造iMSCs增强促再生活性因子表达，包括BDNF、uPA（已证明具有神经保护活性）和促血管生成因子。我们此前发现BDNF是MSCs分泌组神经保护特性的主要决定因子[42]，本研究进一步发现联合使用BDNF、uPA和抗VHL shRNA可产生协同效应。
抑制VHL表达虽显著降低VHL mRNA水平（组成型和诱导型shRNA表达组分别下降2.9和5.3倍），但促血管生成因子（VEGF、HGF、uPA）仅轻度升高（30%和23%），未达毒性水平。值得注意的是，抗VHL shRNA、BDNF和uPA的mRNA在分泌组中被检测到，这提示MSCs分泌组可能结合重组蛋白治疗和基因治疗的优势，提供再生过程的复合刺激[49]。
不同基因改造MSCs分泌组在脑出血模型中显示从神经保护到毒性广泛不等。BDNF和uPA浓度升高反而未减少脑损伤体积，这与BDNF在MSCs分泌组中关键作用相矛盾[42-45]，可能与剂量、给药途径、BDNF表达动态以及分泌组中其他因子的调节作用有关。BDNF以pro-BDNF和成熟BDNF混合形式分泌，过量或pro-BDNF主导可能激活促凋亡和神经炎症信号通路[13,14,50-52]。高剂量BDNF/uPA的毒性作用机制需进一步研究，可能涉及神经炎症、血脑屏障功能障碍或过量生长因子的直接毒性。
抗VHL shRNA表达的iMSCs分泌组未显示显著神经保护或毒性作用。已知VEGF可增加血脑屏障通透性导致脑水肿，但在本研究中VEGF浓度未达毒性水平。有趣的是，BDNF+uPA过表达联合抗VHL shRNA的分泌组（cBU+cSh和iBU+iSh组合）显示神经保护效应增强趋势，表现为神经功能缺损严重程度降低。机制可能涉及促血管生成因子增加血脑屏障通透性促进BDNF/uPA递送至损伤部位，或改变pro-apoptotic p75NTR-ceramide和神经保护TrkB-PI3K/Akt信号通路平衡[55-57]。具体机制需通过抑制剂、转录组或信号通路分析进一步验证。
本研究再次证实MSCs分泌组包含协同和拮抗活性分子，其治疗效果由分子间相互作用及与受体细胞分子的交互决定。MSCs分泌组作为再生生物医学药物开发平台，可通过永生化或基因改造实现组成标准化[33,36,37]。基因改造iMSCs分泌组可能显示从促进再生到毒性的显著差异，这要求对每个修饰后分泌组特性进行细致评估。
4. 材料与方法
4.1 细胞培养
原代人MSCs（pMSCs）取自莫斯科大学生物库，培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。永生化MSCs（iMSCs）为实验室此前构建的hTERT永生化细胞系[10]。MSCs鉴定标准包括表达CD73、CD90、CD105，缺乏造血/内皮标记（CD14、CD19、CD20、CD34、CD45、HLA-DR），能向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化，符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准[58,59]。
4.2 动物
3-3.5月龄雄性Wistar大鼠（280-340克）用于评估分泌组的神经保护活性。动物来自俄罗斯科学院生物有机化学研究所实验动物中心，实验遵循欧盟2010/63/EU指令和莫斯科大学生物伦理委员会批准（批准号#3.4和#3.5）。
4.3 载体构建
使用Lenti载体构建传递载体：Lenti-Ef1a-shRNA、Lenti-tetO-shRNA、Lenti-Ef1a-BDNF-IRES-uPA和Lenti-tetO-BDNF-IRES-uPA。使用双shRNA序列抑制VHL基因活性，其表达受组成型（Ef1a）和诱导型（tetO）启动子调控。遗传构建FUdeltaGW-rtTA编码多西环素转录激活因子，由Konrad Hochedlinger博士惠赠[33]。
4.4 基因改造MSCs
慢病毒颗粒在2%FBS培养基中组装并转导第7-8代iMSCs。转导时细胞接种于6孔板（汇合度30-40%），添加含慢病毒颗粒（MOI~20）和鱼精蛋白（50 μg/mL）的1.2-1.5 mL培养基。CO2培养箱孵育1.5-2小时后更换新鲜培养基，重复转导4次。通过与LVPBFP载体共转导（比例4:1）验证转导效率，4周后BFP通道荧光超过80%[61,62]。
4.5 分泌组制备
按既定方法[63]制备MSC分泌组：将第5-7代pMSCs、13-15代iMSCs或12-14代基因改造iMSCs用Hanks溶液洗涤后，在含GlutaMAX™、丙酮酸钠和100 U/mL青链霉素的DMEM低糖培养基中培养7天。多西环素浓度梯度（0、20、80、200、500 ng/mL）测试显示200 ng/mL为最佳诱导浓度。
4.6 酶联免疫吸附测定
使用Human Free BDNF Quantikine ELISA试剂盒等检测MSCs分泌组中BDNF、uPA、VEGF和HGF浓度，操作按厂商说明书进行。
4.7 逆转录和qPCR
采用Direct-zol RNA Miniprep kit提取总RNA，经大肠杆菌poly(A)聚合酶处理后进行cDNA合成，使用MMLV RT试剂盒，以Oligo(dT)15引物进行逆转录。qPCR使用5X qPCRmix-HS SYBR试剂盒，引物序列和扩增参数见补充表S1[60]。
4.8 脑出血模型
采用A.N. Makarenko等[64]建立的脑出血模型：用2%齐考诺麻醉剂（1 mL/kg）麻醉大鼠后固定于立体定位仪，颅骨钻孔（前囟后2.0 mm、矢状缝旁3.5 mm），缓慢注射20 μL舌下静脉自体血至内囊。术后伤口撒头孢曲松粉末并缝合。造模后1小时经尾静脉注射100 μL神经保护制剂。排除24小时内死亡大鼠。实验分组包括阴性对照（DMEM-LG培养基）、阳性对照（未浓缩iMSC分泌组，iMSC1x）和实验组（未浓缩的基因改造iMSCs分泌组），每组5只大鼠[4,9]。
4.9 动物存活与神经功能评估
术后14天内每天记录存活率，于术后3天和10天采用改良McGraw神经功能评分系统评估神经状态。健康动物无神经功能缺损迹象，嗜睡、肢体无力等为轻度受影响，肢体瘫痪、协调障碍或昏迷为严重受影响[66,67]。
4.10 磁共振成像
造模后14天使用7T临床扫描系统进行MRI检测，参数设置如下：冠状面TR=5220 ms、TE=53 ms、回声持续时间=9、分辨率230×320、视野32×40 mm、切片厚0.5 mm、间距0.75 mm；横断面TR=4000 ms、TE=40 ms、回声持续时间=9、分辨率288×320、视野40×40 mm、切片厚0.5 mm、间距0.6 mm。脑损伤体积计算公式：损伤体积（mm³）=Σ[损伤面积（mm²）]×（切片厚+切片间距）[33]。
4.11 脑组织病理学
术后14天用CO2气体麻醉处死大鼠，取出脑组织用4%多聚甲醛固定并石蜡包埋，切片后行苏木精-伊红染色。
4.12 统计学分析
使用SigmaPlot11.0软件进行统计分析。正态分布数据采用学生t检验或方差分析（Newman-Keuls和Sidak-Holm校正），非正态分布数据采用秩和检验（Dunn校正）。数据以均数±标准差或中位数（25%；75%）表示，p<0.05为差异显著。
5. 结论
MSCs分泌组包含具有协同和拮抗活性的分子，其治疗效果由分子间相互作用及与受体细胞分子的交互决定。MSCs分泌组是再生生物医学药物开发的有前景平台，通过永生化或基因改造可实现分泌组组成标准化。永生化MSCs分泌组是原代MSCs的有前景且商业可行替代方案。基因改造MSCs分泌组可能从促进再生到诱导毒性均有显著差异，这需要针对每个修饰后的分泌组进行仔细评估。
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