摘要
肠型是将患者肠道微生物分为三种类型的分类方法，这些类型在心血管疾病的特征上有所不同。我们假设患者的肠型会因其动脉粥样硬化风险因素、中风亚型和中风严重程度而异。本研究前瞻性地收集了100名缺血性中风患者（平均年龄：73.4岁，38名女性）的粪便样本。患者的资料从其医疗记录中获取。对从每个粪便样本中提取的16S rRNA基因（V3-V4区域）进行了系统发育分析。使用新一代测序仪对肠道中各细菌属的存在进行了定量分析。在提取出各肠道微生物属的数量后，将拟杆菌属（Bacteroides）比例≥30%的患者归类为I型，普雷沃菌属（Prevotella）比例≥15%的患者归类为II型，其余归类为III型。我们分析了患者的肠型与其特征（即动脉粥样硬化风险因素、中风亚型和中风严重程度）之间的关联。33名患者为I型，10名为II型，57名为III型，无重叠。I型和II型患者血脂异常的患病率低于III型患者（P = 0.028），入院时美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分较低（P = 0.025），出院时改良Rankin量表（mRS）评分有降低趋势（P = 0.094）。肠型可能影响缺血性中风的风险因素和严重程度。
肠道微生物群由于宏基因组学的最新发展，越来越被认为是各种疾病的主要原因。动脉粥样硬化与饮食密切相关。因此，长期以来，肠道微生物群一直被认为在动脉粥样硬化进展中起着至关重要的作用。
在肠道微生物群中，拟杆菌属（Bacteroides）因其在粪便中频繁出现而受到大量研究关注。有报道称，在西方国家，拟杆菌属与高脂饮食相关。一项研究报告称，粪便样本中拟杆菌属水平较高的人饮食中蛋白质和脂肪含量较高。另一项研究表明，摄入富含动物脂肪饮食数天的人中，拟杆菌属、Alistipes属和Bilophila属的数量增加。然而，有报道称，身体质量指数较高的人拟杆菌属比例低于身体质量指数较低的人。
相比之下，东亚的一些研究人员认为拟杆菌属可能对动脉粥样硬化有不利影响的观点持不同意见。一项日本研究表明，与健康受试者相比，2型糖尿病患者的拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度降低，而厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的丰度增加。一项中国研究表明，有症状的动脉粥样硬化缺血性中风和短暂性脑缺血发作患者的拟杆菌属和普雷沃菌属丰度降低。
Arumugam等人提出，人类肠道微生物群可分为三种肠型，这有助于识别人群及其疾病的特征。山下等人发现，使用这种分类方法，冠心病患者的拟杆菌属比例较低（< 30%）。这项研究表明了肠型分类的实用性。
尽管已有几项研究报告了缺血性中风患者的肠道微生物群，但关于肠型与中风患者动脉粥样硬化之间关联的报告很少，特别是关于拟杆菌属的关联。因此，本研究旨在确定肠型与中风特征（尤其是动脉粥样硬化进展）之间的关联。
方法
我们在2021年10月至2022年12月期间前瞻性地注册了100名因缺血性中风住院治疗的患者（73.4 ± 11.3岁；62名男性，38名女性）。所有患者均在缺血性中风发生后7天内入住我们的神经中心。当患者出现快速发作的局灶性脑功能障碍时，我们诊断其为缺血性中风。我们通过弥散加权成像确认了这些发现，并进行了颈动脉超声检查以评估颈动脉狭窄。已获得所有患者的知情同意。我们检查了患者的医疗记录，以确定中风风险因素，如年龄、性别、中风亚型、高血压、糖尿病、高脂血症、心房颤动、当前吸烟和饮酒习惯，以及既往中风和癌症史。我们还评估了他们的医疗数据，以收集有关中风亚型和出院结果的信息。中风亚型使用TOAST标准进行分类。此外，SVO_LAA被定义为小血管闭塞（SVO）或大动脉粥样硬化（LAA），因为这些是与动脉粥样硬化相关的中风亚型。我们还记录了美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分（表示中风神经严重程度的标准量表）和改良Rankin量表（mRS）（表示中风结果）。出院时的结果通过mRS进行评估；0-1分被认为是良好的，因为患者病情不严重。本研究已获得福冈大学医院伦理委员会（IRB编号：H20-08-008）的批准。我们遵循STROBE观察性队列指南。所有方法均按照相关指南和法规进行。
我们从所有患者的颈动脉超声检查中提取数据。我们收集了每侧颈总动脉的最大内膜-中膜厚度，并计算了它们的平均值（颈总动脉最大内膜-中膜厚度的平均值），以及任一侧颈动脉分叉处是否存在斑块和≥50%的狭窄。动脉粥样硬化斑块被定义为内膜-中膜厚度≥1.1mm的病变。
肠道微生物测量
使用含有保存液的刷式粪便收集套件（TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd., 静冈，日本）获取并稳定维持粪便中的微生物群，并在冰箱中保存长达3周。然后将套件送至Bioengineering Lab. Co., Ltd.（相模原，日本）使用珠磨法从粪便液体中提取和分析DNA，并进行16S rRNA基因测序。DNA提取物用作模板，使用引物对341F/805R通过两步尾部聚合酶链反应方法扩增每个16S rRNA基因的V3-V4区域。使用Fragment Analyzer（Advanced Analytical Technologies）评估文库的质量和浓度。在Illumina MiSeq平台（Illumina Inc., 圣地亚哥，美国）上对聚合酶链反应扩增子进行2×300碱基对的双端测序。
16S rRNA测序和分析
使用QIIME 2（版本2020.8）处理测序数据，使用DADA2插件进行去噪、嵌合体去除和扩增子序列变体（ASV）推断。使用feature-classifier插件和Greengenes（版本13_8）97%操作分类单元（OUT）参考数据库进行分类学分类，该数据库仅用于分类学分配，不进行OTU聚类。
统计分析
将患者分为三组：拟杆菌属比例≥30%的患者（肠型I组）；普雷沃菌属比例≥15%的患者（肠型II组）；以及不属于肠型I或II的其他属的患者（肠型III组）。
在三组之间对患者特征的差异进行统计分析。我们还分析了三组之间患者中风亚型、SVO_LAA和TOAST分类的差异。如果患者的特征在三组之间存在显著差异，则还进行了年龄和性别调整分析。使用逻辑回归模型进行年龄和性别调整。所有P < 0.05的值被认为具有显著差异，而P < 0.1的任何变量被视为有显著趋势。
数据可用性
所有数据均使用SPSS v28.0软件（IBM Corp., 阿蒙克，美国）进行分析。
结果
肠型I组有33名患者，肠型II组有10名患者，肠型III组有57名患者。被归类为I组和II组的患者之间没有重叠。从中风发作到收集粪便样本的中位时间为3天。NIHSS评分中位数为2（补充表1）。高血压、糖尿病、高脂血症、心房颤动以及吸烟和饮酒习惯的百分比分别为80%、38%、47%、24%、22%和24%。关于中风亚型，SVO、LAA和心源性栓塞性中风的百分比分别为17%、33%和22%，而其他中风病因和未确定原因的百分比为28%。关于患者的肠道微生物群，拟杆菌属和普雷沃菌属的平均百分比分别为24.7% ± 11.2%和4.0% ± 8.9%。
表1显示了三组患者的背景和动脉粥样硬化风险。三组肠型之间的高脂血症频率存在显著差异（P = 0.028）。肠型II组的糖尿病患病率似乎低于其他组，但无显著差异。肠型III组入院时的NIHSS评分显著高于其他组（P = 0.025）。肠型III组出院时的改良Rankin量表评分似乎比其他组更差（P = 0.094）。通过颈动脉超声评估的动脉粥样硬化变化程度在三组中相似。
表1 根据肠型划分的患者特征。
年龄和性别调整分析如表2所示。以肠型III组为参考，肠型II组糖尿病的比值比较低，但无显著差异。然而，肠型I组和II组高脂血症的比值比显著低于肠型III组。肠型II组入院时NIHSS评分的比值比显著低于肠型I组，而肠型I组的比值比也较低。肠型II组出院时改良Rankin量表评分的比值比也显著低于肠型I组。
表2 年龄和性别调整分析。
在肠型III组的微生物中，厚壁菌门中毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的比率增加（表3）。
表3 肠型III组的主要肠道微生物。
讨论
在本研究中，我们将中风患者分为三种肠型，并检查了它们与动脉粥样硬化风险因素、中风亚型和中风严重程度的关联。本研究表明，肠型与高脂血症频率和中风严重程度显著相关。
肥胖患者中拟杆菌属的丰度降低。然而，一项研究表明，更遵循地中海饮食的人拟杆菌属和普雷沃菌属可能增加。地中海饮食的特点是更健康的饮食，纤维、蔬菜和水果摄入量更高，糖和红肉摄入量更低。这些发现表明，特征和对人类身体的影响可能因地区和文化而异。本研究中使用的分类与日本的分类相同，表明在本研究中识别动脉粥样硬化的实用性。因此，在日本，拟杆菌属可能在预防动脉粥样硬化方面发挥有益作用。
在本研究中，肠型III组中毛螺菌科和瘤胃球菌属的比率增加。据报道，瘤胃球菌属的增加与糖尿病相关。相比之下，毛螺菌科据报告是由非肉类餐食增加引起的，并与丁酸相关。日本糖尿病患者的肠道菌群中厚壁菌门的丰度增加，这与西方国家肠道微生物群的分布不同。目前尚无关于毛螺菌科或瘤胃球菌属在高血压（被认为是脑梗死的最大风险）中作用的报告。需要进一步研究以确定肠型III对脑梗死的作用。
拟杆菌属和普雷沃菌属对预防动脉粥样硬化的精确机制尚不清楚。然而，据报道，日本糖尿病患者的粪便样本中普雷沃菌属的丰度显著低于对照组，而乳酸杆菌属的丰度较高。在本研究中，普雷沃菌属的比例似乎随着糖尿病和高脂血症的存在而降低。拟杆菌属被发现对葡萄糖代谢具有有益作用，并且在2型糖尿病患者中丰度较低。另一份报告表明，拟杆菌属丰度较低以及厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加与心血管疾病的发病率相关。拟杆菌属和普雷沃菌属可能有助于预防动脉粥样硬化。因此，需要进一步研究以确定肠型在血管壁炎症进展和抑制中的作用。
肠道微生物群的组成可能非常多样，健康肠道微生物群没有明确的定义。血管壁的炎症可能导致动脉粥样硬化的进展。因此，阐明是否可以通过调节肠道微生物群（如增加拟杆菌属或普雷沃菌属）来抑制动脉粥样硬化的进展是必要的。
本研究有几个局限性。首先，本研究的患者数量较少。其次，本研究分析了肠型，但未涉及每个物种，这可能是一个局限性，因为肠道微生物群的功能可能因物种而异。第三，本研究未收集患者的饮食数据，这可能是一个局限性。第四，不能确定拟杆菌属和普雷沃菌属的增加是否有助于动脉粥样硬化的进展，因为横断面研究不能表明因果关系。此外，我们参考了山下等人的论文方法。虽然我们和他们的研究都涉及患有动脉粥样硬化疾病的患者，但β多样性测量是肠型分类肠道微生物群的流行方法。
总之，肠型可能影响缺血性中风的风险因素和严重程度。拟杆菌属和普雷沃菌属丰度的增加可能在预防动脉粥样硬化方面发挥有益作用。
数据可用性
当前研究中生成和分析的数据集未公开提供，因为其发布将违反日本政府的《个人信息保护法》，但可根据合理要求从通讯作者处获取。
缩写
NIHSS：美国国立卫生研究院卒中量表
TOAST：急性中风治疗Org 10172试验
SVO：小血管闭塞
LAA：大动脉粥样硬化
致谢
我们要感谢Edanz的Ellen Knapp博士编辑了本手稿的草稿。
资金支持
这项工作部分得到了Taiju Life Social Welfare Foundation和日本促进科学学会（KAKENHI，资助编号：20K10544、5H04773、18K1971、22K19660和19K10654）的支持。
作者信息
作者和所属机构
- 日本福冈福冈大学医学院神经病学系
Toshiyasu Ogata, Miki Kawazoe & Yasuhiko Baba
- 日本福冈福冈大学医学院预防医学与公共卫生系
Hisatomi Arima & Miki Kawazoe
贡献
T.O.起草了手稿，为研究的设计和概念做出了贡献，获取了数据并获得了资金。H.A和M.K进行了统计分析并获得了资金。Y.B.监督了研究。
通讯作者
通讯作者：Toshiyasu Ogata。
伦理声明
竞争利益
作者声明不存在竞争利益。
附加信息
出版商说明
Springer Nature对于已发表地图和机构隶属关系中的管辖权声明保持中立。
补充信息
以下是电子补充材料的链接。
补充材料1
【全文结束】
